NGHIÊN cứu kỷ cúc địa HOÀNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẶC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CAO ĐẶC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới: Đầu tiên xin cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng sau đại học, tồn thể thầy tận tình dạy bảo tơi suốt tháng năm học trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người thầy tận tụy, luôn bảo hướng dẫn, định hướng, tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài, hoàn thành luận văn Tơi xin cảm ơn tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược cổ truyền, ln giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Đặng Thị Khánh Huyền, sinh viên Nim Phanakhone khóa 69 sinh viên khóa 69, 70 – Trường Đại học Dược Hà Nội làm đề tài môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội chia sẻ giúp đỡ thời gian nghiên cứu thực luận văn Tôi xin cám ơn Công ty cổ phần VCP Công ty cổ phần Dược phẩm Quốc tế cung cấp nguyên liệu, chất chuẩn, hỗ trợ kinh phí giúp thực đề tài Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè tồn thể đồng nghiệp trường Cao đẳng Dược Hải Dương ủng hộ, động viên, giúp đỡ trong suốt trình thực luận văn Do kiến thức thân giới hạn, nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiều xót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa q thầy cơ, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2019 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ PHƯƠNG THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG .3 1.2 CÁC VỊ THUỐC TRONG PHƯƠNG THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG 1.2.1 Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) .6 1.2.2 Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) .11 1.2.3 Sơn thù (Fructus Corni officinalis) 13 1.2.4 Đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) 17 1.2.5 Bạch linh (Poria) .19 1.2.6 Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) .20 1.2.7 Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 22 1.2.8 Cúc hoa (Flos Chrysanthemi indici) 24 1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN CỦA CAO THUỐC .25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .27 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu .27 2.1.2.Phương tiện nghiên cứu 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.2.1 Nghiên cứu điều chế cao đặc 29 2.2.2 Xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc 31 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .37 3.1 BÀO CHẾ CAO ĐẶC 37 3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO ĐẶC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG 38 3.2.1 Khảo sát tiêu vật lý 38 3.2.2 Xác định pH .38 3.2.4 Khảo sát tiêu định tính .39 3.2.5 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng HPLC .49 CHƯƠNG BÀN LUẬN .58 4.1 VỀ ĐIỀU CHẾ DẠNG CAO ĐẶC 58 4.2 ĐỊNH TÍNH CÁC NHĨM CHẤT TRONG CAO 59 4.2.1 Định tính phản ứng hóa học 59 4.2.2 Định tính sắc ký lớp mỏng 60 4.3 ĐỊNH LƯỢNG 61 4.3.1 Về khảo sát lựa chọn chất chuẩn định lượng 61 4.3.2 Về khảo sát thẩm định 61 4.3.3 Về kết định lượng loganin cao đặc Kỷ cúc địa hoàng .62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 KẾT LUẬN 63 Kiến nghị .64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh suy giảm chức gan, thận bệnh mãn tính ngày phổ biến Chức gan, thận suy giảm làm tăng nguy ung thư gan Theo số liệu thống kê hội gan mật Việt Nam năm 2018, năm có vạn người chết biến chứng xơ gan giai đoạn nặng ung thư gan Bệnh lý gan, thận gây rối loạn thị lực số bệnh lý mắt mờ mắt, chảy nước mắt, Đặc biệt mơi trường nhiễm bụi, khói, sinh hoạt chưa hợp lý vấn đề mắt dễ xảy Trong lý luận Y học cổ truyền, can khai khiếu mắt: khí can tốt thị lực tốt, ngược lại mắt mờ, thị lực suy giảm, nhìn vào mắt biết trạng thái can Can thận âm hư hai mắt hoa mờ, khơng nhìn rõ vật, lòng mắt khơ sáp gặp gió chảy nước mắt Bài thuốc Kỷ cúc địa hồng có chứa tám loại thảo dược sử dụng để làm giảm triệu chứng hoa mắt, chóng mặt can thận âm hư từ hàng ngàn năm Từ quan điểm y học cổ truyền, người ta tin chế Kỷ cúc địa hồng liên quan đến việc bổ can thận âm, sáng mắt, điều hòa hoạt động can, thận Ngoài ra, thuốc Kỷ cúc địa hoàng làm giảm triệu chứng hoa mắt, chóng mặt tăng huyết áp, dùng phối hợp với thuốc tăng huyết áp để điều trị bệnh tăng huyết áp nguyên phát không rõ nguyên nhân Tăng huyết áp nguy hàng đầu cho bệnh tim mạch – nguyên nhân hàng đầu gây tử vong năm 2020 [58] Về mặt tác dụng dược lý, Kỷ cúc địa hồng có hiệu tốt việc làm giảm nồng độ angiotensin huyết tương tim, làm giảm hàm lượng endothelin cải thiện dòng máu thận chuột bị tăng huyết áp [19] Cách sử dụng thông thường thuốc phương pháp sắc Phương pháp sử dụng từ hàng ngàn năm phổ biến sống thường ngày Khi sử dụng thuốc sắc có nhược điểm tốn nhiều thời gian để nấu thuốc, sau nấu xong phải sử dụng Bởi tiến hành nghiên cứu điều chế dạng cao đặc thuốc để khắc phục nhược điểm dạng thuốc truyền thống Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng nghiên cứu dạng viên hoàn, viên nang quy định Dược điển Trung quốc [53] Tuy nhiên dạng cao đặc thuốc chưa có chứng khoa học chứng minh cách đầy đủ quy trình bào chế cao đặc thuốc tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng cao đặc Việt Nam Với dạng bán thành phẩm cao đặc, thuốc Kỷ cúc địa hồng tiếp tục phát triển dạng thuốc khác cách dễ dàng hơn: dạng viên nén, viên nang….Xuất phát từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu điều chế xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng” thực nhằm giải hai mục tiêu sau: - Nghiên cứu điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng - Xây dựng số tiêu chuẩn định tính, định lượng dạng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng * Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng bao gồm vị thuốc sau: Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) Sơn thù (Fructus Corni officinalis) Đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) Bạch linh (Poria) Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) Câu kỷ tử (Fructus Lycii) Cúc hoa (Flos Chrysanthemi indici) * Công năng: Bổ thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt [19] 24g 12g 12g 9g 9g 9g 9g 9g * Chủ trị: Thận âm hư, hư hỏa bốc lên, cổ lưng đầu gối đau mỏi, đầu đau, mắt hoa, choáng váng, tai ù, hay mồ hôi trộm, tăng huyết áp [3], [19] * Xuất sứ thuốc : Kỷ cúc địa hoàng hồn trích từ «Tiểu Nhi Dược Chứng Trực Quyết» Bài bắt nguồn từ thuốc cổ phương «Lục vị địa hoàng hoàn» gia vị Câu kỷ tử, Cúc hoa thành thuốc «Kỷ cúc địa hồng hồn» [3], [19] * Phân tích ý nghĩa thuốc theo YHCT: Bài thuốc Kỷ cúc địa hồng khơng chữa thận âm hư mà chữa can thận bất túc Thục địa có tác dụng bổ thận thủy, Trạch tả giúp tuyên tiết chất trọc thận, Sơn thù để ơn sáp can có Đơn bì để tả can hỏa, Hoài sơn thu nhiếp tỳ kinh lại có Bạch phục linh thẩm thấp điều hòa Bài thuốc có sáu vị mà có mở có đóng chữa can thận bất túc với mục đích thuốc bổ Trên sở thuốc tác giả thời xưa gia thêm vị Câu kỷ tử Cúc hoa để tạo thành thuốc Kỷ cúc địa hồng có tác dụng nâng cao hiệu chữa can thận suy mắt hoa, nhìn mờ, chân tay buồn bực, người khó chịu Cúc hoa có tác dụng tân lương giải biểu đồng thời làm cho mắt sáng, Câu kỷ tử có tác dụng bổ dưỡng can thận, khí huyết [3], [19] Theo quan điểm y học cổ truyền, mắt có quan hệ trực tiếp với tạng phủ, tinh khí lục phủ ngũ tạng dồn lên mắt mà thành tinh hoa Mắt khiếu can, can tàng huyết, mắt nhờ huyết thấy Nếu can huyết không đủ mắt tối, hoa, nặng sinh chứng quáng gà, mờ mắt Theo học thuyết ngũ hành, can thuộc mộc, thận thuộc thủy, thủy sinh mộc nên can mộc sinh từ thận thủy Khi thận thủy suy lâu ngày can mộc khơng ni dưỡng đầy đủ nên can huyết, can âm dần khô kiệt Vả lại cổ nhân có câu «ất q đồng ngun, can thận đồng trị» Vậy nên theo y học cổ truyền, để điều trị bệnh mắt, phòng chống lão hóa bảo vệ mắt thiết phải trọng bồi bổ thận âm can âm Với cấu trúc gồm thuốc Lục vị địa hồng có cơng tư bổ can thận, gia thêm Kỷ tử để tăng tư bổ can thận, sinh tinh minh mục cúc hoa để tán phong nhiệt, can minh mục để giải độc Kỷ cúc địa hoàng thực phương thuốc thích hợp cho việc phòng chống bệnh nhãn khoa [3], [19] * Thành phần hóa học: Kết nghiên cứu đại cho thấy Kỷ cúc địa hồng có thành phần: Caroten vitamin A chất chống oxy hóa mạnh, có vai trò bảo vệ chống thối hóa hồng điểm tuổi già Vitamin C chất chống oxy hóa mạnh lọc tia tử ngoại làm hạn chế tác động có hại chúng lên vùng mắt Vitamin B2 giúp giác mạc nhận ánh sáng, giúp tổng hợp glutathion có tác dụng ngăn ngừa q trình oxy hóa mắt Vitamin B12 cải thiện phòng ngừa giảm thị lực bệnh nhân bị glaucom, ngăn ngừa thoái hoá bao myelin dây thần kinh thị giác Linoleic axit (omega-6) chất dẫn truyền xung động thần kinh võng mạc, ngăn ngừa thối hố hồng điểm tuổi già Cholin lecithin chất dẫn truyền xung động thần kinh, giúp truyền dẫn xung động thần kinh từ võng mạc lên não [19], [48] * Tác dụng sinh học Kỷ cúc địa hoàng thuốc gồm tám loại thảo dược mô tả Dược điển Trung Quốc để điều trị nhiều loại bệnh rối loạn chức gan, thận biểu triệu chứng hoa mắt, chóng mặt [53] Về mặt sinh hóa, Kỷ cúc địa hoàng cho thấy hiệu rõ rệt việc giảm nồng độ angiotensin huyết tương tim, làm giảm hàm lượng endothelin cải thiện dòng máu thận chuột bị tăng huyết áp [19] Các nghiên cứu gần Kỷ cúc địa hoàng giúp kiểm sốt huyết áp [62] Nghiên cứu thống kê năm 2010 thử nghiệm ngẫu nhiên có kiểm sốt hiệu độ an tồn Kỷ cúc địa hoàng điều trị tăng huyết áp cần thiết (bao gồm 10 thử nghiệm ngẫu nhiên với 1024 bệnh nhân) cho thấy Kỷ cúc địa hoàng kết hợp với thuốc hạ huyết áp có hiệu việc hạ thấp huyết áp cải thiện điều trị tăng huyết áp đơn Khơng có thử nghiệm báo cáo tác dụng phụ nghiêm trọng liên quan đến sử dụng Kỷ cúc địa hoàng [35] Kết nghiên cứu dược lý đại cho thấy, thực nghiệm Kỷ cúc Địa hồng có tác dụng tăng cường miễn dịch, nâng cao lực tế bào lympho T B, kích thích hình thành kháng thể, chống mệt mỏi, nâng cao sức chịu đựng thể điều kiện thiếu oxy, chống lão hố, tăng trí nhớ, chống viêm, kháng khuẩn (ức chế nhiều loại trực khuẩn cầu khuẩn) bảo hộ tế bào gan thận, chống ngưng huyết, thúc đẩy trình tạo hồng cầu, cải thiện tuần hoàn não, làm giảm cholesterol triglycerit máu, hạ huyết áp, tăng cường thị lực chống ung thư [48] * Nghiên cứu đánh giá chất lượng thuốc Kỷ cúc địa hoàng Hướng dẫn quy định đánh giá chất lượng thuốc khuyến nghị phân tích chất phân tích từ loại thảo dược cấu thành công thức thuốc Điều để phát pha trộn công thức với loại thảo mộc khác thay loại thảo mộc khác hồn tồn Các chất phân tích lựa chọn lý tưởng đóng góp vào hiệu điều trị thuốc Lý tưởng thường không đạt tương đối thực vật có hoạt chất hồn tồn độc đáo với Hiện khơng có tiêu chí quy định cho việc lựa chọn chất phân tích thuốc thảo dược cho mục đích kiểm sốt chất lượng Hiện chưa có nghiên cứu nước đánh giá chất lượng thuốc Kỷ cúc địa hoàng Về nghiên cứu chất lượng thuốc có nghiên cứu nước ngồi bao gồm: Mariam Jarouche (2014) [48] nghiên cứu HAN Ling-ling (2007) Trong nghiên cứu mình, Mariam Jarouche xây dựng phương pháp định lượng số thành phần (alisol C, alisol B, catalpol, rutin, luteolin, diosgenin, paeoniflorin, pachymic acid cornuside) thuốc Kỷ cúc địa hoàng phương pháp UPLC với detector ESI-MS/MS Nghiên cứu thứ hai HAN Ling-ling (2007) cộng nghiên cứu định lượng loganin viên nang Kỷ cúc địa hoàng HPLC [24] * Một số tiêu chất lượng Kỷ cúc địa hoàng hoàn DĐTQ 2015 [53] - Định tính SKLM + Phương pháp 1: Hệ dung môi khai triển: Cyclohexan: ethyl acetat (3:1) Dung dịch chuẩn: Hòa tan chất chuẩn paeonol aceton thành dung dịch có nồng độ mg/ml Bảng 3.13 Chương trình dung mơi cho chế độ rửa giải gradient Thời gian A (methanol) 0-3 3-4 4-12 12-40 40-50 50-60 + Chương trình 2: B (acetonitrile) 0 30 100 C (H3PO4 0.1%) 98 95 93 88 70 Bảng 3.14 Chương trình dung mơi cho chế độ rửa giải gradient Thời gian A (methanol) B (acetonitrile) C (H3PO4 0.1%) 0-3 98 3-4 95 4-12 93 12-30 86 30-40 20 80 40-50 30 70 50-60 100 Kết sắc ký đồ HPLC mẫu thử với chương trình dung mơi chương trình dung mơi trình bày Hình 3.9 Hình 3.10: Hình 3.9 Sắc ký đồ chương trình dung mơi Hình 3.10 Sắc ký đồ chương trình dung mơi Nhận xét: chương trình dung mơi cho pic loganin cân đối, tách tốt khỏi mẫu pic tạp Tuy nhiên với chương trình dung môi mẫu ổn định hơn, thời gian lưu loganin ngắn hệ dung môi (tr1 = 28,401, tr2 = 26,504) nên lựa chọn 48 hệ dung mơi để tiến hành phân tích loganin Các thơng số sắc ký trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Các thông số sắc ký ứng với chương trình dung mơi Thơng số loganin Hệ số đối xứng (As) 1,298 Độ phân giải (Rs) 12,15 tr (phút) 26,504 Như sau q trình khảo sát, chúng tơi lựa chọn điều kiện sắc ký cho trình định lượng loganin cao Kỷ cúc địa hoàng sau: Cột tách: cột Ascentis C18 Tốc độ dòng: 1.0 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Detector UV – VIS, bước song phát 236 nm Nhiệt độ cột: t = 40 0C Hệ dung môi gồm kênh: Kênh A: methanol; Kênh B: acetonitrile; Kênh C: acid phosphoric 0.1% Chương trình dung mơi: chương trình dung mơi Thẩm định phương pháp phân tích  Khảo sát độ đặc hiệu phương pháp Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký dung dịch sau: mẫu placebo (MeOH 50%), mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Kết trình bày Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu placebo, mẫu chuẩn loganin mẫu cao, mẫu cao thêm chuẩn 49 mAU 45 26.553/ 1.00 237 (a) 40 Phổ UV 35 30 25 loganin 20 206 15 10 thử (b) 200 250 300 350 400 450 500 550 600 656 627 631 459 486 mẫu 650 700 750 nm 237 mAU 26.515/ 1.00 40 35 Phổ UV 30 25 20 loganin 10 200 250 300 350 400 450 500 550 657 600 650 670 582 487 499 469 472 329 mẫu 205 15 700 750 nm chuẩn Hình 3.12 Phổ UV loganin mẫu cao mẫu chuẩn Nhận xét: Kết Hình 3.15 cho thấy sắc ký đồ mẫu thử có pic có thời gian lưu với pic loganin sắc ký đồ mẫu chuẩn; pic ứng với loganin sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tăng lên, sắc ký đồ mẫu placebo không xuất pic ứng với thời gian lưu loganin Kết Hình 3.16 cho thấy: Quét phổ UV vị trí ứng với thời gian lưu loganin sắc ký đồ, cho kết bước sóng cực đại mẫu cao đặc mẫu chuẩn loganin 236 nm Như phương pháp định lượng loganin đạt yêu cầu độ đặc hiệu  Khảo sát tính thích hợp hệ thống Để đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký, tiến hành pha mẫu chuẩn có nồng độ 0.424 mg/ml, tiến hành sắc ký lần với điều kiện lựa chọn cho kết trình bày Bảng 3.16 Bảng 3.16 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống TT RSD(%) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) 26,46 744158 26,48 742979 26,49 750931 26,48 746838 26,47 743125 26,47 748813 0,04 0,44 50 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu 0.044 % diện tích pic RSD 0.44 % (< 2%) Kết bảng cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng loganin  Xây dựng đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân xác 10.59 mg chất chuẩn loganin (98%) hòa tan với 10 ml MeOH 50% bình định mức 10 ml thu dung dịch có nồng độ 1,038 mg/ml, pha loãng mẫu thành dãy nồng độ 0,0104; 0,0208; 0,0312; 0,0416; 0,0830; 0,1038 mg/ml, lọc qua màng lọc 0.45 µm dãy dung dịch chuẩn tiến hành chạy sắc ký Kết khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn trình bày Bảng 3.17 Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính thể Hình 3.13 Bảng 3.17 Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ (mg/ml) Spic (mAU.s) 0,0104 221018 0,0208 387867 0,0312 529975 0,0416 748667 0,0830 0,1038 1418688 1801433 Hình 3.13 Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính loganin Nhận xét: Với khoảng nồng độ loganin từ 0,0104 mg/ml đến 0,1038 mg/ml có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic với phương trình: Y = 16911198,93 x + 31645,23 (R = 0,9995) 51 Trong đó: Y: Diện tích pic loganin x: nồng độ loganin (mg/ml) Nhận xét: Đường chuẩn đánh giá thông qua hệ số tương quan R Kết đánh giá đường chuẩn trình bày bảng cho thấy hệ số tương quan loganin R = 0,9995 > 0,99 đường chuẩn xây dựng đảm bảo độ tuyến tính để thực phép phân tích định lượng loganin  Thẩm định độ xác phương pháp Độ lặp lại Mẫu nghiên cứu: cao đặc thuốc Tiến hành: theo mục 2.2.2 Độ lặp lại phương pháp xác định cách tiến hành thí nghiệm riêng biệt để định lượng loganin Độ xác trung gian Tiến hành định lượng lặp lại mẫu thử độc lập, ngày khác với cách tiến hành điều kiện sắc ký Kết đánh giá độ lặp lại độ xác trung gian trình bày Bảng 3.18 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ lặp lại độ xác trung gian phương pháp cao đặc TT Lượng Ngày Diện tích cân (g) 2121,8 2104,5 2097,4 2089,4 2178,1 2034,9 pic (mAU.s) 806514 960961 963147 819501 991597 930249 X RSD (%) Hàm lượng (%) 0,0526 0,0522 0,0525 0,0529 0,0521 0,0522 Lượng Ngày Diện tích pic Hàm cân (g) 2121,8 2104,5 2097,4 2089,4 2178,1 2034,9 (mAU.s) 817901 975389 969039 839289 993587 945356 lượng (%) 0,0497 0,0533 0,0530 0,0529 0,0543 0,0522 0,0524 0,0531 0,58 1,25 Hàm lượng trung bình X ± SD%: 0,0528 ± 0,006%, RSD = 1,17 (n=12) Nhận xét: Kết thu cho thấy áp dụng chương trình lựa chọn để định lượng loganin mẫu cao đặc Kỷ cúc địa hoàng 52  Thẩm định độ phương pháp Mẫu nghiên cứu: cao đặc thuốc Tiến hành: theo mục 2.2.2 Kết trình bày Bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết đánh giá độ cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Mức TT thêm chuẩn 20% 50% 80% Nhận Lượng Lượng m cân S pic loganin loganin Độ thu X SD RSD (mg) (mAU.s) thêm vào tìm thấy hồi (%) (%) (µg) (µg) 2104,5 860294 1020,31 982 96,24 98.03 ± 2015,5 843383 1,94 965,02 966 100,10 1,98 2089,4 877205 1043,66 1020 97,73 2178,1 1113962 1343,83 1300 96,74 97,89 ± 1,47 2034,1 1097051 1,44 1276,28 1270 99,51 2089,3 1080140 1278,82 1246 97,43 2097,4 1316896 1566,27 1532 97,81 98,23 ± 2034,9 1333808 1,06 1551,00 1542 99,42 1,04 2097,5 1367630 1625,11 1584 97,47 xét: Kết thực nghiệm cho thấy % thu hồi mức nồng độ từ 96,24 % đến 100,10 % với độ lệch chuẩn tương đối mức nồng độ nhỏ 2.0% Phương pháp phân tích có độ tốt với hoạt chất nghiên cứu cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Vậy phương pháp xây dựng có độ cao (Đạt yêu cầu độ thu hồi AOAC 95 – 105%)  Xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ: Phân tích mẫu loganin nồng độ 0.0106 mg/ml, sau pha lỗng dần đến dung dịch chuẩn khơng xuất tín hiệu chất phân tích Kết xác định nồng độ giới hạn thể Bảng 3.20 Bảng 3.20 Kết xác định nồng độ giới hạn Nồng độ loganin 10,6 5,3 0,085 0,042 0,014 (µg/ml) Diện tích pic 0,007 Khơng 221018 101787 13051 6134 2067 có tín (mAU.s) hiệu Nhận xét: Nồng độ dung dịch chuẩn 0,014 µg/ml tỷ số chiều cao tín hiệu nhiễu đường S/N = 2,13, đạt khoảng từ 2-3 Như nồng độ 53 coi giới hạn phát LOD phương pháp Giới hạn định lượng LOQ = 3,3 × LOD = 0,0462 µg/ml b Ứng dụng định lượng loganin cao đặc thuốc Kỷ cúc địa hoàng Áp dụng quy trình xây dựng để định lượng loganin số mẫu cao Kỷ cúc địa hoàng, mẫu thực chiết lặp lại lần, lần đo lặp lại lần, kết trình bày bảng sắc ký đồ Bảng 3.21 minh họa Hình 3.17 Bảng 3.21 Kết định lượng loganin số mẫu cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Mẫu thử N4T3 N6T3 N8T3 N10T3 N8T2 N8T4 n Hàm lượng loganin cao đặc ( X SD ) 0,0430 ± 0,0027 0,0471 ± 0,0017 0,0528 ± 0,0008 0,053 ± 0,0009 0,0451 ± 0,0030 0,0514 ± 0,0018 3 3 Nhận xét : Hàm lượng mẫu dao động từ 0,043 ± 0,0027 (%) đến 0,053 ± 0,0009 (%) Hàm lượng cao 0,053 ± 0,0009 (%) mẫu cao N10T3 Hàm lượng thấp 0,043 ± 0,0027 (%) mẫu cao N4T3 Cao N8T3 mẫu có tỷ lệ DL/N thời gian chiết hợp lý nhất, với hàm lượng 0,0528 ± 0,0008 (%) chọn để nghiên cứu Hình 3.17 Sắc ký đồ HPLC mẫu cao N8T3 loganin chuẩn 54 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về điều chế dạng cao đặc Trong dân gian thuốc Đông dược thường chiết phương pháp sắc với nước Phương pháp sử dụng từ hàng ngàn năm phổ biến sống thường ngày Tuy nhiên dùng phương pháp sắc thường tốn thời gian, khó bảo quản thời gian dài Bởi việc nghiên cứu dạng thuốc đại dễ dùng điều cần thiết Dạng cao đặc bào chế từ dịch chiết nước, bảo quản thời gian dài dạng dung dịch Nghiên cứu bào chế dạng cao đặc với dung mơi nước có ưu điểm nước có khả hòa tan rộng, tiến hành nhiệt độ cao nên hòa tan nhiều hoạt chất Nhược điểm dùng nhiệt độ cao làm số hoạt chất bay (tinh dầu), biến đổi thành phần Tuy nhiên thuốc Đông dược thuốc bổ thuốc Kỷ cúc địa hồng cần phải sắc lâu, sắc nhiều nước việc sử dụng nước làm dung môi hợp lý Việc dùng tỷ lệ dung môi - dược liệu nào, thời gian ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dịch chiết Vì tỉ lệ dung môi - dược liệu thấp, nước không đủ ngấm ngập dược liệu dẫn đến chiết không kiệt, lại cạn nhanh Tỉ lệ dung môi - dược liệu cao, tốn dung môi, thời gian chiết theo bắt buộc dài hơn, tiếp xúc nhiệt độ cao thời gian dài, hoạt chất phân hủy, dược chất chiết kiệt rồi.Về thời gian chiết, chiết nhanh hoạt chất chưa kịp hết, chiết lâu ảnh hưởng đến chất lượng hoạt chất chính, kéo theo nhiều tạp chất theo Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng chiết dung môi nước, yếu tố tỷ lệ dung môi - dược liệu số lần chiết ảnh hưởng đến tỷ lệ cao chiết hàm lượng hoạt chất loganin chiết Vì nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát thông số tỷ lệ dung môi/ dược liệu số lần chiết để thu cao đặc có tỷ lệ cao chiết hàm lượng loganin cao đồng thời đạt số tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc DĐVN V Đối với thuốc Kỷ cúc địa hồng, dược liệu nhỏ, khơng cồng kềnh, có dược liệu cúc hoa chất mỏng manh, dễ trương nở môi trường nước Chúng dựa vào đặc điểm vị dược liệu thể chất Cúc hoa điều kiện thí 55 nghiệm tiến hành khảo sát sơ mức nước tối thiểu cho lần chiết DL/N = 1/4 Theo tiến hành khảo sát tỉ lệ mục 2.1.1 Đánh giá sau trình khảo sát:  Theo kết nghiên cứu tính chất vật lý, hàm ẩm, pH, định tính cho thấy mẫu cao đạt tiêu chuẩn DĐVN V Tỷ lệ cao chiết dao động từ 31,69 ± 0,26 (%) đến 43,85 ± 0,17 (%)  Về kết định lượng hoạt chất loganin mẫu cao khảo sát ta thấy: - Với thời gian chiết 90 phút x lần, hàm lượng loganin (%) mẻ chiết tỷ lệ DL/N có thay đổi Với tỷ lệ DL/N 1/4 hàm lượng loganin 0,0430 ± 0,0027 (%); tỷ lệ DL/N 1/6 hàm lượng loganin 0,0471 ± 0,0017 (%), với tỷ lệ DL/N 1/8 hàm lượng loganin 0,0528 ± 0,0008 (%), tỷ lệ DL/N 1/10 hàm lượng loganin 0,0530 ± 0,0009 (%) Như vậy, chiết với tỷ lệ DL/N 1/4 cho hàm lượng loganin thấp nhất, với tỷ lệ DL/N 1/8 1/10 hàm lượng loganin thay đổi không lớn - Với tỷ lệ chiết DL/N 1/8, tiến hành chiết lần, hàm lượng loganin 0,0451 ± 0,003 (%); với chiết lần, hàm lượng loganin 0,0528 ± 0,0008 (%) tăng số lần chiết lên lần hàm lượng loganin 0,0514 ± 0,0018 (%) Như chiết lần cho hàm lượng loganin cao so với chiết lần thay đổi không đáng kể tiến hành chiết lần Như mẻ cao đạt tiêu chuẩn khảo sát theo quy định DĐVN V cao N8T3 hợp lý hàm lượng loganin mẫu cao gần cao nhất, lại đỡ tốn dung môi, thời gian chiết Từ kết khảo sát, quy trình bào chế cao lựa chọn sau: Cân khối lượng dược liệu gấp lần thuốc gốc, thêm lượng nước gấp lần tổng dược liệu thuốc, đun sôi 1,5 Gạn lấy dịch chiết, lọc Làm lần Gộp tất dịch chiết dịch chiết tổng Các dịch chiết đem cô đặc đến tỷ lệ 1:1 (1g dược liệu: 1ml cao) để lắng, lọc Cô tiếp đến thể chất cao đặc, hàm ẩm 20% 4.2 Định tính nhóm chất cao 4.2.1 Định tính phản ứng hóa học Từ TPHH dược liệu, tiến hành định tính nhóm chất phản ứng hóa học kết mục 3.2.4 cho thấy cao đặc Kỷ cúc địa hồng có nhóm chất flavonoid, alkaloid, saponin, coumarin, tanin, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, 56 đường khử Tương ứng với TPHH vị dược liệu có phương thuốc Trong phản ứng định tính nhóm chất acid hữu cơ, flavonoid, sterol cho kết rõ Từ kết phản ứng định tính chúng tơi đưa tiêu chuẩn định tính cao thuốc Kỷ cúc địa hồng sau: - Định tính có mặt nhóm acid hữu - Định tính có mặt nhóm flavonoid phản ứng Cyanidin, phản ứng với dung dịch NaOH 10%, phản ứng với dung dịch FeCl3 5% - Định tính có mặt nhóm sterol phản ứng Liebermann 4.2.2 Định tính sắc ký lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng coi dấu vân tay hóa học dược liệu Để thẩm định dấu vân tay dược liệu cao đặc Kỷ cúc địa hồng, có hai phương pháp chiết hoạt chất: - Chiết chọn lọc theo nhóm chất: phương pháp loại nhiều tạp chất nhóm chất khác, cho kết xác hơn, nhiên lại tốn dung môi nhiều công đoạn phức tạp - Chiết không chọn lọc: dùng dung mơi MeOH chiết tồn thành phần có dược liệu cao đặc (MeOH dung môi vạn năng, có khả hòa tan rộng), phương pháp nhanh, tốn dung mơi, nhiên chiết khơng chọn lọc nên có nhiều tạp chất Để so sánh cao đặc Kỷ cúc địa hoàng với dược liệu chuẩn để xác nhận có mặt vị dược liệu cao đặc Chúng lựa chọn chiết cao đặc Kỷ cúc địa hoàng MeOH, vị Thục địa, Bạch phục linh, Mẫu đơn bì, Trạch tả, Câu kỷ tử, Cúc hoa chiết MeOH Riêng Sơn thù chiết làm giàu flavonoid ethylacetat, Hoài sơn chiết cloroform Từ kết mục 3.2.4 ta thấy ánh sáng tử ngoại bước sóng ngắn 254 nm, cao đặc Kỷ cúc có vết tương ứng đặc trưng vị dược liệu chuẩn Thục địa, Bạch phục linh, Mẫu đơn bì, Trạch tả, Câu kỷ tử, Cúc hoa, Hồi sơn (Rf tương ứng nhau), sau phun thuốc thử, cao đặc Kỷ cúc địa hồng có vết tương ứng đặc trưng với dược liệu chuẩn Sơn thù chất chuẩn loganin (có màu sắc Rf tương ứng nhau) Như cao đặc Kỷ cúc địa hồng có mặt đầy đủ vị dược liệu công thức phương thuốc Từ kết định tính sử dụng đưa vào dự thảo tiêu chuẩn mặt định tính SKLM cho cao đặc Kỷ cúc địa hoàng 57 4.3 Định lượng 4.3.1 Về khảo sát lựa chọn chất chuẩn định lượng Trong phương thuốc, Thục địa quân dược, chiếm khối lượng lớn (24g); Sơn thù đóng vai trò thần, chiếm khối lượng lớn thứ hai Theo DĐVN V [8], DĐTQ [53], DĐHK [77] verbascosid marker lựa chọn để định lượng hàm lượng hoạt chất có Thục địa; theo DĐTQ 2010 loganin marker lựa chọn để định lượng hàm lượng hoạt chất có Sơn thù Do vậy, phạm vi đề tài này, sử dụng hai chất chuẩn verbascosid loganin khảo sát lựa chọn marker cho cao đặc Kỷ cúc địa hồng Qua q trình khảo sát chúng tơi thấy, hàm lượng verbascosid Thục địa thấp (0.02% dược liệu khơ kiệt) nên sau q trình chế biến cao đặc lượng verbascosid lại khơng đáng kể, định lượng HPLC không lên pic, nên không lựa chọn làm marker định lượng cho cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Từ kết khảo sát, lựa chọn loganin làm marker định lượng cho cao đặc Kỷ cúc địa hoàng hợp lý 4.3.2 Về khảo sát thẩm định Tham khảo điều kiện sắc kí theo tài liệu thể Bảng 4.1 Bảng 4.1 Các phương pháp phân tích định lượng loganin HPLC Tên tài liệu Theo HAN Ling-ling Loại cột cột C18 (250 × Điều kiện sắc ký Pha động: methanol/ cộng (40), Dược điển Trung 4,6 mm; µm) acetonitrile/ acid phosphoric Quốc: Định lượng loganin 0.1% chế phẩm thuốc Kỷ Bước sóng phát 236 nm cúc địa hoàng [33] Theo Liu Cheng – Hong cột C18 (250 × Pha động: acetonitrile : nước cộng sự, Dược điển Trung 4,6 mm; µm) (15 : 85) Quốc, DĐVN V: Định lượng Bước sóng phát 240 nm loganin Sơn thù [33] Từ tài liệu nghiên cứu định lượng loganin HPLC, nhận thấy đa số nghiên cứu sử dụng sắc ký pha đảo, cột C18 Đối với định lượng loganin dược liệu Sơn thù hệ dung môi pha động sử dụng acetonitrile: nước (15:85) định lượng loganin thuốc Kỷ cúc địa hồng hệ dung mơi pha động sử dụng methanol, acetonitrile acid phosphoric 0.1% 58 Do lựa chọn hệ dung môi gồm thành phần làm hệ dung môi pha động khảo sát 4.3.3 Về kết định lượng loganin cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Từ kết Bảng 3.27, kết lựa chọn quy trình chiết cao đặc Kỷ cúc địa hoàng ta thấy hàm lượng thấp loganin mẫu cao chọn 0,043 ± 0,0027 (%) hàm lượng cao 0,053 ± 0,0009 (%) Chúng đề xuất dự thảo tiêu chuẩn định lượng loganin cao đặc Kỷ cúc địa hoàng là: Hàm lượng loganin (C17H26O10) cao đặc Kỷ cúc địa hồng khơng 0,04 % tính theo cao khô kiệt 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận  Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành mục tiêu đề với kết cụ thể sau: Đã xây dựng quy trình bào chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng Phương pháp đơn giản, dễ áp dụng quy mô công nghiệp Việt Nam Cụ thể sau: Cân khối lượng dược liệu gấp lần thuốc gốc, thêm lượng nước gấp lần tổng dược liệu thuốc, đun sôi 1,5 giờ, lọc Gạn lấy dịch chiết Làm lần Gộp tất dịch chiết dịch chiết tổng Các dịch chiết đem cô đặc đến tỷ lệ 1:1 (1g dược liệu: 1ml cao) để lắng, lọc Cô tiếp đến thể chất cao đặc, hàm ẩm 20%  Đã xây dựng số tiêu chất lượng cao đặc Kỷ cúc địa hồng  Về tiêu định tính - Định tính phản ứng hóa học: cao đặc Kỷ cúc địa hồng có nhóm chất flavonoid, alkaloid, saponin, coumarin, tanin, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử Tương ứng với TPHH vị dược liệu có phương thuốc - Định tính sắc ký lớp mỏng  Trên sắc ký đồ sau phun thuốc thử quan sát ánh sáng thường thấy: Cao đặc có vết tương đương với Sơn thù chuẩn chất chuẩn loganin (Rf = 0,27)  Trên sắc ký đồ quan sát bước sóng 254 nm thấy: + Cao đặc có vết tương đương với Thục địa chuẩn (Rf = 0,05, Rf = 0,27, Rf = 0,35, Rf = 0,39) + Cao đặc có vết tương đương với Hoài sơn chuẩn (Rf = 0,39, Rf = 0,54) + Cao đặc có vết tương đương với Đơn bì chuẩn (Rf = 0,11, Rf = 0,31, Rf = 0,40, Rf = 0,48) + Cao đặc có vết tương đương với Bạch phục linh chuẩn (Rf = 0,41, Rf = 0,46) + Cao đặc có vết tương đương với Trạch tả chuẩn (Rf = 0,35, Rf = 0,41, Rf = 0,40) + Cao đặc có vết tương đương Cúc hoa chuẩn (Rf = 0,38, Rf = 0,45, Rf = 0,66) + Cao đặc có vết tương đương với Câu kỷ tử chuẩn (Rf = 0,33, Rf = 0,47) 60  Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng - Về khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát gradient thành phần pha động với điều kiện sắc ký sau: o Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 ì 4.6 mm; 5àm) o Detector UV, bc sóng phát hiện: 236 nm o Tốc độ dòng: 1.0 ml/min o Nhiệt độ cột: 400C o Thể tích tiêm: 10 µl Lựa chọn chương trình gradient pha động: chương trình - Thẩm định Phương pháp chọn cho độ đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, độ xác, độ thấy đạt theo quy định AOAC Cho thấy phương pháp sắc kí chọn hồn toàn phù hợp để định lượng loganin cao đặc Kỷ cúc địa hồng, từ đưa vào dự thảo tiêu chuẩn định lượng loganin cao đặc thuốc Kỷ cúc địa hoàng - Định lượng Hàm lượng loganin mẫu cao đặc nghiên cứu: Hàm lượng mẫu khoảng từ 0,043 ± 0,0027 (%) đến 0,053 ± 0,0009 (%) Hàm lượng cao 0,053 ± 0,0009 (%) mẫu cao N10T3 Hàm lượng thấp 0,043 ± 0,0027 (%) mẫu cao N4T3 Cao N8T3 mẫu có tỷ lệ DL/N thời gian chiết hợp lý nhất, với hàm lượng 0,0528 ± 0,0008 (%) Từ đưa dự thảo tiêu chuẩn hàm lượng loganin mẫu cao đặc khơng nhỏ 0,04 % tính theo cao khô tuyệt đối Kiến nghị Từ kết nghiên cứu thu được, thấy thuốc Kỷ cúc địa hồng có triển vọng bào chế cao đặc để phát triển sản phẩm Đề tài xin đưa kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu bào chế cao đặc Kỷ cúc địa hồng quy mơ cơng nghiệp - Tiếp tục hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc thuốc Kỷ cúc địa hoàng theo tiêu chuẩn cao đặc DĐVN V 61 - Nghiên cứu độ ổn định cao đặc Kỷ cúc địa hoàng để xác định thời gian bảo quản, hạn dùng 62 ... có nghiên cứu nước đánh giá chất lượng thuốc Kỷ cúc địa hoàng Về nghiên cứu chất lượng thuốc có nghiên cứu nước bao gồm: Mariam Jarouche (2014) [48] nghiên cứu HAN Ling-ling (2007) Trong nghiên. .. cao đặc Kỷ cúc địa hoàng thực nhằm giải hai mục tiêu sau: - Nghiên cứu điều chế cao đặc Kỷ cúc địa hoàng - Xây dựng số tiêu chuẩn định tính, định lượng dạng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng CHƯƠNG TỔNG... với detector ESI-MS/MS Nghiên cứu thứ hai HAN Ling-ling (2007) cộng nghiên cứu định lượng loganin viên nang Kỷ cúc địa hoàng HPLC [24] * Một số tiêu chất lượng Kỷ cúc địa hồng hồn DĐTQ 2015 [53]