prebiotic trong các sản phẩm sữa

prebiotic

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PREBIOTIC 3

1.1.Khái niệm prebiotic 3

1.1.1.Định nghĩa 3

1.1.2.Tiêu chuẩn đánh giá 3

1.1.3.Các loại prebiotic 4

1.1.4.Đặc tính hóa học của prebiotic 5

1.2.Ảnh hưởng của prebiotic đến hệ tiêu hóa 5

1.3.Những tính chất có lợi của prebiotic 7

1.3.1.Tính chất có lợi của prebiotic đối với công nghệ thực phẩm 7

1.3.2.Tác dụng của prebiotic đối với sức khỏe con người 8

1.4.Phương pháp sản xuất prebiotic 9

CHƯƠNG 2: CÁC PREBIOTIC ĐƯỢC BỔ SUNG TRONG CÁC SẢN PHẨM SỮA 11

2.1.Galactooligosaccharide (GOS) 11

2.1.1.Giới thiệu về GOS 11

2.1.2.Kỹ thuật sản xuất GOS 11

2.1.2.1.Emzyme tổng hợp GOS 12

2.1.2.2.Quy trình sản xuất GOS 16

2.1.3.Các đặc tính công nghệ của GOS 17

2.2.Fuructooligosaccharide (FOS) 18

2.2.1.Giới thiệu về FOS 18

2.2.2.Kỹ thuật sản xuất FOS 20

2.2.2.1.Phương pháp chiết tách và thủy phân 20

2.2.2.2.Phương pháp tổng hợp (fructosyl hóa) 21

2.2.3.Các đặc tính công nghệ của FOS 22

2.3.Bổ sung FOS, GOS trong các sản phẩm sữa 23

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT SẢN PHẨM SỮA CHỨA GOS 25

3.1.Nghiên cứu sản xuất sữa tươi giàu GOS và ít lactose [8] 25

3.2.Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm phô mai giàu GOS và ít lactose [23] 26

3.2.1.Sản xuất phô mai cottage giàu GOS và ít lactose 26

3.2.2.Phô mai cream giàu GOS và ít lactose 28

3.2.3.Các quá trình của một quy trình sản xuất phô mai giàu GOS và ít lactose 31

KẾT LUẬN 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

TIẾNG VIỆT 35

INTERNET 35

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi điều kiện sống của con người ngày càng được nâng cao thì nhucầu sử dụng thực phẩm tốt cho sức khỏe ngày càng tăng và đang từng bước chuyểndần từ loại có chứa các chất dinh dưỡng cho cơ thể cũng như tác dụng ngăn ngừa haychữa bệnh

Một trong những xu hướng thực phẩm hướng tới trong tương lai là những thựcphẩm chức năng, sữa mang lại nhiều lợi ích cho con người, mang bản chất tự nhiên làchính, kích thích sự phát triển của chính cơ thể người sử dụng, đặc biệt là hệ vi sinhvật có ích cho cơ thể chính người sử dụng

Hệ tiêu hóa của chúng ta chứa thường trực trên 400 loại vi khuẩn khác nhau vớitổng số trên 100 000 tỉ vi khuẩn Đây là những vi khuẩn có ích cho cơ thể Chúng tạothành hệ vi sinh đường ruột Đây là những vi khuẩn đồng minh của cơ thể chúng ta,chúng đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của mỗi người

Từ những nghiên cứu về lợi ích của những vi khuẩn lên men trong thực phẩmnhư sữa, sữa chua đối với sức khỏe con người, dòng sản phẩm bổ sung vi khuẩn sốnghay cơ chất cho khuẩn sống prebiotic ra đời, chúng là những chất bột đường glucidekhông tiêu hóa được và vẫn còn nguyên vẹn khi vào đến ruột già (colon) Prebioticđược đánh giá là có nhiều tác dụng bổ dưỡng cho người tiêu dùng ở mọi lứa tuổi vàmột số người bị bệnh đường tiêu hóa… chúng kích thích sự hoạt động của probiotics

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PREBIOTIC

1.1 Khái niệm prebiotic

1.1.1 Định nghĩa

Prebiotic là thành phần thực phẩm không tiêu hóa được, có ảnh hưởng tíchcực tới cơ thể vật chủ bằng cách kích thích có chọn lọc lên sự phát triển và tăngcường hoạt động của một số loài vi sinh vật có lợi trong ruột và nâng cao sức khỏecủa cơ thể (vật chủ) [9] Oligosaccharides trong sữa mẹ được xem như là prebiotic vì

nó hỗ trợ sự phát triển của vi khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli trong ruột già của

những trẻ bú mẹ hoàn toàn [12] Các prebiotic thường được sử dụng là FOS,GOS vàInulin Người ta thường kết hợp probiotic với prebiotic (được gọi là synbiotic) đểtăng tác dụng có ích của probiotic đối với cơ thể

1.1.2 Tiêu chuẩn đánh giá

Dựa theo định nghĩa của prebiotic, một thành phần thực phẩm được xem làmột prebiotic phải hội đủ 3 yếu tố sau [4]:

 Tính kháng tiêu hóa: Prebiotic phải chịu được quá trình tiêu hóa trước khi

đến tới ruột già Khi đó, các đặc tính cấu trúc và hóa học của nó hầu như không thayđổi và chúng có thể tồn tại trong ruột già trong một khoảng thời gian nhất định để tạo

ra những biến đổi có ích [7, 11]

 Khả năng lên men: Prebiotic phải là cơ chất cho vi khuẩn trong ruột già lên men Để xác định khả năng lên men, người ta tiến hành các thí nghiệm in vitro nuôi

cấy theo mẻ vi sinh vật có trong phân, mô phỏng các điều kiện nhiệt độ và pH của

một vùng nào đó trong ruột già Ngoài ra, người ta có thể tiến hành thí nghiệm in vitro ở mức phức tạp hơn Đó là phương pháp nuôi cấy liên tục vi sinh vật có trong

phân, mô phỏng sự dịch chuyển các chất trong ruột già cũng như điều kiện dinhdưỡng và pH trong đó Cuối cùng, các nghiên cứu trên người cần phải được tiến hành

để đánh giá lại kết quả in vitro.

 Tính chọn lọc: Một prebiotic là một cơ chất có tính chọn lọc đối với một

hay một số loài vi khuẩn nhất định có trong ruột già Prebiotic kích thích sự phát triểnvà/hoặc hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có lợi tron đường ruột của vật chủ[ 11] Điều này có nghĩa là prebiotic không được lên men bởi vi khuẩn trong miệng,

bởi các vi khuẩn có hại trong đường ruột nhưng được lên men tốt bởi vi khuẩn cólợi

Trong ba tiêu chuẩn đánh giá ở trên, tính chọn lọc là tiêu chuẩn quan trọngnhất và khó đánh giá nhất [11]

Polysaccharide Inulin, tinh bột bền

Bảng 1.2 Phân loại prebiotic theo nguyên liệu sản xuất[4, 11, 17]

Tinh bột Isomaltooligosaccharide (IMO)

Gentio-oligosaccharides

Guα1→(6Gu)n, n=1 – 4Guβ1→(6Gu)n

Sucrose

FructooligosaccharidesGlucooligosaccharidesRaffinose

Starchyose

Frβ2→(1Fu)n,n=2 – 5Guα1→6Gu

Gaα1→6Guα1↔2βFr(Gaα1)2→6Guα1↔2βFrGaβ1→4Fr

Chitin/chitosan-oligosaccharides Pectic-oligosaccharides

Xyβ1→(4Xy)n-(3Ga1β1→4AhGa1α1)n-Maβ1→(4Ma)n

*Gu: glucose, Ga: galactose, Fr: Fructose, Xy: Xylose, Ma: Mannose

1.1.4 Đặc tính hóa học của prebiotic

Thành phần đường đơn: Các prebiotic đã xác định chủ yếu được tạo thành từ

các đơn vị đường đơn là glucose, galactose, xylose và fructose Một sốoligosaccharide được cấu tạo bởi các đường đơn đánh giá khả năng prebiotic củachúng [4]

Liên kết glycosidic: Liên kết giữa các gốc đường đơn là nhân tố quan trọng để

xác định khả năng tiêu hóa và khả năng lên mem chọn lọc của một prebiotic [23].Các prebiotic có cấu hình β nên không bị tiêu hóa bởi các enzyme thủy phân củangười (α-glycosidic: α-glucosidase, α-maltase, α-sucrase [17]) trước khi tới ruột già

Bờ bàn chải của ruột non có chứa enzyme β-galactosidase có thể phân hủy được một

số prebiotic nhưng hoạt lực của chúng rất yếu

Khối lượng phân tử: Hầu hết các prebiotic có độ polymer hóa (DP) tương đối

nhỏ (ngoại trừ inulin) và được thủy phân bởi các enzyme glycosidase của vikhuẩn[18] Vì vậy, người ta cho rằng oligosaccharide có mạch càng dài thì quá trìnhlên men diễn ra càng chậm và do đó, tác dụng prebiotic sẽ được thể hiện lâu hơntrong toàn bộ ruột già[19] Nếu quá trình chuyển hóa saccharide có thể diễn ra trongtoàn bộ chiều dài ruột già thì sẽ có lợi

1.2 Ảnh hưởng của prebiotic đến hệ tiêu hóa

 Tích cực:

Tái tạo sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột (chống lại các vi khuẩn gây bệnh): các vi khuẩn hữu ích sống trong đường ruột như Bifidobacteria và Lactobacilli có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Camplylobacter và Salmonella spp Nghiên cứu cho thấy thức ăn trẻ sơ sinh có bổ

sung Galacto-oligosaccharide (GOS) và Fructo-oligosaccharide (FOS) làm tăng vi

khuẩn Bifidobacteria trong phân Mặt khác, prebiotic đóng vai trò như một cái bẫy

đối với vi khuẩn gây hại Nhiều vi khuẩn gây hại có cơ chế sử dụng thụ thể (receptor)oligosaccharide trong ruột để liên kết với bề mặt niêm mạc ruột và gây nên các bệnh

về dạ dày Các prebiotic có thể mô phỏng các thụ thể ở ruột và do đó, các vi khuẩngây hại sẽ liên kết với prebiotic thay vì niêm mạc ruột Điều này giải thích tại sao trẻ

bú sữa mẹ thường ít bị tiêu chảy hơn so với trẻ bú sữa bột Trong sữa mẹ có chứatới 130 loại oligosaccharide khác nhau

Giảm khả năng ung thư ruột kết (Colorectal cancer-CRC): nghiên cứu chế độ

ăn uống của động vật thí nghiệm có bổ sung inulin hoặc oligofrutose cho thấy cáckhối u giảm Tuy nhiên, cơ chế chính xác tại sao các prebiotic này có thể giảm cáckhối u vẫn còn chưa rõ

Giảm cholesterol trong máu: prebiotic có thể gián tiếp ảnh hưởng đến mức

cholesterol trong máu bằng cách thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn axit lactic Vikhuẩn này có thể làm giảm mật độ cholesterol trong máu Ngoài ra nghiên cứu trênchuột cho thấy những con chuột tiêu thụ FOS có mức cholesterol thấp hơn so vớinhững con đối chứng

Tăng cường hấp thu khoáng chất: một số nghiên cứu trong động vật cho thấy

prebiotic giúp tăng hấp thu canxi tại ruột kết Ở chuột, FOS tăng cường hấp thụcanxi, magie, sắt, đồng và kích thích các vi khuẩn thủy phân axit phytic giúp nângcao sự hấp thụ khoáng chất Với GOS quá trình hấp thu khoáng chất cũng tăng lên

Cải thiện bệnh viêm ruột (Inflammatory Bowel Disease-IBD): chuột có chế độ

ăn gồm oligosaccharide chiết xuất từ sữa dê có những cải thiện về triệu chứng bệnh

so với chuột đối chứng Inulin và oligofructose cũng được báo cáo là hiệu quả trongđiều trị IBD

Giảm dị ứng: phản ứng dị ứng lần đầu tiên trong đời thường biểu hiện dưới

hình thức viêm phong da (Atopic Dermatitis) ở trẻ sơ sinh Trẻ sơ sinh đã phát triểnviêm phong da thường có nguy cơ cao bị dị ứng sau này Prebiotic có hiệu quả tíchcực làm giảm sự phát triển của viêm phong da ở trẻ sơ sinh[14]

 Tiêu cực:

Prebiotic chỉ tác động tích cực khi cơ thể đã có sẵn các vi sinh vật hữu ích,bản thân prebiotic không sản sinh ra các vi sinh vật này Các mặt han chế củaprebiotic như sau:

• Tiêu thụ một lượng lớn (>20g) inulin mỗi ngày có thể gây tình trạng nhuậntràng Những người tham gia thử nghiệm sử dụng prebiotic đi vệ sinh thường xuyênhơn và phân nhiều hơn

• Các loại đường có nguồn gốc từ FOS có thể kích thích sự tăng trưởng của vi

khuẩn Klebsiella là một vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột.

• Tiêu thụ prebiotic làm tăng vi khuẩn tạo khí gas trong hệ tiêu hóa, do đó cácsản phẩm mới phát triển gần đây thường hướng tới việc đẩy mạnh sự phát triển của

vi khuẩn không tạo khí

• Prebiotic có tác dụng khác nhau lên các đối tượng khác nhau Ví dụ: FOSkhông ảnh hưởng đến sự hấp thu canxi ở thanh niên nhưng lại kích thích sự hấp thunày ở thiếu niên

• Đa số các sản phẩm có chứa prebiotic trên thị trường là sản phẩm sữa bao gồmsữa bột, sữa nước, sữa chua uống Prebiotic còn hiện diện trong bánh kẹo, nướcchấm, thức ăn dặm, súp… Ngoài ra, một số loại dược phẩm trên thị trường cũng cóchứa prebiotic như Smecphap, Lacclean Gold Lab, men vi sinh Supbikiz…

Prebiotic có ích cho sức khỏe nhưng không phải chất thiếu yếu nên không cókhái niệm “thiếu prebiotic” trong cơ thể Lưu ý, nếu dùng quá nhiều prebiotic có thểgây ra tiêu chảy Chế độ ăn bình thường với đầy đủ chất dinh dưỡng đảm bảo cơ thểđược cung cấp đầy đủ prebiotic[14]

1.3 Những tính chất có lợi của prebiotic

1.3.1 Tính chất có lợi của prebiotic đối với công nghệ thực phẩm

Khả năng kết hợp với thực phẩm: bản chất của prebiotic là carbohydrate, làmột thành phần “không sống” Vì vậy, prebiotic có thể kết hợp dễ dàng với các loạithực phẩm khác nhau, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm có thành phần chính làcarbohydrate, để tạo thành thực phẩm có tác dụng “prebiotic” Các loại thực phẩm cóthể kết hợp được với prebiotic hiên nay là: sản phẩm sữa uống và sữa lên men, nướcuống tốt cho sức khỏe, nước uống có gas, bánh nướng, sốt, paste, thực phẩm cho trẻ

em và trẻ đang cai sữa, cereals, snack, bánh kẹo và món tráng miệng,…[4, 12]

Giá trị calorie thấp: prebiotic khi được tiêu thụ sẽ cung cấp năng lượng bằngkhoảng 40 – 50% so với carbohydrate tiêu hóa được, tức khoảng 1 – 2Kcal/g [17]

Các đặc tính công nghệ: prebiotic cũng được ứng dụng tương tự với các đặctính công nghệ sau vì prebiotic có bản chất là di- hay oligo-saccharide:

− Vị: độ ngọt giảm do kích thước phân tử tăng

− Cảm giác ở miệng: oligosaccharide có kích thước lớn có thể ứng dụng làchất thay thế chất béo

− Độ nhớt: độ nhớt tăng theo độ tăng của kích thước phân tử

− Độ tan: độ tan giảm theo độ tăng của khối lượng phân tử.

− Tính hút ẩm: oligosaccharide có thể được dùng để kiểm soát độ ẩm trongthực phẩm

− Phản ứng màu: phản ứng màu giảm do khối lượng phân tử tăng (phản ứngMaillard giảm trong thực phẩm được xử lý nhiệt)

− Điểm đóng băng: điểm đóng băng càng giảm khi khối lượng phân tử tăng

− Thủy phân oligosaccharide trong điều kiện acid không liên quan đến khốilượng phân tử mà phụ thuộc vào liên kết hóa học[4, 12]

1.3.2 Tác dụng của prebiotic đối với sức khỏe con người

Nhiều nghiên cứu in vitro trên động vật và con người đã đưa ra kết luận

prebiotic tác động lên thành phần hệ sinh vật đường ruột[15], làm tăng số lượng vikhuẩn có lợi và giảm số lượng vi khuẩn có hại đối với sức khỏe con người trongđường ruột [4, 5]

− Cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu: quá trình vi khuẩn có lợi lên menprebiotic sinh ra các chất dinh dưỡng cho niêm mạc như SCFA, polyamine[6, 7] Cácchất này làm tăng sự phát triển (tăng kích thước và số lượng) và kiểm soát sự phânhóa của các tế bào biểu mô của niêm mạc Do đó sự tiêu hóa và hấp thu trong đườngruột được cải thiện [6]

− Chống viêm nhiễm vi sinh vật: các vi sinh vật có hại có thể gây ra viêmruột cấp và mãn tính Vi khuẩn gây bệnh vừa có thể xâm nhập và phát triển trongđường ruột và sau đó xâm chiếm các mô của vật chủ, vừa có thể tạo ra chất độc trongthực phẩm trước khi nó được tiêu thụ[11] Prebiotic có khả năng cải thiện tính kháng

vi khuẩn gây hại bằng cách làm tăng số lượng Bifidobarteria và Lactobacilli [7].

− Cải thiện sự hấp thu khoáng: tiêu thụ prebiotic có thể làm tăng sự hấp thukhoáng (calcium, magnesium, sắt và kẽm) vào cơ thể Trong các nghiên cứu về tácdụng của prebiotic đối với sự hấp thu khoáng, nghiên cứu về calcium là nhiều nhất[4,7]

− Kiểm soát lipit trong máu: Prebiotic có thể điều chỉnh hàm lượng lipit cótrong máu hay làm giảm cholesterol và triglyceride trong máu [4]

− Ngăn ngừa ung thư đại tràng: Prebiotic làm giảm số lượng các vi khuẩngây hại, tăng vi khuẩn có lợi[3, 7]; khử độc các chất gây ung thư được ăn vào[17];

sinh ra các chất SCFA có tác dụng phòng chống ung thư hiệu qủa; kích thích hệ miễndịch chống lại tốt hơn sự sinh sôi của tế bào ung thư[9].

− Chứng táo bón: Prebiotic kích thích sự phát triển của vi khuẩn nên sinhkhối của vi khuẩn tăng và khối lượng phân tăng theo Prebiotic và các SCFA đượctạo ra do quá trình lên men prebiotic có thể kích thích sự nhu động ruột và làm tăng

ẩm trong phân nhờ tăng áp suất thẩm thấu Cho đến nay, chỉ có lactulose được xem làprebiotic có tính nhuận tràng, có tác động giải quyết được chứng táo bón[3, 7]

1.4 Phương pháp sản xuất prebiotic

Hiện nay, có 3 phương pháp chính để sản xuất prebiotic [4, 8, 11, 12]:

 Phương pháp vật lý: Chiết tách trực tiếp oligosaccharide tự nhiên từ thựcvật:

• Oligosaccharide đậu nành từ whey đậu nành

• Inulin từ chicory

• Tinh bột bền từ ngô

 Phương pháp hóa học: Chuyển hóa có xúc tác từ carbohydrate:

• Lactulose từ quá trình đồng phân hóa lactose trong môi trườngkiềm

• Lactiol từ quá trình hydro hóa lactose

• Agaro-oligosaccharide từ thủy phân bằng acid hydrochloric,acid citric

 Phương pháp enzyme:

Thủy phân có kiểm soát polysaccharide tự nhiên, có thể thêm quá trình

sắc kí để tinh sạch prebiotic:

• FOS từ inulin (enzyme inulinase)

• XOS từ arabinoxylan (xylan lõi ngô, enzyme xylanase)

• Pectic-oligosaccharide từ pectin (pectin đậu nành, enzyme polygalacturonase)

endo-Glycosyl hóa – quá trình tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme thủy

phân và/ hoặc glycosyl transferase có nguồn gốc từ thực vật hoặc vi sinh vật, có thể

có thêm quá trình sắc kí để tinh sạch prebiotic[19]:

• GOS từ lactose (β-galactosidase)

• ScFOS từ sucrose (β-fructosyltransferase) hoặc fructose.

• Lactosucrose từ lactose và sucrose (β-fructo-furanosidase)

• Gluco-oligosaccharide từ sucrose (enzyme dextran sucrase)[2,20]

Quá trình chiết xuất hóa học oligosaccharide từ thực phẩm có thể làm cho sảnphẩm có màu hay hương vị không mong muốn

CHƯƠNG 2: CÁC PREBIOTIC ĐƯỢC BỔ SUNG TRONG CÁC SẢN

PHẨM SỮA

2.1 Galactooligosaccharide (GOS)

2.1.1 Giới thiệu về GOS

Galactooligosaccharide là prebiotic có trong sữa, được sinh tổng hợp từlactose [13] GOS có trong sữa mẹ với lượng rất thấp khoảng 1g/l, tồn tại với lượngvết trong sữa bò và yogurt[23]

Trước kia, GOS được xem là sản phẩm phụ trong công nghiệp chế biến sữaGOS [13] Đó là kết quả hoạt động của enzyme β-galactosidase của canh trường nuôicấy sữa lên men Tuy nhiên, người ta thấy rằng, một lượng GOS rất nhỏ trong sữa mẹgóp phần thiết lập hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột của trẻ được nuôi bằng sữa

mẹ trong đó, bifidobacteria là loại vi khuẩn chiếm ưu thế [8]

GOS là hỗn hợp gồm các oligosaccharide được cấu tạo bởi các đơn vị β-(1-4)galactopyranosyl thường được nối với nhau bởi liên kết β-(1-6) hay β-(1-4) và có thể

có gốc glucopyranosyl ở đầu khử thông qua liên kết β-(1-4) Trisaccharide có thểđược gọi là 4’- hoặc 6’-galactosyllactose nếu liên kết giữa các gốc galactose là β-(1-4) hay β-(1-6) Mức độ polymer hóa (DP) của GOS là 2 – 10 [7, 8]

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của GOS

GOS được sản xuất theo phương pháp enzyme có thể được gọi với nhiều têngọi khác nhau: transgalacto-oligosaccharide, transgalactosylated-oligosaccharide,trans-GOS, TOS, hay oligogalactosyl-lactose[8]

2.1.2 Kỹ thuật sản xuất GOS

GOS được sản xuất thương mại bằng phương pháp enzyme, bởi hoạt tínhtransgalactosyl của β-galactosidase sử dụng cơ chất lactose

2.1.2.1 Emzyme tổng hợp GOS

Tên gọi: Enzyme β-galactosidase hay β-D-galactoside galactohydrolase là

enzyme được gọi với tên thường là lactase [13]

Nguồn gốc: β-galactosidase tồn tại trong thực vật (đào, mơ, hạnh nhân), động

vật (mô ruột, não da) và vi sinh vật ( nấm men, vi khuẩn, nấm mốc) Enzyme cónguồn gốc từ vi sinh vật cho hiệu suất cao nên được sử dụng để sản xuất thương mại[7, 11, 13]

Trong sản xuất GOS thương mại, các enzyme được chiết tách chủ yếu từ các

giống: Kluyveromyces, Aspergillus, Streptococcus, Bacillus, Crytococcus(bảng 2.1).

Ngoài ra, enzyme β-galactosidase cũng được tìm thấy trong các loài vi khuẩnprobiotic [7] Những loài vi khuẩn probiotic có thể tổng hợp GOS như:

bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum

BB, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus reuteri Sản phẩm oligosaccharide của những

loài này sẽ được chuyển hóa dễ dàng hơn bởi vi khuẩn probiotic trong đường ruột.Sản phẩm tạo thành là hỗn hợp gồm những oligosaccharide mạch thẳng hoặc nhánh[7, 11]

Đặc điểm: Enzyme β-galactosidase có kích thước phân tử là 36 – 362 kDa,

chứa 4 subunit Enzyme từ nấm men và vi khuẩn là enzyme nội bào và enzyme từnấm mốc là enzyme ngoại bào [22] Vì vậy, trong sản xuất GOS, enzyme từ nấm men

và vi khuẩn là enzyme nội bào và enzyme từ nấm mốc là enzyme ngoại bào [22] Vìvậy, trong sản xuất GOS, enzyme từ nấm men và vi khuẩn phải được chiết tách rakhỏi tế bào Enzyme từ nấm mốc được thu nhận trong canh trường nuôi cấy [7]

Bảng 2.1 Một số loài vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất GOS thương mại [8].

Loài vi sinh vật pH tối thích Nhiệt độ tối thích Sản phẩm ban đầu

và kiểu liên kếtKluyveromyces

maxianus ssp

Lactis

6.0 – 7.0 37 – 45 6’-galactosyllactoseKluyveromyces 6.9 – 7.3 40 – 44 6’-galactosyllactose

Aspergillus oryzae 3.5 – 6.5 50 – 55 6’-galactosyllactoseAspergillus niger 3.0 – 4.0 55 – 65 6’-galactosyllactoseStreptococcus

Bacillus

stearothermophilus 6.0 – 6.4 50 – 65 4’-galactosyllactoseCryptococcus

Cơ chế tổng hợp GOS: Enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ nhiều loại

vi sinh vật khác nhau sẽ có các đặc tính khác nhau như khối lượng phân tử, độ dàimạch polypeptide, và vị trí của trung tâm hoạt động [13, 22] Tuy nhiên, chúng đều

có các amino acid như nhau ở trung tâm hoạt động Đó là histidine đóng vai trò như

là một chất ái nhân/base (nhận proton) và cysteine như là một acid (cho proton) Hiệnnay, có một giả thiết mới là β-galactosidase từ các vi sinh vật khác nhau có 2 gốc acidglutamic (Glu482 và Glu551) ở trung tâm hoạt động Một gốc acid glutamic như làchất cho proton và gốc acid còn lại là chất nhận proton Chúng tham gia đồng thờitrong phản ứng enzyme [7, 13]

• Bước đầu tiên được gọi là bước glycosyl hóa Một acid carboxyl ở trungtâm hoạt động cho một proton vào nguyên tử oxy liên kết [7], giải phóng glucose[13] Đồng thời, một acid carboxyl khác gắn vào galactosyl như là một chất ái nhân[7], hình thành phức enzyme-galactoryl [13]

• Bước thứ hai là bước deglycosyl [7] Phức enzyme-galactosyl được chuyểnđến một chất nhận chứa nhóm hydroxyl [13] Acid carboxyl thứ nhận proton từ chấtnhận đó [7] Đồng thời, các phân tử nước hay các phân tử đường trong hỗn hợp phảnứng có thể là chất ái nhân, để nhận gốc galactosyl từ phức enzyme-galactosyl [22].Đây là sự xúc tác cho phản ứng thủy phân hay galactoyl hóa, phụ thuộc vào nồng độtương đối của các chất nhận có chức hydroxyl là nước hay carbohydrate [7] Trongdung dịch lactose được làm loãng, nước nhiều hơn các đường khác như glucose,lactose, có thể cạnh tranh hơn để làm chất nhận, do đó, galactose được hình thành vàđược giải phóng từ trung tâm hoạt động Nếu dung dịch có lượng lactose cao, phân tử

lactose có nhiều cơ hội hơn để là chất nhận, nối với phức enzyme-galactosyl [13] tạo

ra trisaccharride, pentrsaccharide hay hexasaccharide [7, 8, 11]

Hình 2.2 Cơ chế phản ứng galactosyl hóa [8].

Như vậy, β-galactosidase hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân và phảnứng galactosyl hóa Quá trình tổng hợp GOS có bản chất là quá trình galactosyl hóa[10] Quá trình galactosyl hóa bao gồm phản ứng giữa các phân tử và phản ứng nộiphân tử

• Phản ứng nội phân tử là quá trình phức enzyme-galactosyl chuyển trực tiếpđến đồng phân vị trí glucose được sinh ra từ lactose Liên kết glycosidic của lactose[β-(1-4)] được tách ra và hình thành ngay lại ở vị trí khác của phân tử glucose trướckhi nó khuếch tán ra khỏi trung tâm hoạt động Đây là cách allolactose [β-(1-6)]được hình thành dù lượng glucose tự do không nhiều

• Phản ứng giữa các phân tử là quá trình phức enzyme-galactosyl chuyểnđến các phân tử di-, tri-, tetra-, và pentasaccharides khác Kết quả là cácoligosaccharide dài hơn được tạo thành

GOS được hình thành có thể được xem là chất trung gian vì chúng có thể là cơchất cho quá trình thủy phân Vì tất cả những lí do trên, thành phần và hàm lượngGOS sinh ra thay đổi nhanh theo thời gian phản ứng Cấu trúc hóa học và thành phầncủa GOS phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc enzyme [22]

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử allolactose và galactobise [22]

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng galactosyl hóa: Trong suốt quátrình phản ứng, số lượng và bản chất của hỗn hợp oligosaccharide hình thành (kiểu

liên kết giữa các đường galactose và DP) bị tác động bởi hoạt tính transferase (Ut) và hoạt tính thủy phân (Uh) của enzyme Tỉ lệ này phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme, từ

đó đưa ra những điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, thời gian) và nồng độ và bản chấtcủa các cơ chất khác nhau Như vậy, nguồn gốc là yếu tố quyết định hiệu suất phảnứng galactosyl hóa [7, 8, 11]:

• Tỉ lệ hoạt tính transferase và hoạt tính thủy phân (Ut/Uh): Enzyme có tỉ lệUt/Uh càng cao thì hiệu suất tổng hợp GOS càng tăng Để tăng hiệu suất phản ứng,người ta cũng cải thiện tỉ lệ Ut/Uh của enzyme β-galactosidase bằng cách sử dụng kĩthuật gen Enzyme chuyển gen sử dụng khoảng 90% lactose để tạo thành GOS trongkhi chỉ có 10% lactose bị thủy phân Tỉ lệ Ut/Uh là 9:1 này được duy trì trong dungdịch lactose có nồng độ từ 10 – 40% (w/w) [7]

• pH tối thích: Lactose từ nấm men có pH tối thích là 6.0 – 7.0, từ nấm mốc

có pH 6.5 – 7.5 Do đó, lactose nấm mốc được sử dụng trong whey acid Lactose từnấm men và vi khuẩn thích hợp cho sữa (pH 6.6) và whey ngọt (pH 6.1)

• Khả năng chịu nhiệt [7]: So với enzyme từ nấm men, β-galactosidases củanấm mốc chịu nhiệt hơn, nhưng nó nhảy cảm với sự ức chế hơn, chủ yếu bởigalactose [13]

• Ảnh hưởng của ion kim loại: Hoạt lực của các β-galactosidases khác nhauphụ thuộc vào sự hiện diện của kim loại, β-galactosidase từ nấm mốc hoạt độngkhông cần các ion đóng vai trò là cofactor Enzyme từ nấm men, ví dụ β-

galactosidase từ Kluyveromyces lactis cần có ion như Mn2+, Na+; β-galactosidase từ

Kluyveromyces fragilis cần Mn2+, Mg2+, K+ Nói chung, cation hóa trị hai như Mn2+ và

Mg2+ có thể làm tăng hoạt lực của β-galactosidase Cation hóa trị một có thể có tác

động tích cực hoạt tiêu cực đến hoạt động của enzyme Tuy nhiên, Ca2+ và kim loạinặng đều ức chế hoạt động của tất cả β-galactosidases [22]

• Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và nhiệt độ phản ứng: Phản ứng galactosylhóa đạt hiệu quả cao ở nồng độ cơ chất ban đầu cao Tuy nhiên, lactose co tính hòatan thấp nên hạn chế cho hiệu suất của phản ứng ở 25oC, 25% (w/v) lactose tan đượctrong nước

Khi nồng độ lactose càng cao cũng sẽ làm giảm hoạt độ nước của dung dịchphản ứng Hoạt độ nước ảnh hưởng đến mức độ polymer hóa của sản phẩm GOShình thành Hoạt độ nước thấp sẽ có xu hướng tạo trisaccharide và hoạt độ nước caohơn sẽ tổng hợp nên GOS có độ dài lớn hơn [7]

Thông thường, người ta tăng nhiệt độ để tăng tốc độ phản ứng và tăng khả nănghòa tan của lactose Đồng thời, tăng nhiệt độ cũng ngăn ngừa sự kết tinh của lactose

và làm giảm độ nhớt của cơ chể hoạt tính tranferase có ưu thế hơn hoạt tính thủyphân [7] Do đó, đối với những enzyme ưa nhiệt, phản ứng tổng hợp có thể được tiếnhành ở nhiệt độ cao (50 – 80oC) với nồng độ lactose cao hơn [11], nhằm tăng hiệusuất phản ứng [7]

Hai loại β-galactosidases được sử dụng nhiều trong chế biến công nghiệp là loạibền nhiệt và loại hoạt động lạnh Loại bền nhiệt, liên quan đến giảm độ nhớt củadung dịch phản ứng và giảm sự tạp nhiễm vi sinh vật không mong muốn Loại hoạtđộng lạnh cung cấp các sản phẩm sữa dưới những điều kiện ôn hòa để mùi vị và giátrị dinh dưỡng vẫn không thay đổi [22]

2.1.2.2 Quy trình sản xuất GOS

Nguyên liệu để sản xuất GOS thương mại là dung dịch lactose được chiết tách

từ whey có nồng độ cao, khoảng 20 – 40% (w/v) Tuy nhiên whey chứa lactose ởnồng độ cao vẫn được sử dụng để sản xuất GOS [7, 8, 23]

Kỹ thuật sản xuất GOS có thể dùng enzyme tự do để sản xuất theo mẻ hoặc hệthống cố định để sản xuất theo mẻ hoặc liên tục [11] Kỹ thuật cố định enzyme β-galactosidase gồm hấp thụ không hóa trị, liên kết hóa trị, nhốt và encapsulation [10,13] Chất mang để cố định có thể là cotton, chitosan, agrose, chitosan được xử líglutaraldehyde [13] Thiết bị phản ứng có thể được liên kết để sản xuất GOS theo mẻ

hoặc liên tục Cho nguyên liệu và enzymeβ-galactosidase vào trong thiết bị phản ứng[7] Điều chỉnh nhiệt độ phản ứng thích hợp, khoảng 45 – 85oC.

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình sản xuất GOS trên quy mô công nghiệp (Matsumoto,

1990 và Sako et al.,199) [7, 11]

Cuối cùng, dung dịch được cô đặc bằng nhiệt đến 67 – 75% chất khô để sảnxuất GOS dạng syrup hay đến 50% chất khô và được sấy phun để sản xuất GOS dạngbột có 3 – 4% ẩm [7]

Sản phẩm GOS thương mại (không có quá trình tinh sạch) là hỗn hợp của hơn55% oligosaccharide và còn lại là lactose, glucose, galactose (tính theo hàm lượngchất khô) [7, 18] Sản phẩm GOS tinh sạch có khoảng 90 – 98% oligosaccharide theophần trăm tổng hàm lượng chất khô

2.1.3 Các đặc tính công nghệ của GOS

Trạng thái của GOS trong thực phẩm là không màu GOS là thành phần chấtxơ,góp phần tạo cấu trúc và tạo cảm giác trong miệng

GOS có vị ngọt với độ ngọt bằng khoảng 0.3 – 0.6 lần độ nhớt như syrup highfructose

Galactosyl hóa

Khử màuDung dịch lactose

Tính bền của GOS thể hiện qua tính ổn định ở nhiệt độ cao và ở khoảng độ pHrộng Vì vậy, GOS được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm mà không bị phân hủy.GOS không bị thay đổi sau khi đươc sử lí ở 160oC, trong 10 phút ở pH trung tính, haysau khi được xử lí ở 120oC trong 10 phút ở pH= 3, hay 100oC trong 10 phút ở pH= 2.Trong khi đó, ở những điều kiện trên, hơn 50% sucrose sẽ bị phân hủy Ở điều kiện

có acid pH= 2, ở nhiệt độ thường, GOS vẫn có thể ổn định trong vài tháng, nên GOS

có thể làm chất mang trong rau quả được làm sạch [7] Vì tính hòa tan và ổn địnhcao, GOS đặc biệt thích hợp cho các sản phẩm acid như nước ép trái cây và các sảnphẩm sữa lên men, kẹo, và thức uống có tính acid [8]

Khả năng giữ ẩm của GOS cao, ngăn ngừa sự quá khô trong các loại bánhnướng đặc biệt là bánh mì GOS không bị phân hủy bởi quá trình lên men của nấmmen và quá trình nướng bánh, tạo bánh mì có mùi vị và cấu trúc tốt Ngoài ra, GOSlàm giảm hoạt độ của nước, giúp kiểm soát sự lây nhiễm vi sinh vật và giảm sự tạomàu do phản ứng Maillard trong sản phẩm được xử lí nhiệt vì nó ít đầu khử [7].Khả năng chống sâu răng của GOS là do GOS có thể chống lại sự phân giải củanước bọt và không bị vi sinh vật trong miệng sử dụng Do đó, GOS được dùng như làthành phần thay thế đường trong bánh kẹo và chewing gums [7, 11]

Giá trị calorie của GOS thấp khoảng 1.5 – 2 kcal/g [7]

Khả năng kết hợp với probiotic để tạo thành synbiotic [8]

2.2 Fuructooligosaccharide (FOS)

2.2.1 Giới thiệu về FOS

Fructan là polysaccharide tự nhiên non-structural phổ biến nhất, sau tinh bột.Fructan tồn tại trong hơn 36,000 loài thực vật khác nhau Fructan là tên gọi chung đểchỉ tất cả carbohydrate có một hoặc nhiều liên kết fructosyl-fructose chiếm đa số cácliên kết glycosidic [7, 17] Trong thực vật, chúng được tổng hợp từ sucrose bằng cáchlặp lại quá trình fructosyl hóa, và chúng thường có gốc glucose ở cuối mạch [11].Dựa vào kiểu liên kết glycosidic, fructan trong tự nhiên được chia thành 3 loạichính, được trình bày trong bảng 2.2 [23]

Inulin tồn tại trong nhiều loại rau quả và hạt (bảng 2.2), vì vậy inulin được sửdụng trong công nghệ thực phẩm phổ biến hơn các loại fructan khác [7]

Bảng 2.2 Các loại fructan trong tự nhiên [7, 11, 17]