Nghiên cứu tạo dòng lan dendrobium thấp cây triển vọng bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp chiếu xạ và nuôi cấy in vitro (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ********************* NGUYỄN VĂN VINH NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG LAN DENDROBIUM THẤP CÂY TRIỂN VỌNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH KẾT HỢP CHIẾU XẠ VÀ NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 9.62.01.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NƠNG NGHIỆP TP.HCM - 2019 Cơng trình hồn thành tại: - Trạm Huấn luyện Thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh – Trung tâm Khuyến nông TP.HCM, - Viện Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Văn Lệ TS Bùi Minh Trí Người phản biện: ………………………………………… ………………………………………… Luận án bảo vệ trước hội đồng đánh giá luận án cấp trường Có thể tìm hiểu luận án tại: 1………………………………… 2………………………………… 3………………………………… Luận án “Nghiên cứu tạo dòng lan Dendrobium thấp triển vọng phương pháp lai hữu tính kết hợp chiếu xạ nuôi cấy in vitro” thực từ tháng 10/2012 đến tháng 12/2017 Trạm Huấn luyện Thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh – Trung tâm Khuyến nông TP.HCM, Viện Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Tính cấp thiết luận án Nền kinh tế Việt Nam ngày phát triển, mức sống người dân nâng cao, nhu cầu sử dụng hoa lan, kiểng đời sống tinh thần ngày lớn Hoa lan sản phẩm mang giá trị kinh tế cao chiếm vị trí đặc biệt thị trường hàng hóa nơng nghiệp nước (Trần Thị Dung, 2010) Tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Dương có 100 lồi lan khác Các loại hoa lan cho doanh thu từ 800 triệu – 1,3 tỷ đồng/ha/năm Tuy nhiên, 90% giống có nguồn gốc nhập nội từ Thái Lan, Đài Loan vài quốc gia Tây Âu Bỉ, Hà Lan (Sở NN PTNT TP.HCM, 2018) Điều đáng lưu ý giá trị nhập hoa lan Việt Nam ln có chiều hướng tăng qua năm, từ 5,5 triệu USD vào năm 2014 tăng lên 12,9 triệu USD vào năm 2018 (Sở NN PTNT TP.HCM, 2019) Sự tham gia giống lan người Việt Nam tạo hạn chế Xu hướng thị hiếu người chơi lan Dendrobium thiên nhóm Dendorbium đặc hữu Việt Nam, giống lai nhập nội có cấu trúc lạ có giống có hương thơm Giống lan Dendrobium thấp có hình dáng thấp nhỏ ghép chậu lớn để trang trí nội thất, ban cơng, sân thượng Bên cạnh đó, giống hoa lan đột biến ưa chuộng đem lại giá trị mẻ tiềm kinh tế lớn với sở hữu giống lan đột biến lạ Dendrobium có lồi mang nhiều đặc tính trội (về hình thái thân lá, cấu trúc hoa, màu sắc, phân bố sắc tố cánh hoa, mùi hương) thông thường, đặc tính ưu việt khơng tập trung vào lồi Có lồi bật hình thái thân khơng đặc sắc hoa, có lồi màu sắc hoa đẹp, hoa có mùi hương đặc trưng hoa lại không bền (Dương Hoa Xô, 2011; Nguyễn Văn Tới, 2002) Đối với kỹ thuật lai tạo giống lan việc ni cấy hạt điều kiện in vitro điều kiện bắt buộc nên việc kết hợp nuôi cấy mô tế bào đột biến thực nghiệm làm tăng tần suất biến dị lên nhiều lần, giúp tăng hiệu rút ngắn thời gian chọn tạo giống (Lê Trần Bình ctv, 1997) Đối với trồng sinh sản hữu tính kỹ thuật gây đột biến cho phép rút ngắn thời gian chọn lọc phải từ - 10 hệ đến cần - hệ, chí cần - hệ Tuy nhiên, lan với đặc thù loài thường nhân giống kỹ thuật nhân giống vơ tính cần nhận dòng đột biến sau nhân vơ tính trực tiếp để tạo thành giống mà khơng cần trải qua q trình ổn định qua nhiều hệ nhân giống hình thức sinh sản hữu tính Trên thực tế, tần số xuất đột biến sử dụng tia phóng xạ cao tự nhiên khoảng 1000 lần (Lê Duy Thành, 2000) Vì vậy, việc nghiên cứu lai tạo kết hợp gây đột biến để tăng tần số đa dạng dòng Dendrobium tạo dòng Dendrobium thấp để trang trí nội thất, góp phần làm phong phú thêm chủng loại hoa chậu tươi trang trí nhà hướng thiết thực, góp phần tạo nhiều giống gia tăng nguồn biến dị cho giống lan Hiện nay, tiến gen kỹ thuật di truyền cách mạng hóa khả ghi nhận xuất đánh giá kết lai tạo thực vật Người ta dễ dàng xác định thị phân tử tương quan chặt với dòng cha mẹ lai, từ thị nhận diện xác định xác giống tạo Sự kết hợp thị hình thái truyền thống thị phân tử đại có ý nghĩa lớn để tạo dòng lai dòng đột biến mới, góp phần đẩy nhanh hiệu q trình chọn tạo giống (Benjamin ctv, 2017; Phan Thanh Kiếm, 2016; Trần Thị Dung, 2010) Đề tài “Nghiên cứu tạo dòng lan Dendrobium thấp triển vọng phương pháp lai hữu tính kết hợp chiếu xạ ni cấy in vitro” thực với mong muốn tận dụng lợi tất kỹ thuật kể để tạo dòng lan có triển vọng Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát Đề tài nhằm xây dựng quy trình tạo dòng Dendrobium thấp lai đột biến Tạo số dòng lai dòng đột biến đáp ứng theo định hướng giống lan Dendrobium thấp cây, kiểm định số đặc trưng di truyền nhân vơ tính số lượng lớn dòng triển vọng Mục tiêu cụ thể - Xác định điều kiện môi trường nuôi cấy ánh sáng phù hợp cho nảy mầm, hình thành chồi rễ lan Dendrobium thấp - Xây dựng quy trình tạo dòng lai Dendrobium thấp quy trình tạo dòng Dendrobium thấp đột biến - Tạo - dòng Dendrobium thấp lai, - dòng Dendrobium thấp đột biến dựa tiêu chí chọn dòng Dendrobium thấp triển vọng - Đánh giá khác biệt di truyền số dòng lai, dòng đột biến có triển vọng so với bố mẹ chúng thị phân tử nhân giống vơ tính 2-3 dòng lai, 2-3 dòng đột biến có triển vọng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu - Đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro sử dụng đèn LED đơn sắc kết hợp phương pháp lai tạo hữu tính chiếu xạ tia gamma 60Co gây đột biến protocorm phát sinh từ hạt lai lan Dendrobium thấp cây, đồng thời áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá khác biệt di truyền nhân nhanh số dòng triển vọng cho phép rút ngắn thời gian tạo dòng đột biến - Đã áp dụng phương pháp lai hữu tính kết hợp với chiếu xạ gây đột biến để tăng tần suất cá thể có khác biệt so với bố mẹ ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chọn lọc dòng lan Dendrobium thấp có triển vọng Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Xây dựng quy trình tạo dòng lan Dendrobium thấp lai đột biến có triển vọng Quy trình kỹ thuật tạo dòng lai, dòng đột biến phương pháp chiếu xạ protocorm ứng dụng đèn LED nhân giống vơ tính phục vụ công tác nghiên cứu không lan Dendrobium thấp mà mở rộng với nhiều giống hoa lan khác - Tạo dòng Dendrobium thấp có đặc điểm hình thái khác với bố mẹ có khả thương mại hóa, phù hợp để trang trí nội thất, bổ sung vào cấu giống lan sản xuất Việt Nam, làm phong phú giống lan sản xuất nước - Kết luận án nguồn tài liệu tham khảo tốt cho nghiên cứu giảng dạy ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống lan Điểm đề tài - Đối với ngành trồng tạo giống lan Việt Nam, đề tài cơng trình thực đối tượng lan Dendrobium thấp với bước từ lai tạo, chọn lọc, đánh giá, bước nhân giống vơ tính hướng tới việc tạo dòng có khả thương mại hóa - Đề tài ứng dụng công nghệ chiếu sáng đèn LED để tối ưu hóa quy trình ni cấy in vitro lan Dendrobium thấp đột biến - Đề tài kết hợp phương pháp truyền thống với kỹ thuật đại, kết hợp kỹ thuật gây đột biến protocorm phát sinh từ hạt lai lan Dendrobium thấp cây, qua nhận tỷ lệ biến dị cao tăng số dòng lan có triển vọng - Đề tài xây dựng quy trình tạo dòng lai Dendrobium thấp quy trình tạo dòng Dendrobium thấp đột biến, tạo dòng lai dòng lan Dendrobium thấp đột biến có triển vọng, rút ngắn thời gian tạo giống lan Dendrobium thấp Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu khả tạo giống lan Dendrobium thấp có triển vọng qua sử dụng phương pháp lai hữu tính kết hợp chiếu xạ ni cấy in vitro - Đề tài thực lai hoa nguồn vật liệu giống lan làm bố, mẹ không chủng thuộc sưu tập giống lan Dendrobium thấp hữu sưu tập, nhập nội, dưỡng đánh giá hình thái Trạm huấn luyện thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh Phạm vi nghiên cứu giới hạn đề tài - Tạo giống đột biến chiếu xạ gamma từ nguồn nguyên liệu tổ hợp lai không quy ước lan Dendrobium thấp khơng chủng, từ chọn lọc dòng lai đột biến có triển vọng nhân dòng vơ tính dòng lai, dòng đột biến có triển vọng phương pháp ni cấy mơ để tránh tác động phân ly tính trạng - Chỉ chọn tổ hợp DM12x13 làm nguồn vật liệu chiếu xạ tia gamma 60 Co để gây tạo đột biến - Đánh giá khác biệt di truyền kỹ thuật RAPD với 10 primer CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cây hoa lan thuộc ngành hạt kín (Angiospermae), lớp mầm (Monocotyledones), phong lan (Orchidales), họ lan (Orchidaceae) Họ lan có khoảng 750 chi khoảng 20.000 - 25.000 loài (Đào Thanh Vân, 2008; Trần Hợp, 1998), chiếm vị trí thứ hai sau họ cúc ngành thực vật hạt kín họ lớn lớp mầm Qua kết chọn lọc lai tạo, nhà chọn giống trồng lan bổ sung thêm 150.000 giống lai tạo, lan Dendrobium có màu sắc phong phú với 1.600 lồi ngày có nhiều giống lai tạo (Trần Thị Dung, 2010; Nguyễn Thiện Tịch, 2006) Kỹ thuật nuôi cấy in vitro kỹ thuật khơng thể thiếu q trình lai tạo nhân dòng hoa lan nói chung, Dendrobium nói riêng Tuy nhiên, hiệu q trình lai tạo cao hay thấp cần nhiều nghiên cứu tối ưu hóa hồn thiện hóa Các mơi trường MS, ½ MS, VW thường sử dụng cho gieo hạt nhân giống dòng lan Dendrobium in vitro Tuy nhiên, việc nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cho đối tượng lan Dendrobium thấp hạn chế Việc ni cấy in vitro sử dụng đèn LED đơn sắc thực đối tượng Dendrobium sonia Dendrobium docinale làm tăng hiệu nhân giống, thúc đẩy việc nhân chồi làm tăng tích lũy chất khơ in vitro Ánh sáng đơn sắc ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ sống tăng trưởng chồi Dendrobium sonia chiếu xạ Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đối tượng Dendrobium thấp Việc lai tạo hoa lan tiến hành phổ biến giới, Việt Nam có số nghiên cứu giống Phalaenopsis, Dendrobium giống lan rừng Nguồn bố mẹ để lai tạo chủ yếu sưu tầm từ giống nhập nội nước, chưa có nghiên cứu tạo giống Dendrobium có kiểu hình thấp Việt Nam Công tác tạo giống đột biến giống hoa đạt số thành tựu định ứng dụng tia gamma việc chiếu xạ gây đột biến Trên hoa lan có số đề tài nghiên cứu, bước đầu có số kết làm tiền đề để ứng dụng nghiên cứu tạo giống đột biến Đến thời điểm tại, Việt Nam chưa có cơng trình tạo giống hoa lan Dendrobium thấp đột biến công bố Kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu ứng dụng phân tích đa dạng di truyền, nhận diện giống hoa thành tựu khác chọn tạo giống cách nhanh chóng xác Nhiều tác giả ứng dụng kỹ thuật RAPD nhận thấy RAPD cơng cụ hữu dụng để phân tích khác biệt di truyền giống, dòng hoa lan tạo Tuy nhiên, chưa có công bố nghiên cứu ứng dụng thị phân tử hoa lan Dendrobium thấp Như vậy, với kết tổng hợp từ phần tổng quan cho thấy có nhiều nghiên cứu hoa lan giới Việt Nam Tuy nhiên, chưa có cơng trình nghiên cứu có hệ thống tạo giống hoa lan Dendrobium thấp Chính vậy, kết nghiên cứu đề tài tiền đề làm tài liệu tạo giống hoa lan Dendrobium thấp Việt Nam CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu thí nghiệm 15 giống lan Dendrobium mini thuộc sưu tập Trạm Huấn luyện Thực nghiệm Nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm Khuyến Nông TP.HCM Các giống Dendrobium mini nhập nội từ Thái Lan, dưỡng theo dõi theo dõi sinh trưởng, phát triển thời điểm 16 - 18 tháng tuổi Hạt lan tổ hợp DM12xDM13 2.1.Nội dung 1: Xác định môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp cho phát triển hạt lan lai Dendrobium thấp 2.1.1 Thí nghiệm Xác định mơi trường ni cấy thích hợp cho nảy mầm, hình thành chồi rễ hạt lan lai Dendrobium thấp Quả lan thu sau 2,5 tháng kể từ thụ phấn Quả lan sau rửa nước cất khử trùng dung dịch Javel cồn 70o Sau lan cắt hai đầu dùng dao xẻ dọc tách làm hai Hạt lan lấy khỏi rải bề mặt môi trường chuẩn bị Hạt sau gieo đặt đèn chiếu sáng với chu kỳ 16 sáng/8 tối Ẩm độ phòng ni cấy: 70 – 80% Nhiệt độ trung bình không gian bên hệ thống chiếu sáng: 25 ± °C Môi trường chỉnh pH = 5,8 cho vào bình ni cấy có dung tích 250 mL, bình chứa 50 mL mơi trường, hấp khử trùng 121oC; atm 20 phút Khi hóa xanh, hạt lan trải bề mặt môi trường để đếm tổng số hạt, sau theo dõi đếm số hạt lan nảy mầm theo thời gian Chọn chồi có chiều cao khoảng 0,5 cm cấy sang môi trường nhân chồi chuẩn bị sẵn theo dõi tiêu sinh trưởng chồi lan Chọn chồi có chiều cao khoảng – 1,2 cm có - cấy sang môi trường tạo rễ chuẩn bị sẵn, theo dõi tiêu phát triển rễ lan 2.1.2 Thí nghiệm Xác định tỷ lệ ánh sáng đỏ/xanh dương cường độ chiếu sáng thích hợp cho nảy mầm, hình thành chồi rễ hạt lan lai Dendrobium thấp Phương pháp khử trùng lan gieo hạt tương tự thí nghiệm Đèn LED đỏ (bước sóng 660 nm), đèn LED xanh dương (bước sóng 460 nm) sử dụng thí nghiệm Các nghiệm thức chiếu sáng gồm tỷ lệ đèn: 100% đèn LED đỏ/0% đèn LED xanh dương (R1); 75% đèn LED đỏ/25% đèn LED xanh dương (R2) 50% đèn LED đỏ/50% đèn LED xanh dương (R3); Các cường độ chiếu sáng bao gồm cường độ 200 lux; 400 lux; 600 lux 800 lux Nghiệm thức đối chứng chiều với đèn huỳnh quang (40 W, Rạng Đông – Việt Nam) Hạt lan hóa xanh (15 ngày sau gieo hạt) nghiệm thức trải bề mặt môi trường để đếm tổng số hạt cấy (hạt hóa xanh hạt nâu), sau tiếp tục theo dõi đếm số hạt lan nảy mầm thời điểm 39 ngày sau gieo hạt Protocorm có đường kính mm cấy chuyền qua môi trường nhân chồi Sau tuần cấy chuyền, protocorm phát triển thành chồi Chọn chồi khỏe, chiều cao từ ± 0,25 cm, có để cấy chuyền theo dõi ảnh hưởng tỷ lệ ánh sáng đơn sắc đỏ/xanh dương cường độ chiếu sáng đến hệ số nhân protocorm, tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân chồi lan Dendrobium thấp in vitro sau tuần cấy chuyền Chọn chồi khỏe, chiều cao từ - 2,25 cm, có – để cấy chuyền qua mơi trường tạo rễ, bình chồi để theo dõi ảnh hưởng ánh sáng đèn LED tỷ lệ ánh sáng đỏ/xanh dương cường độ chiếu sáng đến hình thành phát triển rễ từ chồi lan Dendrobium thấp 2.2 Nội dung Lai tạo hoa lan Dendrobium thấp chọn lọc số dòng lai có triển vọng 11 2.3.3 Thí nghiệm Đánh giá sinh trưởng, phát triển, đặc điểm hoa chọn lọc số cá thể biến dị có triển vọng Các biến dị in vitro thí nghiệm 6B đủ tiêu chuẩn đem vườn ươm để dưỡng tuần, sau bố trí lan vào chậu, chậu cây, giá thể vỏ dừa khô Kỹ thuật trồng chăm sóc lan tương tự thí nghiệm Tiến hành theo dõi, đánh giá chọn lọc số dòng đột biến có triển vọng 2.4 Nội dung Đánh giá khác biệt di truyền nhân giống số dòng lai, dòng đột biến có triển vọng 2.4.1 Thí nghiệm Sử dụng thị phân tử đánh giá khác biệt di truyền số dòng lai dòng đột biến có triển vọng Kế thừa phương pháp tách DNA có sử dụng CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) Obara-Okeyo Kako (1998), dụng 10 primer sở kế thừa kết nghiên cứu 10 giống lan rừng Dendrobium vùng Đông Nam Bộ Việt Nam (Trần Thị Dung, 2010) Phân tích kết di truyền phần mềm NTSYSpc Các số liệu thu xử lý phân tích chương trình NTSYSpc version 2.1 (Numbercial Taxonomy SYStem), số liệu xử lý để xây dựng ma trận tương đồng (Similarity matrix) ma trận khoảng cách (Distance matrix) Các ma trận biểu cho mối quan hệ xa gần mặt di truyền mẫu phân tích xây dựng dựa cơng thức tốn học Nei Li (1979) 2.4.2 Thí nghiệm Nhân giống vơ tính số dòng lai triển vọng đánh giá sinh trưởng điều kiện in vitro Chồi dòng lan chọn lọc khử trùng, tách bỏ cắt thành lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) với kích thước khoảng 1,0 1,5 mm Lát mỏng tế bào cấy lên môi trường ½ MS có bổ sung BA mg/L kết hợp với NAA 0,5 mg/L để phát sinh protocorm like body (PLBs) từ tTCL Sau tháng nuôi cấy, PLBs thu có sức sống tốt, 12 tách thành cụm nhỏ có kích thước 0,3×0,3 cm với khoảng - PLB, cấy lên môi trường MS có bổ sung BA mg/L NAA mg/L Sau tháng, PLBs có sức sống tốt lại tách thành cụm nhỏ có kích thước 0,3×0,3 cm với khoảng - PLBs, cấy lên mơi trường MS có bổ sung BA mg/L NAA mg/L Các PLBs chuyển lên mơi trường ½ MS + nước dừa 150 mL/L + saccharose 20 g/L + agar g/L + khoai tây 50 g/L + than hoạt tính 0,5 g/L để hình thành chồi sau tuần ni cấy Sau lần cấy chuyền, lần cách tháng, chồi cấy qua mơi trường MS có bổ sung saccharose 30 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 200 mL/L + agar g/L + than hoạt tính 0,5 g/L + chất điều hòa sinh trưởng NAA với nồng độ mg/L để tạo rễ 2.4.3 Thí nghiệm 10 Đánh giá sinh trưởng, phát triển đặc điểm hoa số dòng lai triển vọng điều kiện nhà lưới Sau tháng từ xử lý tạo rễ, chọn có chiều cao đồng (3 – cm, có từ – lá) chuyển vườn ươm để ươm khoảng - tuần Cây lan trồng chậu, chậu cây, giá thể dừa miếng Quy trình trồng chăm sóc lan tương tự thí nghiệm Theo dõi sinh trưởng hoa dòng lai triển vọng 2.4.4 Thí nghiệm 11 Nhân giống vơ tính số dòng đột biến triển vọng đánh giá sinh trưởng điều kiện in vitro Cách thức thực hiện: tương tự thí nghiệm 2.4.5 Thí nghiệm 12 Đánh giá sinh trưởng, phát triển đặc điểm hoa số dòng đột biến triển vọng điều kiện nhà lưới Cách thức thực hiện: tương tự thí nghiệm 10 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm phân tích xử lý phần mềm SAS 9.1, so sánh nghiệm thức tốt nuôi hệ thống đèn LED với nghiệm thức đối chứng nuôi đèn huỳnh quang thông qua việc thực kiểm tra trắc nghiệm T – test (thí nghiệm 2) Phân tích đa dạng hình thái phân nhóm cá thể sử dụng phần mềm Minitab 15, phân tích kết di truyền phần mềm NTSYSpc (thí nghiệm 8) Các thí nghiệm lại sử dụng phần mềm SPSS phiên 19.0 để xử lý số liệu 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho phát triển hạt lan lai Dendrobium thấp Đã xác định môi trường nuôi cấy in vitro, tỷ lệ ánh sáng dùng đèn LED đỏ LED xanh dương, cường độ chiếu sáng tốt cho nảy mầm: ½ MS + saccharose 30 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 200 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L điều kiện ánh sáng (100Đ, 400 lux); nhân chồi: ½ MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L chế độ chiếu sáng (75Đ: 25X, 800 lux); tạo rễ: MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L+ agar g/L chế độ chiếu sáng (50Đ: 50X, 400 lux) Môi trường nuôi cấy chế độ chiếu sáng tối ưu sử dụng cho việc nuôi cấy hạt lan lai tổ hợp lai protocorm sau chiếu xạ với tia gamma 60Co 3.2 Lai tạo hoa lan Dendrobium thấp chọn lọc số dòng lai có triển vọng Trong 20 cặp lai lan Dendrobium thấp nghiên cứu, có 15 tổ hợp lai đậu với tỷ lệ đậu khoảng từ 25 – 100% Trong 15 tổ hợp đậu có tổ hợp cho hạt hữu thụ bao gồm: DM01x12, DM10x01, DM11x12, DM11x18, DM11x24, DM12x11, DM12x13, DM12x14 DM24x11 với tỷ lệ đậu từ 58,3 – 100% tỷ lệ hạt nảy mầm từ 63,7 – 97,3% 3.2.1 Phân nhóm chọn lọc dòng lai Dendrobium thấp triển vọng triển vọng Tiêu chí chọn dòng lai Dendrobium thấp triển vọng theo định hướng: có chiều cao từ 15 - 20 cm, số giả hành từ – giả hành, số từ – lá, số hoa/phát hoa từ hoa trở lên, đường kính hoa từ 4,5 cm trở lên, có màu sắc hoa khác với bố mẹ Từ so sánh, đánh giá sinh trưởng hoa tổ hợp điều kiện in vitro ngồi nhà lưới chọn dòng lai DM11x12:90, DM11x24:139, DM12x11:180 có triển vọng 14 3.2.2 Đặc điểm hình thái dòng lai Dendrobium thấp có triển vọng chọn lọc Tổ hợp lai Mẹ Bố Mẹ DM11 Đường kính hoa: 6,43 cm; số hoa: hoa;chiều dài phát hoa: 28,93 cm; chiều Con lai Bố DM12 Đường kính hoa: 6,33 cm; số hoa: 8,67 hoa; chiều dài phát hoa: 21,77 cm; cao giả hành: chiều cao giả 17,43 cm; số giả hành: 12,30 cm; hành: 4; số lá: số giả hành: 4; số lá: Con lai Dòng DM11x12:90 Đường kính hoa: 6,5 cm; số hoa: 10 hoa; chiều dài phát hoa: 33,1cm ;chiều cao giả hành: 10,1 cm; số giả hành: 3; số lá: Chiều cao cây: 18 cm Tuổi thọ hoa 35 ngày Mẹ DM11 Đường kính hoa: 6,43 cm; số hoa: hoa; chiều dài phát hoa: 28,93 cm; chiều cao giả hành: 17,43 cm; số giả hành: 4; Con lai Dòng DM11x24:139 Đường kính hoa: cm; số hoa: hoa; chiều dài phát hoa: 28,5 cm; chiều cao giả hành: 8,6 cm; số giả Bố DM24 Đường kính hoa: 4,87 cm; số hoa: 12,67 hoa; chiều dài phát hoa: 28,67 cm; chiều cao giả hành: 8,53 cm; số giả hành: 6; hành: 3; số lá: Hình dạng Dòng DM11x12:90 Dòng DM11x24:139 15 số lá: số lá: Mẹ DM12 Đường kính hoa: 6,33 cm; số hoa: 8,67 hoa; chiều dài phát hoa: 21,77 cm; chiều cao giả hành: 12,30 cm; số giả hành: 4; số lá: Bố DM11 Đường kính hoa: 6,43 cm; số hoa: hoa; chiều dài phát hoa: 28,93 cm; chiều cao giả hành: 17,43 cm; số giả hành: 4; số lá: Chiều cao cây: 17 cm Tuổi thọ hoa 37 ngày Con lai Dòng DM12x11:180 Dòng DM12x11:180 Đường kính hoa: 5,8 cm; số hoa: 10 hoa; chiều dài phát hoa: 36,9 cm; chiều cao giả hành: 8,2 cm; số giả hành: 2;số lá: Chiều cao cây: 19 cm Tuổi thọ hoa 40 ngày 3.2.3 Quy trình tạo dòng lan lai Dendrobium thấp Từ kết nghiên cứu nội dung xác định số điều kiện cho phát triển tối ưu hạt lan lai Dedrobium thấp nội dung lai tạo hoa lan Dendrobium thấp chọn lọc số dòng lai có triển vọng xây dựng quy trình tạo dòng lan lai Dendrobium thấp thông qua lai tạo thể qua Hình 3.11 16 Chọn bố mẹ Dendrobium thấp Lai tạo – tháng Quả lan lai Dendrobium thấp ½ MS + saccharose 30 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 200 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L Ánh sáng 100% LED đỏ, 400 lux Gieo hạt 1-2 tháng Protocorm ½ MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L Ánh sáng 75% LED đỏ + 25% LED xanh dương, 800 lux MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L+ agar g/L Ánh sáng 50% LED đỏ + 50% LED xanh dương, 400 lux tháng 22 tháng Chồi lan lai Dendrobium thấp tháng Cây in vitro hoàn chỉnh (thuần dưỡng) (1 tháng) Cây Nhà lưới (8-10 tháng) Cây trưởng thành Chọn lọc Nhân dòng vơ tính in vitro (10 – 12 tháng) Cá thể có triển vọng Hình 3.11 Quy trình tạo dòng lan lai Dendrobium thấp 17 3.3 Chiếu xạ gây đột biến in vitro protocorm lan Dendrobium thấp chọn lọc số dòng đột biến có triển vọng 3.3.1 Xác định liều LD50 Trong tổ hợp lai nghiên cứu tổ hợp lai DM12x13 có tỷ lệ đậu quả, số quả/cây tỷ lệ nảy mầm tốt nhất, đủ số lượng để bố trí thí nghiệm nên nội dung chiếu xạ gây đột biến chọn tổ hợp lai DM12x13 để thực Tỷ lệ chết tổ hợp lai DM12xDM13 lan Dendrobium thấp sau chiếu xạ phụ thuộc vào liều chiếu xạ thời gian theo dõi: liều chiếu cao thời gian theo dõi lâu tỷ lệ chết cao: tỷ lệ chết sau tháng liều chiếu xạ 100 Gy 83,9 Hình 3.13 Sự tương quan tỷ lệ chết liều xạ tổ hợp lai DM12x13 Dựa vào tỷ lệ chết liều xạ sử dụng để tính tương quan hồi quy đạt phương trình y = 0,8314x - 6,2048, R2 = 0,9228 Trên sở phương trình này, liều gây chết 50% LD50 68 Gy Việc tìm liều LD50 có ý nghĩa thiết thực cho việc xác định liều gây tạo đột biến cách hiệu 3.3.2 Chiếu xạ gây đột biến in vitro protocorm tổ hợp DM12x13 Ở liều chiếu Gy (đối chứng), liều xạ 20 Gy 40 Gy, tốc độ tăng trưởng chiều cao không khác biệt khác biệt nhỏ Tốc độ tăng trưởng chiều cao liều xạ 80 Gy chậm đáng kể so với đối chứng gần không tăng trưởng 18 Sau tháng chiếu xạ, có biểu biến dị thân xuất tất liều từ - 80 Gy Qua quan sát ghi nhận sai khác hình dạng thân, chiếu xạ đối chứng với chiếu xạ như: viền mép xẻ thùy nhiều, mép gợn sóng (răng cưa), dài, tròn, ống, to, dính, nhiều gân.Tần suất biến dị hình thái xử lý chiếu xạ in vitro tương đối cao Màu sắc dễ mẫn cảm với tia phóng xạ gamma (γ), biến dị diệp lục phát sinh nhiều dãy liều xạ 20-80Gy Việc chiếu xạ gây đột biến tổ hợp lan lai DM12xDM13 ghi nhận số biến dị in vitro: biến dị cấu trúc, màu sắc thân (thân chia mắc (thấp cây), thân to (thấp cây), nhiều giả hành (thấp cây), giả hành dạng củ hành (thấp cây), thân dính, thân nảy chồi, thân xanh nhạt, thân xanh đậm, thân tím); biến dị cáu trúc (lá xoắn, dày, dài, tròn, cưa, ống, xẻ thùy, đối xứng, to, dính, nhiều gân); biến dị màu sắc (lá tím, trắng xanh, xanh đậm, trắng – xanh, vàng- xanh, xanh nhạt) Ngoài ra, theo dõi tổ hợp lai chiếu xạ DM12xDM13 ghi nhận số biến dị lạ: dị biến đổi màu sắc (diệp lục) hình thái (khơng tạo rễ), biến dị hoa sớm điều kiện in vitro Chiếu xạ tia gamma 60Co liều lượng 20, 40, 60 Gy thích hợp tạo phổ biến dị rộng, đa dạng, có ảnh hưởng khác biệt đến đặc điểm sinh trưởng, biến dị hình thái màu sắc phận thân, 3.3.3 Chọn lọc số dòng đột biến có triển vọng điều kiện nhà lưới Từ cá thể hoa tổ hợp lai chiếu xạ nghiên cứu, dựa vào tiêu chí chọn dòng Dendrobium thấp đột biến triển vọng theo định hướng: có chiều cao từ 15 - 20 cm, số giả hành từ – giả hành, số từ – lá, số hoa/phát hoa từ hoa trở lên, đường kính hoa từ 4,5 cm trở lên, có màu sắc hoa khác với bố mẹ, chọn dòng Dendrobium thấp đột biến triển vọng bao gồm: 19 1/ Dòng DM12x13-20Gy:38 - Thời gian bắt đầu hoa kể từ thời điểm đưa nhà lưới: 12 tháng - Đặc điểm hoa: hoa màu trắng phớt tím nhạt, phía mơi hoa có màu tím đậm, cánh hoa xếp chồng lên cánh hoa thẳng, khơng có lơng, phát hoa có dạng chùm, kiểu phát hoa mọc đỉnh chồi, số phát hoa/giả hành: 1; chiều dài phát hoa: 15 cm; chiều dài đoạn mang hoa: cm; đường Dòng DM12x13-20Gy:38 kính hoa: 6,8 cm; số hoa/phát hoa: hoa; độ bền hoa: 32 ngày Đặc điểm thân lá: Lá dày, màu xanh đậm, hình mũi mác, rộng, kích thước 12,5 x 2,4 cm Giả hành khỏe, hình củ hành lùn, có chiều cao 8,5 cm, đường kính 2,8 cm Cây cao 17 cm 2/ Dòng DM12x13-40Gy:76 - Thời gian bắt đầu hoa kể từ thời điểm đưa nhà lưới: 12 tháng Đặc điểm hoa: hoa màu trắng, phía mơi hoa có màu tím sọc, cánh hoa xếp chồng lên Cánh hoa cong phía sau, có lơng, phát hoa uốn cong hình chữ s, kiểu phát hoa mọc đỉnh chồi, môi hoa hướng lên số phát hoa/giả hành: 1; chiều dài phát hoa: 20 cm; chiều dài đoạn mang hoa: 14 cm; đường kính hoa: cm; số hoa/phát hoa: 7; độ bền hoa: 28 ngày Đặc điểm thân lá: Dòng DM12x13-40Gy:76 Lá mỏng, màu xanh nhạt, mũi nhọn, kích thước 9,5 x 2,4 cm Nhiều giả hành, giả hành cao 11 cm, đường kính 1,6 cm Cây cao 18 cm 20 3/ Dòng DM12x13-40Gy:142 - Thời gian bắt đầu hoa kể từ thời điểm đưa nhà lưới: 12 tháng - Đặc điểm hoa: hoa màu trắng xanh, phía mơi hoa có màu xanh Các cánh hoa cong phía sau, khơng có lơng, phát hoa có dạng chùm, kiểu phát hoa mọc đỉnh chồi; số phát hoa/giả hành: 1; chiều dài phát hoa: 21 cm; chiều dài đoạn mang hoa: 11 cm; đường kính hoa: 5,5 cm; số hoa/phát hoa: 6; độ bền hoa: 45 ngày Đặc điểm thân lá: Lá dày, màu xanh đậm, mũi nhọn, kích thước 10,5 x 1,8 cm Dòng DM12x13-40Gy:142 Giả hành to lùn, có chiều cao 8,2 cm, đường kính 2,8 cm Cây cao 15 cm 3.3.4 Quy trình tạo dòng lan Dendrobium thấp đột biến Từ kết nghiên cứu nội dung xác định số điều kiện cho phát triển tối ưu hạt lan lai Dedrobium thấp nội dung chiếu xạ gây đột biến in vitro hạt Dendrobium thấp chọn lọc số dòng đột biến có triển vọng rút quy trình tạo dòng lan Dendrobium thấp đột biến thể qua Hình 3.18 21 Dendrobium thấp bố mẹ Lai tạo – tháng Quả lan lai Dendrobium thấp Gieo hạt ½ MS + saccharose 30 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 200 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L 1-2 tháng Ánh sáng 100% LED đỏ, 400 lux ½ MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L Chiếu xạ gamma 60 Co 20, 40, 60 Gy Protocorm tháng Ánh sáng 75% LED đỏ + 25% LED xanh dương, 800 lux 26 tháng Chồi Dendrobium thấp chiếu xạ MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L+ agar g/L Ánh sáng 50% LED đỏ + 50% LED xanh dương, 400 lux tháng Cây chiếu xạ in vitro hoàn chỉnh (thuần dưỡng) (1 tháng) Cây chiếu xạ Nhà lưới (8-10 tháng) Cây trưởng thành chiếu xạ Chọn lọc Nhân giống vơ tính in vitro Cá thể đột biến có triển vọng Hình 3.18 Quy trình tạo dòng lan Dendrobium thấp đột biến 22 3.4 Đánh giá khác biệt di truyền nhân giống số dòng lai, dòng đột biến có triển vọng 3.4.1 Đánh giá khác biệt di truyền dòng lan Dendrobium thấp bố mẹ với dòng lai dòng đột biến triển vọng Kết phân tích sản phẩm khuếch đại 10 primer cho thấy có bốn primer A2, A4, A5 A18 cho kết đa hình tốt Chính vậy, bốn primer chọn để phân tích khác biệt di truyền cá thể đột biến so với cá thể lai bố mẹ chúng Dùng primer OPA2 xác định cá thể lai DM11x12:90 có kích thước 550, 800, 1600bp; lai DM11x24:139 có kích thước 550, 700, 800, 1000, 1600bp; lai DM12x11:180 có kích thước 550, 600, 900, 1000bp, khác với kích thước băng bố mẹ cá thể đột biến DM12x1320Gy:38 có kích thước 550, 900, 1600bp; DM12x13-40Gy:76 có kích thước 800, 1000bp; DM12x13-60Gy:142 có kích thước 550, 900, 1000, 1500, 1600bp khác với kích thước băng bố mẹ lai đối chứng Đánh giá khác biệt di truyền thị phân tử RAPD cho thấy cá thể đột biến có khác biệt mặt di truyền so với cá thể lai giống bố mẹ Trong cá thể đột biến DM12x13-40Gy:76 có khác biệt di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền DM12x13-40Gy:76 - DM18 0,48) khác biệt di truyền thấp cá thể lai DM12x13:184 (hệ số tương đồng di truyền lai DM12x13:184 - lai DM12x13:186 0,86) 3.4.2 Nhân dòng vơ tính khảo sát sinh trưởng, phát triển dòng lai, dòng đột biến có triển vọng điều kiện in vitro Ba dòng lai có triển vọng nhân dòng in vitro phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào gồm dòng DM11x12:90, DM11x24:139 DM12x11:180 Ba dòng đột biến có triển vọng nhân dòng in vitro phương pháp ni cấy lát mỏng tế bào gồm dòng DM12x13-20Gy:38, DM12x13-40Gy:76, DM12x13-60Gy:142 Kết nhân giống in vitro 300 từ dòng lai, dòng đột biến có triển vọng để đưa nhà lưới khảo sát sinh trưởng, phát triển 23 3.4.3 Khảo sát sinh trưởng, phát triển dòng lai, dòng đột biến có triển vọng điều kiện nhà lưới Tỷ lệ hoa thời điểm 10 tháng sau trồng nhà lưới dòng chọn lọc khác khác nhau, dòng DM12x11:180 có tỷ lệ hoa cao nhất, đạt 52% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng lại Dòng DM11x24:139 có tỷ lệ hoa đạt 45% dòng DM11x12:90 có tỷ lệ hoa đạt thấp 31% thời điểm 10 tháng sau trồng nhà lưới Kết ghi nhận tỷ lệ hoa dòng đột biến chọn lọc đạt từ 34,8 % - 44,8 % thời điểm 10 tháng sau trồng nhà lưới KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã xác định môi trường nuôi cấy in vitro, tỷ lệ ánh sáng dùng đèn LED đỏ LED xanh dương, cường độ chiếu sáng tốt cho nảy mầm: ½ MS + saccharose 30 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 200 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L điều kiện ánh sáng (100Đ, 400 lux); nhân chồi: ½ MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L + agar g/L chế độ chiếu sáng (75Đ: 25X, 800 lux); tạo rễ: MS + saccharose 20 g/L + khoai tây 50 g/L + nước dừa 150 mL/L + than hoạt tính 0,5 g/L+ agar g/L chế độ chiếu sáng (50Đ: 50X, 400 lux) Môi trường nuôi cấy chế độ chiếu sáng tối ưu sử dụng cho việc nuôi cấy hạt lan lai tổ hợp lai protocorm sau chiếu xạ với tia gamma 60Co Trong 20 cặp lai lan Dendrobium thấp nghiên cứu, có 15 tổ hợp lai đậu với tỷ lệ đậu khoảng từ 25 – 100% Trong 15 tổ hợp đậu có tổ hợp cho hạt hữu thụ với tỷ lệ đậu từ 58,3 – 100% tỷ lệ hạt nảy mầm từ 63,7 – 97,3% Từ so sánh, đánh giá sinh trưởng hoa tổ hợp điều kiện in vitro nhà lưới chọn dòng lai DM11x12:90, DM11x24:139, DM12x11:180 có triển vọng 24 Đã xây dựng quy trình để chọn tạo dòng lan lai Dendrobium thấp có triển vọng phương pháp lai tạo gồm bước thời gian 22 tháng Đã xác định liều gây chết 50% (LD50) 68 Gy protocorm tổ hợp DM12x13 Khi chiếu xạ tia gamma 60Co protocorm, liều 20, 40 60 Gy có tác dụng tăng tần suất biến dị với phổ biến dị rộng, đa dạng cấu trúc hoa, màu sắc hoa, thân, tính trạng giảm chiều cao, hoa sớm điều kiện in vitro Kết so sánh, sàng lọc điều kiện nhà lưới chọn dòng đột biến có triển vọng DM12x1320Gy:38, DM12x13-40Gy:76 DM12x13-60G:142 Đã xây dựng quy trình chọn tạo dòng lan Dendrobium đột biến thấp có triển vọng phương pháp chiếu xạ tia gamma mẫu protocorm với 10 bước thời gian 26 tháng Sau sàng lọc, xác định primer phù hợp OPA2, OPA4, OPA5 OPA18 để đánh giá khác biệt di truyền giống bố mẹ, dòng lai dòng đột biến Dòng đột biến DM12x13-40Gy:76 có khác biệt di truyền lớn so với giống mẹ DM12 dòng lai (hệ số tương đồng di truyền 0,48 - 0,86) Đã nhân vơ tính dòng Dendrobium thấp lai, dòng Dendrobium thấp đột biến có triển vọng có chiều cao từ 15 – 20 cm với hoa/ phát hoa trở lên, đường kính hoa từ 4,5 cm trở lên, màu sắc hoa khác với bố mẹ Đề nghị Cần tiếp tục theo dõi dòng lai dòng đột biến triển vọng để phát triển thành giống Nghiên cứu quy trình trồng, chăm sóc dòng lan lai Dendrobium dòng Dendrobium đột biến thấp Theo dõi, đánh giá dòng lan lai Dendrobium thấp tiềm để tiếp tục chọn lọc Theo dõi tất tổ hợp lai; tìm hiểu quy luật phân ly tính trạng tổ hợp lai Dùng phương thức tiếp cận để phân tích, đánh giá di truyền đặc điểm phân ly tổ hợp lai 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Bài báo khoa học Nguyễn Văn Vinh, Trần Hồng Anh, Bùi Minh Trí, Bùi Văn Lệ, 2017 Đánh giá khả hữu thụ hai mươi tổ hợp lai lan Dendrobium thấp Tạp chí Nông nghiệp & PTNT, chuyên đề Sinh lý thực vật ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao tháng 12 năm 2017, 197-203 Nguyễn Văn Vinh, Nguyễn Quỳnh Như Anh, Bùi Minh Trí, 2017 Ảnh hưởng tỷ lệ ánh sáng đỏ - xanh dương cường độ chiếu sáng từ đèn Led đơn sắc đến hình thành phát triển chồi rễ lan Dendrobium thấp Hội thảo khoa học Sinh Lý Thực Vật toàn quốc, chuyên đề Sinh lý Thực vật ứng dụng Nông nghiệp công nghệ cao lần thứ năm 2017 Nhà xuất Nông nghiệp, 170-176 ISBN: 978604-60-2664-8 Nguyễn Văn Vinh, Bùi Văn Lệ, Bùi Minh Trí, 2017 Ảnh hưởng tỷ lệ ánh sáng đỏ - xanh dương cường độ chiếu sáng từ đèn Led đơn sắc đến hình thành phát triển hạt lan Dendrobium thấp Hội thảo khoa học Sinh Lý Thực Vật toàn quốc, chuyên đề Sinh lý Thực vật ứng dụng Nông nghiệp công nghệ cao lần thứ năm 2017 Nhà xuất Nông nghiệp, 177-183 ISBN: 978-604-60-2664-8 ... chọn tạo giống (Benjamin ctv, 2017; Phan Thanh Kiếm, 2016; Trần Thị Dung, 2010) Đề tài Nghiên cứu tạo dòng lan Dendrobium thấp triển vọng phương pháp lai hữu tính kết hợp chiếu xạ nuôi cấy in vitro ... việc nuôi cấy hạt lan lai tổ hợp lai protocorm sau chiếu xạ với tia gamma 60Co 3.2 Lai tạo hoa lan Dendrobium thấp chọn lọc số dòng lai có triển vọng Trong 20 cặp lai lan Dendrobium thấp nghiên cứu, ... biến, tạo dòng lai dòng lan Dendrobium thấp đột biến có triển vọng, rút ngắn thời gian tạo giống lan Dendrobium thấp Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu khả tạo giống lan Dendrobium thấp