Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài trichosanthes baviensis gagnep (qua lâu ba vì), trichossanthes anguina l (dưa núi) và trichosanthes kirilowii maxim (qua lâu nhân) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hoàng Thị Yến NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI Trichosanthes baviensis Gagnep (QUA LÂU BA VÌ), Trichosanthes anguina L (DƯA NÚI) VÀ Trichosanthes kirilowii Maxim (QUA LÂU NHÂN) Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số : 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019 25 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS VS Châu Văn Minh Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Xuân Nhiệm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Thi Yen, Bui Thi Thuy Luyen, Bui Huu Tai, Pham Van Hoan, Nguyen Phuong Thao, Hoang Le Tuan Anh, Ninh Khac Ban, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Jang Hoon Kim, Jeon Mi Ni and Young Ho Kim Chemical components from the leaves of Trichosanthes baviensis and their tyrosinase inhibitory activity Bulletin of the Korean chemical society, 2015, 36 (2), 703-706 Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Thi Yen, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, SeonJu Park, Nanyoung Kim, and Seung Hyun Kim 1H and 13C NMR assignments of tricanguinas A -B, coumarin monoterpenes from Trichosanthes anguina L Magnetic Resonance in Chemistry, 2014, 53(2), 178-180 Chau Van Minh, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Thi Yen, Phan Van Kiem, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Truong Thi Thu Hien, SeonJu Park, Nanyoung Kim, and Seung Hyun Kim Chemical constituents of Trichosanthes kirilowii and their cytotoxic activities Archives of Pharmacal Research, 2015, 38(8), 14431448 Hoang Thi Yen, Hoang Le Tuan Anh, Duong Thi Hai Yen, Pham Hai Yen, Duong Thi Dung, Do Thi Ha, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen Xuan Nhiem Phenolic glycosides from Trichosanthes baviensis Journal of Medicinal Materials, 2014, 19(5), 283-287 Hoang Thi Yen, Hoang Le Tuan Anh, Dan Thi Thuy Hang, Pham Hai Yen, Pham Thi Trang Tho, Do Thi Ha, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen Xuan Nhiem Megastigmane glycosides from Trichosanthes anguina L Journal of Medicinal Materials, 2014, 19(5), 299-303 24 với IC50 tương ứng 4,1 6,5 µM, mạnh tương đương mitoxantrone (IC50 tương ứng 3,1 8,4 µM) Trên dòng tế bào A549, hợp chất TK5 thể hoạt tính ức chế phát triển mạnh với IC50 2,7 µM, mạnh mitoxantrone (IC50 7,2 µM) Hợp chất TK1, TK6 TK8 thể hoạt tính ức chế yếu với IC50 khoảng 14,7-49,4 µM Các hợp chất TK2 TK3 thể hoạt tính yếu với dòng tế bào A-549 HT-29 Hợp chất TK4 khơng thể hoạt tính nồng độ thử nghiệm MỞ ĐẦU Việt Nam có vị trí địa lý nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu đặc trưng Những yếu tố tạo nên điều kiện sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới rậm, ẩm, thường xanh, thưa, nửa rụng thảm thực vật mang tính cận nhiệt đới khu vực núi cao Theo ước tính nhà thực vật Việt Nam, nước ta có khoảng 12.000 lồi, có khoảng 1/3 tổng số loài nhân dân dùng làm thuốc Rất nhiều lồi số từ xa xưa đến sử dụng y học cổ truyền mục đích khác phục vụ đời sống người mật nhân Eurycoma longifolia, bạc hà Mentha arvensis, khổ qua Momordica charantia, ngũ da bì hương Acanthopanax trifoliatus, đương quy Angelica sinensis, sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis, thìa canh Gymnema sylvestre,… trở nên quen thuộc Ngoài phong phú thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam có giá trị to lớn việc điều trị bệnh khác dân gian Các thuốc sử dụng hình thức độc vị hay phối hợp với tạo nên thuốc cổ phương, tồn phát triển đến ngày Ngoài ra, hàng trăm thuốc khoa học y - dược đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng Trong vài thập kỉ qua, y học cổ truyền cung cấp cho thuốc Tây với 40% tổng loại thuốc Do đó, nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá khoa học loại thuốc truyền thống có nguồn gốc thực vật Trong số loài thực vật kể trên, nhiều loài thuộc chi Qua lâu (Trichosanthes) trồng rộng rãi nhiều loài mọc tự nhiên nước ta nước khu vực Trong dân gian, số loài thuộc chi Qua lâu sử dụng làm rau ăn, số loài sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: làm thuốc giải nhiệt, lợi tiểu, lợi sữa, giảm đường huyết chữa bệnh da, chữa bệnh đau đầu Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi T baviensis, T anguina T kirilowii nhận thấy: Các hợp chất triterpenoid TB6 phân lập từ T baviensis thể hoạt tính ức chế mạnh với enzym tyrosinase Do vậy, cần có nghiên cứu sâu tác dụng làm trắng da hợp chất Hợp chất TK7 phân lập từ T kirilowii thể hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào HT-29 OVCAR Vì vậy, cần có thêm nghiên cứu sâu cấp độ in vivo NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba loài T baviensis, T anguina, T kirilowii Việt Nam Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất 26 hợp chất biết từ ba loài T baviensis, T anguina, T kirilowii Các hợp chất đặt tên là: 9,26-epoxymultiflorenol (TB1), tricanguina A (TA1), tricanguina B (TA2), trichobenzolignan (TK1) Lần hợp chất phân lập từ lồi T baviensis đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 2 23 tính sinh học số lồi thuộc chi Qua lâu (Trichosanthes), tơi lựa chọn tên luận án: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Trichosanthes baviensis Gagnep (Qua lâu Ba Vì), Trichosanthes anguina L (Dưa núi) Trichosanthes kirilowii Maxim (Qua lâu nhân)” Mục tiêu luận án: Xác định thành phần hóa học chủ yếu ba loài T baviensis, T anguina T kirilowii Việt Nam Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học Nội dung luận án bao gồm: Phân lập hợp chất từ ba loài thuộc chi Trichosanthes phương pháp sắc ký Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập phương pháp hoá lý Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hoạt tính ức chế enzym tyrosinase chất phân lập Bố cục luận án - Phần mở đầu: trang (1 → 2) - Tổng quan: 26 trang (3→ 28) - Thực nghiệm kết quả: 22 trang (30 → 51) - Thảo luận kết quả: 65 trang (52 → 116) - Kết luận: trang (118, 119) - Tài liệu tham khảo: 86 tài liệu  hợp chất biết lần phân lập từ chi Trichosanthes: kaemferol 3-O-β-D-glucopyranoside (1→3) O-β-D-glucopyranoside (TA7), corchoionoside B (TA3), icariside B5 (TA4) (3R,9S) 3,9dihydroxymegastigman-5-ene 9-O-β-D-glucopyranoside (TA5), isopentyl 1-O-β-D-glucopyranoside (TA8); hợp chất biết: icariside B1 (TA6) Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi T kirilowii (TK1-TK8), cụ thể:  hợp chất mới: trichobenzolignan (hợp chất lignan) (TK1)  hợp chất biết lần phân lập từ chi Trichosanthes, arvenin I (TK8), ligballinol (TK2) ehletianol C (TK4); hợp chất biết: (-)-pinoresinol (TK3), luteolin-7-O-glucoside (TK5), chrysoeriol-7-O-β-D-glucoside (TK6) 10α-cucurbita-5,24-dien3β-ol (TK7) Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập từ loài T baviensis Kết cho thấy, hợp chất TB6 thể hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh với IC50 3,9 ± 1,5 µM Các hợp chất TB3, TB4 TB10 thể hoạt tính mạnh với IC50 tương ứng 6,9 ± 2,2, 9,5 ± 3,1, 9,3 ± 2,1 µM Các hợp chất TB1, TB2, TB5, TB7, TB8 TB9 thể hoạt tính tương IC50 tương ứng 14,5 ± 3,4, 11,4 ± 2,8, 10,3 ± 2,5, 11,5 ± 4,1, 16,7 ± 2,1, 10,1 ± 3,1 µM Đây lần hợp chất phân lập từ loài T baviensis nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập từ loài T anguina Kết cho thấy hợp chất TA7 có hoạt tính ức chế mạnh chất đối chứng dương kojic acid (IC50 14,6 ± 3,3 µM) với IC50 8,5±3,3 µM Các hợp chất từ TA1 đến TA6 thể hoạt tính yếu với giá trị IC50 khoảng 21,3 đến 46,7 µM Hợp chất TA8 khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư người A549, HT-29, OVCAR MCF-7 hợp chất (TK1 -TK8) Hợp chất triterpenoid TK7 thể hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư mạnh nhất, đặc biệt dòng tế bào HT-29 OVCAR CHƯƠNG TỔNG QUAN Bao gồm phần tổng quan nghiên cứu nước quốc tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thuộc chi Trichosanthes 1.1 Giới thiệu chi Trichosanthes 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Trichosanthes Chi Qua lâu (Trichosanthes) chi lớn họ Bầu bí (Cucurbitaceae), bao gồm khoảng 100 loài nhà 22 Các hợp chất đánh giá khả ức chế phát triển số dòng tế bào ung thư người bao gồm: tế bào ung thư phổi A-549, tế bào ung thư ruột kết HT-29, tế bào ung thư buồng trứng OVCAR tế bào ung thư vú MCF-7 Hợp chất mitoxantrone, hợp chất chống ung thư sử dụng để so sánh Kết nghiên cứu cho thấy, hợp chất triterpenoid TK7 thể hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư mạnh nhất, đặc biệt dòng tế bào HT-29 OVCAR với IC50 tương ứng 4,1 6,5 µM, tương đương mitoxantrone (IC50 tương ứng 3,1 8,4 µM) Trên dòng tế bào A-549, hợp chất TK5 thể hoạt tính ức chế phát triển mạnh với IC50 2,7 µM, mạnh mitoxantrone (IC50 7,2 µM) Hợp chất TK1, TK6 TK8 thể hoạt tính ức chế yếu với IC50 khoảng 14,7-49,4 µM Các hợp chất TK2 TK3 thể hoạt tính yếu với dòng tế bào A-549 HT-29 Hợp chất TK4 khơng thể hoạt tính nồng độ thử nghiệm phù hợp với kết công bố [86] khoa học giới quan tâm Theo thống kê mơ tả sơ GS Phạm Hồng Hộ, Việt Nam có khoảng 12 lồi Trichosanthes có loài đặc hữu Việt Nam qua lâu Ba Vì (T baviensis) qua lâu Pierre (T pierrei) [1] 1.1.2 Tình hình sử dụng y học cổ truyền loài thuộc chi Trichosanthes Một số loài chi Qua lâu (T ovigera Blume, T cucumerina L.) trồng rộng rãi sử dụng làm rau ăn Nhiều loài dùng dân gian làm thuốc giải nhiệt, lợi tiểu, lợi sữa, giảm đường huyết, chữa bệnh ngồi da, bệnh đau đầu, 1.1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học chi Trichosanthes Trong năm gần đây, có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số lồi thuộc chi Trichosanthes Theo cơng trình cơng bố cho thấy, thành phần hóa học chi Trichosanthes, bao gồm nhóm chất như: triterpenoid, steroid, flavonoid, lignan, hợp chất có nitơ số hợp chất khác Trong lớp chất triterpenoid, đặc biệt hợp chất khung cucurbitane hợp chất phổ biến loài thuộc chi Trichosanthes nghiên cứu Các nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu tập trung lồi: T anguina, T cucumerina, T cucumeroides, T dioica, T fructus, T kirilowii, , T pericarpium T tricuspidata Chi tiết tổng quan thành phần hóa học xem Luận án 1.1.3.1 Các hợp chất triterpenoid Theo công trình cơng bố, có 64 hợp chất triterpenoid 1-64 phân lập từ bốn loài T cucumerina, T kirilowii, T tricuspidata, T anguina 1.1.3.2 Các hợp chất steroid Theo cơng trình cơng bố, có 26 hợp chất steroid 65-90 phân lập từ bốn loài T dioica, T kirilowii, T rosthornii T tricuspidata KẾT LUẬN Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học 14 hợp chất (TB1-TB14) từ loài T baviensis, cụ thể:  hợp chất mới: 9,26-epoxymultiflorenol (triterpene) (TB1)  hợp chất biết lần phân lập từ chi Trichosanthes: β-amyrin acetate (TB2), lup-20(29)-en-3β-ol (TB6), ergosta-6,22dien-3β,5α,8α-triol (TB3), nicotiflorin (TB12), (+)-lyoniresinol 9'-Oβ-D-glucopyranoside (TB7), (-)-lyoniresinol 9'-O-β-Dglucopyranoside (TB8), demethoxybergenin (TB9), icariside F2 (TB11); hợp chất biết: spinasterol (TB4), 4α,14α-dimethyl9,19-cyclo-5α,9β-ergost-24(28)-en-3β-ol (TB5), bergenin (TB10), (6S,9S)-roseoside (TB13) thymidine (TB14) Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ loài T anguina (TA1-TA8), cụ thể:  hợp chất mới: tricanguina A (TA1) tricanguina B (TA2) (dẫn xuất coumarin) 4 21 1.1.3.3 Các hợp chất flavonoid Theo cơng trình cơng bố, có 20 hợp chất flavonoid 91-110 phân lập từ loài T kirilowii T pericarpium 1.1.3.4 Các hợp chất lignan Theo cơng trình cơng bố, có hợp chất lignan 110114 phân lập từ loài T kirilowii 1.1.3.5 Các hợp chất có chứa nitơ Theo cơng trình cơng bố, có 17 hợp chất có chứa nitơ 115-131 phân lập từ loài T kirilowii 1.1.4 Hoạt tính sinh học chi Trichosanthes Các nghiên cứu giới chủ yếu tập trung vào loài thuộc chi Trichosanthes cho thấy hợp chất phân lập từ lồi thuộc chi Trichosanthes có hoạt tính mạnh Một số hoạt tính đáng quan tâm gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hố …trong đó, bật hoạt tính gây độc tế bào ung thư với khả ức chế mạnh nhiều dòng tế bào ung thư khác 1.1.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1.1.4.2 Hoạt tính kháng viêm 1.1.4.3 Tác dụng chống oxy hóa 1.1.4.4 Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm Chi tiết tổng quan hoạt tính sinh học xem Luận án 1.1.5 Tình hình nghiên cứu chi Trichosanthes Việt Nam Theo tài liệu cơng bố, chi Trichosanthes Việt Nam có lồi T kirilowii T tricuspidata nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học 1.2 Giới thiệu loài T baviensis, T anguina T kirilowii 1.2.1 Loài T baviensis 1.2.2 Loài T anguina 1.2.3 Loài T kirilowii triển vọng ứng dụng ngành công nghiệp mỹ phẩm, bảo vệ da khỏi tác nhân bên ngồi mơi trường Các kết nghiên cứu góp phần đưa đến hội ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh có liên quan rối loạn sắc tố da 3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài T kirilowii Theo nghiên cứu trước đây, hợp chất phân lập từ loài T kirilowii thể nhiều hoạt tính lý thú đặc biệt hoạt tính gây độc tế bào ung thư Các nghiên cứu dòng tế bào ung thư công bố bao gồm: A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498, HCT-15, UO31, CCRF-CEM, SR, NCI-H460, NCI-H522, HCT-116, U251, OVCAR-3, OVCAR-6, SN12C, SK-Mel-2, B16F1, ung thư vú (SRBR-3, MCF-7, T47D MDA-MB-435), ung thư ruột kết (Caco-2) [4], [14], [37] Trong số hợp chất phân lập từ loài T kirilowii, hợp chất karounidiol (45) thể hoạt tính mạnh nhiều dòng ung thư ức chế ung thư biểu mô tế bào thận (UO-31 với IC50 1,98 μM), bệnh bạch cầu (CCRF-CEM với giá trị IC50 1,63 μM; SR (CRL-2262) với giá trị IC50 1,75 μM), ung thư phổi (A549 với giá trị IC50 1,76 μM; NCI-H460 với giá trị IC50 1,91 μM, NCI-H522 với giá trị IC50 3,56 μM), ung thư đại tràng (HCT-116 với giá trị IC50 2,01 μM), ung thư thần kinh trung ương (U251 với giá trị IC50 2,02 μM), ung thư buồng trứng (OVCAR-3 với giá trị IC50 1,79 μM; OVCAR-6 với giá trị IC50 2,06 μM) ung thư thận (SN12C với giá trị IC50 2,36 μM) [14] Theo công bố khác, hợp chất isoetin 5'-methyl ether (93) phân lập năm 2007 thể khả ức chế dòng tế bào ung thư phổi A-549, ung thư da ác tính SK-Mel-2 tế bào ung thư chuột ác tính B16F1 với giá trị IC50 0,92, 8,00, 7,23 µg/mL [29] Trong số hợp chất phân lập (TK1-TK8) từ loài T kirilowii, trichobenzolignan (TK1) hợp chất mới, ligballinol (TK2), ehletianol C (TK4) arvenin I (TK8) lần phân lập từ loài Các tra cứu hợp chất TK6, TK7 TK8 cho thấy chưa có đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư 20 Nghiên cứu Khan cộng vào 2005 phân lập tám hợp chất cycloartane triterpenoid tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase Kết qủa cho thấy bảy số tám chất có khả ức chế tốt chất đối chứng kojic acid (IC50 = 16,67±0,52); chất có hoạt tính mạnh, IC50 = 1,32 ± 0,37 [84] Năm 2014, Khan cộng phân lập chất βamyrin acetate (TB2) từ loài Madhuca latifolia tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase Kết qủa cho giá trị IC50 = 23,12±0,07 [85] Trong công bố Park cộng năm 2017, hợp phần bergenin số mỹ phẩm có khả ức chế phát triển enzym tyrosinase Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học lồi T Baviensis-một lồi đặc hữu Việt Nam, cho thấy tất hợp chất thể hoạt tính ức chế mạnh enzym tyrosinase Các hợp chất nghiên cứu có hoạt tính ức chế mạnh chất đối chứng dương kojic acid (IC50 14,6 ± 3,3 µM) Cụ thể: hợp chất TB6 thể hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh với IC50 3,9 ± 1,5 µM Các hợp chất TB3, TB4 TB10 thể hoạt tính yếu với IC50 tương ứng 6,9 ± 2,2, 9,5 ± 3,1, 9,3 ± 2,1 µM Các hợp chất TB1, TB2, TB5, TB7, TB8 TB9 thể hoạt tính yếu với IC50 tương ứng 14,5 ± 3,4, 11,4 ± 2,8, 10,3 ± 2,5, 11,5 ± 4,1, 16,7 ± 2,1, 10,1 ± 3,1 µM Đây lần hợp chất phân lập từ loài T baviensis nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase Kết nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập từ loài T anguina, cho thấy hợp chất TA7 có hoạt tính ức chế mạnh chất đối chứng dương kojic acid (IC50 14,6 ± 3,3 µM) với IC50 8,5±3,3 µM Các hợp chất từ TA1 đến TA6 thể hoạt tính yếu với giá trị IC50 khoảng 21,3 đến 46,7 µM Hợp chất TA8 khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Các hợp chất phân lập từ loài T baviensis thể hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh gợi mở hướng nghiên cứu, chế tác dụng hoạt tính ức chế enzym tyrosinase lồi T baviensis Vì cần thiết có nghiên cứu in vivo nhằm nâng cao CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu Thân T baviensis thu Ba Vì, Hà Nội, Việt Nam (mẫu tiêu NCCT-TB1109); thân T anguina thu Hòa Bình, Việt Nam (mẫu tiêu NCCT-TA1308); rễ củ T kirilowii thu Hòa Bình, Việt Nam (mẫu tiêu NCCT-TK1209) Tên khoa học mẫu giám định PGS TS Ninh Khắc Bản, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Cả mẫu tiêu lưu trữ Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 2.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.2.1.2 Sắc ký cột (CC) 2.2.1.3 Tinh chế hợp chất 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học hợp chất xác định sở sử dụng phép xác định thông số vật lý phương pháp đo phổ thiết bị đại đồng thời kết hợp với phân tích tra cứu tài liệu tham khảo 2.2.2.1 Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) 2.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) 2.2.2.3 Phổ lưỡng sắc tròn (CD) 2.2.2.4 Độ quay cực ([α]) 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase 2.3 Phân lập hợp chất 2.3.1 Các hợp chất phân lập từ lồi T baviensis 19 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài T baviensis 2.3.2 Các hợp chất phân lập từ lồi T anguina Hình 3.65 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi T kirilowii Hình 1.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài T anguina 3.2 Hoạt tính hợp chất phân lập 3.2.1 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập từ T baviensis T anguina Các vấn đề sắc tố da thường gây nhiều áp lực mặt thẩm mỹ, đặc biệt phụ nữ Ức chế enzym tyrosinase làm hạn chế việc sản sinh nhiều sắc tố melanin từ giúp điều trị rối loạn liên quan đến tăng sắc tố da Việc nghiên cứu, điều chế sản phẩm từ thiên nhiên có tác dụng ức chế enzym có ý nghĩa lớn khoa học y dược mỹ phẩm Thành phần sản phẩm thường chứa số hợp chất flavonoid, phenolic, polyphenolic, chalcol, stilbene kojic acid [82] Tuy nhiên số hợp chất phenolic hydroquinone artbutin thường có mặt sản phẩm làm trắng da khơng an tồn hiệu sử dụng [83] 18 2.3.3 Các hợp chất phân lập từ lồi T kirilowii Hình2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ lồi T kirilowii 2.4 Thơng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập 2.5 Kết đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất 2.5.1 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase hợp chất phân lập từ T baviensis T anguina Bảng 2.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase TB1-TB10 Hình 3.64 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài T anguina Hợp chất TB1 TB2 TB3 TB4 TB5 TB6 TB7 TB8 TB9 TB10 Kojic acid IC50 (μM) 14,5 ± 3,4 11,4 ± 2,8 6,9 ± 2,2 9,5 ± 3,1 10,3 ± 2,5 3,9 ± 1,5 11,5 ± 4,1 16,7 ± 2,1 10,1 ± 3,1 9,3 ± 2,1 14,6 ± 3,3 17 Bảng 2.2 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase TA1-TA8 Hợp chất TA1 TA2 TA3 TA4 TA5 TA6 TA7 TA8 Kojic acid IC50 (μM) 21,3 ± 2,8 36,8±2,6 33,9±3,1 42,2±3,6 46,7±2,0 22,7±1,4 8,5±3,3 >100 14,6 ± 3,3 2.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ T kirilowii Bảng 2.3 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư TK1-TK8 IC50 (µM) Hợp chất A-549 HT-29 OVCAR MCF-7 36,4 16,2 21,6 26,5 TK1 >100 45,5 >100 >100 TK2 52,4 60,9 >100 >100 TK3 >100 >100 >100 >100 TK4 2,7 16,0 14,5 32,7 TK5 21,1 40,7 32,1 15,8 TK6 11,3 4,1 6,5 17,3 TK7 17,0 49,4 14,7 42,8 TK8 3,1 8,4 10,3 Mitoxantrone 7,2 Danh sách hợp chất phân lập từ loài thuộc chi Trichosanthes Tổng số có 30 hợp chất phân lập từ loài T baviensis, T anguina T kirilowii, có: 30 29 20 27 25 17 18 11 28 14 10 OH O 26 HO AcO 24 23 HO TB1 TB4 HO TB2 HO OH TB5 TB3 HO TB6 H3CO H3CO OH OH OH OGlc OGlc OH HO HO OCH3 OCH3 O OH R H OH H O H3CO OCH3 OH TB7 H3CO OCH3 OH TB8 HO O TB R=H TB10 R=OMe Hình 3.63 Cấu trúc hóa học 14 hợp chất phân lập từ loài T baviensis 16 Tương tác HMBC H-7 (δH 5,46) C-1 (δC 134,2)/ C-2/C6 (δC 128,2)/ C-3' (δC 131,5)/ C-4' (δC 161,0); H-2/H-6 (δH 7,16) C-1 (δC 134,2)/ C-4 (δC 158,5)/ C-7 (δC 88,7) gợi ý vị trí nhóm p-hydroxyphenyl C-7 Tương tác HMBC H-7' (δH 6,54) C1' (δC 129,5)/ C-2' (δC 123,7)/ C-6' (δC 128,7)/ C-8' (δC 127,0)/ C-9' (δC 63,9) gợi ý vị trí liên kết đơi C-7'/C-8' nhóm hydroxy C9' Cấu hình liên kết đôi C-7'/C-8' xác định E dựa số tương tác H-7' H-8', JH-7′-H-8′ = 16,0 Hz Hằng số tương tác H-7 H-8 lớn (JH-7-H-8 = 6,0 Hz) xác định hai proton C-7 C-8 vị trí trans Để khẳng định xác cấu hình tuyệt đối TK1 C-7 C-8, phổ CD đo so sánh với phổ CD hợp chất có cấu tương tự Cụ thể, hiệu ứng Cotton âm bước sóng λ = 244 nm (Δε: -4,3) hiệu ứng Cotton dương bước sóng λ = 222 nm (Δε: +2,6) phổ CD hợp chất TK1 cho phép xác định tuyết đối cấu hình C-7 C-8 7R 8S cách so sánh với phổ CD hợp chất cupressoside B (hiệu ứng Cotton âm bước sóng λ = 238 nm hiệu ứng Cotton dương bước sóng λ = 221 nm) [75] Dựa vào chứng phổ nêu so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hợp chất TK1 xác định đặt tên trichobenzolignan CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 3.1.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài T baviensis 3.1.1.1 Hợp chất TB1: 9,26-epoxymultiflorenol (mới) Hình 3.49 Các tương tác HMBC TK1 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học TB1 hợp chất tham khảo TB1a Hợp chất TB1 thu dạng rắn không màu Trên phổ HR-ESI-MS TB1 xuất pic ion giả phân tử m/z 463,3536 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C30H48O2Na]+, 463,3547) cho phép kết luận công thức phân tử TB1 xác định C30H48O2 Phổ 1H-NMR TB1 xuất tín hiệu proton olefin δH 5,25 (1H, dd, J = 2,4, 4,8 Hz); proton oxymethine δH 3,21 (1H, dd, J = 5,4, 9,0 Hz); hai proton oxymethylene δH 3,25 (1H, d, J = 7,8 Hz) 4,52 (1H, d, J = 7,8 Hz); bảy nhóm methyl δH 0,84 (3H, s), 0,90 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,95 (6H, s) 1,02 (3H, s) Phổ 13C-NMR hợp chất TB1 xuất tín hiệu cộng hưởng 30 carbon, bao gồm: tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 28,8, 32,2, 38,4, 39,0, 40,3, 49,0, 85,8 143,7; bốn carbon methine δC 45,1, 45,5, 79,3 113,3; mười carbon methylene δC 22,0, 23,5, 27,2, 30,3, 30,8, 33,3, 34,6, 36,1, 36,2, 36,3 78,1; bảy carbon methyl δC 14,5, 15,4, 19,7, 28,3, 29,1, 31,7 33,5 Từ phân tích liệu phổ 1H, 13C-NMR dự đốn hợp chất TB1 triterpene khung multiflorane, tương tự hợp chất multiflorenol (TB1a) [56], ngoại trừ đóng vòng qua cầu oxy C9/C-26 Các tương tác HMBC từ H-23 (δH 1,02)/H-24 (δH 0,93) tới C-3 10 15 (δC 79,3)/ C-4 (δC 39,0)/ C-5 (δC 45,1) gợi ý vị trí nhóm hydroxy C-3 nhóm methyl C-4 Cấu hình β nhóm hydroxy C3 xác định dựa số tương tác, JH-2β/H-3 = 9,0 Hz, JH-2α/H-3 = 5,4 Hz so sánh độ dịch chuyển hóa học phổ 13C-NMR C3 (δC 79,3), C-4 (δC 39,0) hợp chất TB1 với hợp chất 3βhydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 78,8), C-4 (δC 38,9)] hợp chất 3α-hydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 76,2), C-4 (δC 37,2) ] [57] Tương tác HMBC H-25 (δH 0,90) C-1 (δC 30,8)/ C-5 (δC 45,1)/ C-9 (δC 85,8)/ C-10 (δC 38,4); H-28 (δH 0,94) C-16 (δC 34,6)/ C-18 (δC 45,5)/ C-22 (δC 36,2) gợi ý vị trí nhóm methyl C-10 C-17 Tương tác HMBC H-29 (δH 0,95) C-21 (δC 33,3)/ C30 (δC 31,7); H-30 C-19 (δC 36,1)/ C-29 (δC 33,5) gợi ý nhóm methyl C-20 Tương tác HMBC H-26 (δH 3,25/ 4,52) C-8 (δC 143,7)/ C-9 (δC 85,8)/ C-13 (δC 40,3)/ C-14 (δC 49,0)/ C-15 (δC 22,0) gợi ý vị trí liên kết đơi C-7/C-8 cầu oxy C-9/C-26 Trên phổ NOESY thấy xuất tương tác Hβ-6 (δH 2,07) với H-24 (δH 0,93) H-25 (δH 0,90), H-25 (δH 0,90) tương tác với Ha-26 (δH 3,25), Hb-26 (δH 4,52) tương tác với H-18 (δH 1,55) H-28 (δH 0,94) xác định cấu hình β vị trí H-24, Me-10, Me-14, H-18 Me-28 Tương tác NOESY H-23 (δH 1,02) với H-3 (δH 3,21) H-5 (δH 1,47), Hα-15 (δH 1,87) với H-27 (δH 0,84) cho phép xác định cấu hình H-3, Me(23)-4, H-5 Me-13 α Dựa vào liệu phổ trên, cấu trúc hợp chất TB1 xác định Đây hợp chất xác định 9,26-epoxymultiflorenol thơm para AA′BB′ δH 6,73 (2H, d, J = 8,0 Hz) 7,16 (2H, d, J = 8,0 Hz); ba proton thơm hệ ABX δH 6,72 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 8,0 Hz) 7,34 (1H, s); hai proton olefin δH 6,20 (1H, dt, J = 6,0, 16,0 Hz) 6,54 (1H, d, J = 16,0 Hz) Phổ 13C-NMR hợp chất TK1 xuất tín hiệu cộng hưởng 18 carbon, bao gồm: năm carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 129,5, 131,5, 134,2, 158,5, 161,0; mười carbon methine δC 54,7, 88,7, 110,0, 116,3 (2C), 123,8, 127,0, 128,2 (2C), 128,7, 132,0; hai carbon oxymethylene δC 63,9 65,1 Từ phân tích số liệu phổ 1H 13C-NMR TK1 cho thấy cấu trúc TK1 có khung dihydrobenzofuran, giống với cupressoside B (TK1a) [75] ngoại trừ vắng mặt nhóm propyl C-1' đơn vị đường C-4 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR TK1 phần cấu trúc tham khảo C δCa,# δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 128,6 134,2 2, 127,9 128,2 7,16 (d, 8,0) 3, 117,8 116,3 6,73 (d, 8,0) 158,7 158,5 87,9 88,7 5,46 (d, 6,0) 55,2 54,7 3,43 (m) 65,3 65,1 3,80 (m) 1' 135,7 129,5 2' 125,9 123,7 7,34 (s) 3' 137,7 131,5 4' 159,4 161,0 5' 109,8 110,0 6,72 (d, 8,0) 6' 129,7 128,7 7,20 (d, 8,0) 7' 132,0 6,54 (d, 16,0) 8' 127,0 6,20 (dt, 6,0, 16,0) 9' 63,9 4,18 (d, 6,0) a Hình 3.2 Các tương tác HMBC, COSY NOE TB1 Đo CD3OD, b100 MHz, c400 MHz, #δC cupressoside B (TK1a)[75] 14 11 Hiệu ứng Cotton dương bước sóng λ = 278 nm (Δε: + 8.05) phổ CD hợp chất TA1 cho phép xác định tuyết đối cấu hình C-3’ R cách so sánh với phổ CD hợp chất (S)-3methylhexane-2,5-dione (hiệu ứng Cotton âm λ = 280 nm) [69] Dựa vào liệu phổ trên, cấu trúc hợp chất TA1 xác định Đây hợp chất đặt tên tricanguina A Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất TB1 Hình 3.25 Phổ CD TA1 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài T kirilowii 3.1.3.1 Hợp chất TK1: trichobenzolignan (mới) HO GlcO O O 4' 1' 3' 7' 9' OH TK1 OH OH OH TK1a Hình 3.48 Cấu trúc hóa học TK1 hợp chất tham khảo Hợp chất TK1 thu dạng bột vơ định hình màu trắng Trên phổ HR-EI-MS TK1 xuất pic ion giả phân tử m/z 321,1098 (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C18H18O4Na]+, 321,1103) cho phép kết luận công thức phân tử TK1 C18H18O4 Phổ 1H-NMR TK1 xuất tín hiệu bốn proton thuộc vòng C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 30,8 1,43 (m)/1,63 (m) 27,2 1,65 (m) 79,3 3,21 (dd, 5,4, 9,0) 39,0 45,1 1,47 (m) 23,5 2,07 (ddd, 2,4, 10,8, 18,0)/2,16 (dt, 4,8, 18,0) 113,3 5,25 (dd, 2,4, 4,8) 143,7 85,8 38,4 30,3 1,55 (m)/1,79 (dd, 4,2, 6,0) 36,3 1,45 (m)/1,56 (m) 40,3 49,0 22,0 1,25 (m)/1,87 (ddd, 4,2, 7,8, 14,4) 34,6 1,17 (m)/1,53 (m) 32,2 45,5 1,55 (m) 36,1 1,16 (dd, 10,2, 13,8)/1,32 (dd, 6,0, 13,8) 28,8 33,3 1,24 (m)/1,43 (m) 36,2 0,87 (m)/1,43 (m) 28,3 1,02 (s) 15,4 0,93 (s) 14,5 0,90 (s) 78,1 3,25 (d, 7,8)/4,52 (d, 7,8) 19,7 0,84 (s) 29,1 0,94 (s) 33,5 0,95 (s) 31,7 0,95 (s) a Đo CDCl3, b150 MHz, c600 MHz 12 13 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài T anguina trên, chứng tỏ TA1 cấu tạo đơn vị 6,7-dimethoxy-8hydroxycoumarin monoterpene 3.1.2.1 Hợp chất TA1: tricanguina A (mới) Hình 3.23 Cấu trúc hóa học TA1 hợp chất tham khảo Hợp chất TA1 thu dạng bột không màu Trên phổ HR-ESI-MS TA1 xuất pic ion giả phân tử m/z 389,1578 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C21H25O7]+, 389,1595) cho phép kết luận công thức phân tử TA1 C21H24O7 Phổ 1HNMR TA1 xuất tín hiệu ba proton olefin δH 6,16 (1H, s), 6,35 (1H, d, J = 9,6 Hz); 7,89 (1H, d, J = 9,6 Hz); proton thơm δH 7,00 (1H, s); hai nhóm methoxy δH 3,89 (3H, s) 3,99 (3H, s); hai nhóm methyl δH 1,90 (3H, s) 2,09 (3H, s); nhóm methyl δH 1,15 (3H, d, J = 6,4 Hz) Phổ 13C-NMR hợp chất TA1 xuất tín hiệu cộng hưởng 21 carbon, bao gồm: ba carbon carbonyl δC 162,8, 200,7 211,6; sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 116,5, 141,8, 144,0, 145,7, 151,4, 157,4; năm carbon methine δC 38,7, 105,9, 115,7, 124,3, 146,0; hai carbon methylene δC 48,5 77,7; carbon methyl δC 16,8, 21,0, 28,0, 57,0 62,6 Phân tích số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất TA1 cho thấy cấu trúc hợp chất giống với hợp chất 6,7-dimethoxy-8-(2,3-dihydroxy-3-methylbutoxy) coumarin (TA1a) [68] ngoại trừ xuất thêm tín hiệu monoterpene C-8 Tương tác HMBC H-4 C-2/C-3/C-5/C-9/C-10; số tương tác JH-2/H-3 = 9,6 Hz chứng tỏ có mặt vòng courmarin với liên kết đơi C-3/C-4 Thêm vào đó, tương tác HMBC từ hai nhóm methoxy (δH 3,89 3,99) đến C-6 (δC 151,4)/ C-7 (δC 141,8) gợi ý vị trí hai nhóm methoxy C-6 C-7 Từ chứng Hình 3.24 Các tương tác HMBC COSY TA1 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR hợp chất TA1 C δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 162,8 115,7 6,35 (d, 9,6) 146,0 7,89 (d, 9,6) 105,9 7,00 (s) 151,4 141,8 145,7 144,0 10 116,5 6-OCH3 57,0 3,89 (s) 7-OCH3 62,6 3,99 (s) 1' 77,7 4,98 (s) 2' 211,6 3' 38,7 3,25 (m) 4' 48,5 2,62 (dd, 4,4, 17,6) 3,00 (dd, 9,2, 17,6) 5' 200,7 6' 124,3 6,16 (s) 7' 157,4 8' 28,0 1,90 (s) 9' 21,0 2,09 (s) 10' 16,8 1,15 (d, 6,4) a Đo CD3OD, b100 MHz, c400 MHz ... Gagnep (Qua l u Ba Vì), Trichosanthes anguina L (Dưa núi) Trichosanthes kirilowii Maxim (Qua l u nhân) Mục tiêu luận án: Xác định thành phần hóa học chủ yếu ba l i T baviensis, T anguina T kirilowii. .. MỚI CỦA LUẬN ÁN L n nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba l i T baviensis, T anguina, T kirilowii Việt Nam Đã phân l p xác định cấu trúc hóa học hợp chất 26 hợp chất biết từ ba loài. .. giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 2 23 tính sinh học số l i thuộc chi Qua l u (Trichosanthes) , l a chọn tên luận án: ‘ Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học l i Trichosanthes baviensis