Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh tại Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÀ NẴNG, NĂM 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ngành : Công nghệ sinh học KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN MINH LÝ ĐÀ NẴNG, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Tấn Phát LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý thầy, cô khoa Sinh – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đại Học Đà Nẵng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý ngƣời thầy tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hƣớng cho em suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp động viên tinh thần cho suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn 1.1.1 Phân loại vi khuẩn 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum a Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R solanacearum b Đặc tính sinh hóa vi khuẩn R solanacearum c Phương thức tồn tại, xâm nhập lan truyền vi khuẩn R solanacearum d Ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh đến phát sinh, phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc e Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn phân lập vi khuẩn gây bệnh 1.1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum 10 a Biovar nòi vi khuẩn R solanacearum 10 b Chủng 11 c Loài phức 12 d Kiểu gây bệnh 12 e Kiểu quan hệ phả hệ 12 1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh Việt Nam Thế giới 13 a Nghiên cứu bệnh héo xanh giới 13 b Nghiên cứu bệnh héo xanh Việt Nam 13 1.2 Tổng quan kỹ thuật RAPD 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Địa điểm, thời gian phạm vi nghiên cứu 18 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 18 2.3.2 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04/2017 đến 04/2018 18 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phƣơng pháp thu mẫu 18 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập 18 a Mẫu đất 18 b Mẫu bệnh 19 2.4.3 Phƣơng pháp xác định biovar dòng vi khuẩn phân lập 19 2.4.4 Phƣơng pháp phân tích DNA 21 a Phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 21 2.4.5 Kỹ thuật PCR: 21 2.4.6 Phƣơng pháp điện di gel agarose 21 2.4.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 22 2.4.8 Phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật 22 Bảo quản môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Phân lập vi khuẩn héo xanh địa bàn Đà Nẵng 24 3.2 Xác định biovar chủng vi khuẩn R solanacearum 27 3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 29 3.3.1 Kết tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum 29 3.3.2 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi RAPD 29 3.3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền chủng VKHX 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Tiếng việt 35 Tiếng Anh 36 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations HXVK TZC Héo xanh vi khuẩn Tetrazolium chloride SPA PCR Sucrose peptone agar Polymerase chain reaction bp DNA Base pair Deoxyribonucleic acid µg µL Microgram Microliter AP-PCR DAF RAPD TAE Kb mg mL Arbitrary primed polymerase chain reaction DNA amplification fingerprinting Randomly amplified polymorphic DNA Tris-Acetic acid-EDTA Kilobase Milligram Millilite mM cs Millimol Cộng CTAB EDTA cetyltrimethyl-ammonium bromide ethylene diamine tetraacetic acid DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 2.1 Tọa độ địa điểm lấy mẫu 17 Bảng 2.2 Danh sách đoạn mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Phản ứng xác định Biovar vi khuẩn R.solanacearum 20 Bảng 3.1 Các chủngVKHX đƣợc phân lập 24 Bảng 3.2 Đƣờng kính khuẩn lạc môi trƣờng TZC sau 24h 48h nuôi cấy 25 Bảng 3.3 Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh 27 Bảng 3.4 Mức độ đa hình mồi RAPD ngẫu nhiên phân tích với chủng vi khuẩn R solanacearum 28 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền chủng vi khuẩn héo xanh 30 bảng DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith dƣới kính hiển vi Hình thái loại kiểu hình vi Hình 3.1 khuẩn mơi trƣờng TZC đƣợc sử dụng nghiên cứu 25 Hình 3.2 Kết tách chiết DNA số chủng vi khuẩn R solanacearum 28 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu quy trình phát R solanacearum sử dụng DNA chiết tách từ loài vi khuẩn phân lập đƣợc 29 Hình 3.4 Quan hệ di truyền chủng vi khuẩn héo xanh 30 3.2 Xác định biovar chủng vi khuẩn R solanacearum Từ 23 mẫu vi khuẩn héo xanh thu thập đƣợc tiến hành thử phản ứng ơxy hóa nguồn bon khác để xác định biovar theo phƣơng pháp mô tả Hayward (1964) Từ phƣơng pháp xác định Biovar thấy, vi khuẩn có phản ứng với loại đƣờng có phản ứng với hai loại đƣờng lại ngƣợc lại Chính vậy, nghiên cứu chọn đại diện loại đƣờng thông dụng là: lactose, maltose Tƣơng tự nhƣ vậy, phản ứng với rƣợu chọn đại diện loại rƣợu, nhƣng biovar vi khuẩn phản ứng với đƣờng loại rƣợu manitol, không phản ứng với loại rƣợu lại, nên ƣu tiên chọn rƣợu manitol loại đƣợc chọn là: manitol, dulcitol Kết phản ứng đƣợc thể bảng 3.3 Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh cho thấy có 21 chủng phản ứng với nguồn bon (2 loại đƣờng gồm: lactose, maltose, loại rƣợu gồm: sorbitol, manitol) nên thuộc biovar (chiếm 91.3% số mẫu) Có chủng phản ứng với đƣờng gồm (lactose, maltose) rƣợu sorbitol, chủng chƣa thể kết luận thuộc biovar nào, cần có thêm nghiên cứu chủng để đƣa kết luận xác Theo Buddenhagen Kelman (1964), He et al (1983) vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc vùng đất thấp vùng nhiệt đới cận nhiệt đới thuộc nòi Nòi có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm họ cà (Solanaceae) số họ đậu (Leguminoseae) Các tác giả Nguyễn Xuân Hồng cs (1997), Đỗ Tấn Dũng (1999), Nguyễn Thị Yến cs (2002) xác định vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar thuộc nòi Kết xác định nòi biovar nguồn vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh Đà Nẵng phổ biến biovar Vẫn chƣa phân lập đƣợc biovar 4, có mẫu chƣa xác định đƣợc biovar 27 Bảng 3.3 Kết xác định biovar 23 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh ĐƢỜNG KÝ HIỆU RƢỢU MALTOSE LACTOSE MANITOL DULCITOL BIOVAR Rs1 + + + + Rs2 + + + + Rs3 + + + + Rs4 + + + + Rs5 + + + + Rs6 + + + + Rs7 + + + + Rs8 + + + + Rs9 + + + + Rs10 + + + + Rs11 + + + + Rs12 + + - + ? Rs13 + + + + Rs14 + + + + Rs15 + + + + Rs16 + + + + Rs17 + + - + ? Rs18 + + + + Rs19 + + + + Rs20 + + + + Rs21 + + + + Rs22 + + + + Rs23 + + + + Ghi chú: + có phản ứng; - khơng có phản ứng 28 3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn R solanacearum phân tích DNA 3.3.1 Kết tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum Từ nguồn vật liệu 23 chủng vi khuẩn tách chiết DNA thành công 23 mẫu đƣa vào nghiên cứu DNA tách chiết đƣợc có vạch b ng đậm, rõ nét, không bị tạp nhiễm hay gẫy đứt đoạn, đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm (hình 3.2) Hình 3.2: Kết tách chiết DNA số chủng vi khuẩn R solanacearum 1-15: DNA tổng số chủng vi khuẩn Rs1- Rs15 M - DNA ladder 1000 bp (PhusaBiochem) 3.3.2 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi RAPD Sản phẩm PCR với mồi RAPD chủng vi khuẩn R solanacearum đại diện cho nhóm hình thái khuẩn lạc địa điểm khác nhau, đƣợc thể bên dƣới, hình 3.6 Bảng 3.4: Mức độ đa hình mồi RAPD ngẫu nhiên phân tích với chủng vi khuẩn R solanacearum Số ph n đoạn ADN Số ph n đoạn đƣợc nh n DNA đa hình Phần trăm STT Tên mồi OPA 16 25% OPA 17 13 46% OPB 10 30% OPB 14 19 15 78,9% OPF 11 42,8% 65 31 47.69% Tổng 29 Sản phẩm PCR-RAPD phân tích với mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di gel agarose để phân tích đa hình DNA chủng vi khuẩn nghiên cứu Số phân đoạn DNA nhân dao động từ đến 19 phân đoạn, tổng số phân đoạn ADN nhân đƣợc 65 Trong số mồi phân tích, số phân đoạn ADN nhân đƣợc với mồi OPB14 nhiều (19 phân đoạn) mồi OPF 11 (7 phân đoạn) Kết ghi nhận đƣợc cho thấy tất mồi nghiên cứu cho đa hình Tính đa hình thể xuất hay không xuất phân đoạn ADN so sánh chủng với mồi Hình 3.3 : Kết điện di sản phẩm RAPD chủng vi khuẩn R solanacearum với mồi Ghi chú: 11-mồi OPF 11; 14–mồi OPB 14; 17–mồi OPA 17; A1–mồi OPA 1; B1–mồi OPB 1; M–thang DNA chuẩn 2kb Nhƣ sản phẩm PCR-RAPD phân tích với mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di gel agarose để phân tích đa hình DNA chủng vi khuẩn có mức đa hình cao 3.3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền chủng VKHX Số liệu sau đƣợc mã hóa thành ký tự 0, đƣợc xử lý phần mềm NTSYSpc-version 2.1 Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.5 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu nằm khoảng từ 0,19 -1,00 (tƣơng ứng với từ 19% -100%), nghĩa sai khác di truyền mẫu nằm khoảng từ 0-81% Điều này, cho thấy 30 chủng có khác về mặt di truyền, hay nói cách khác có đa dạng di truyền chủng với Bảng 3.5 Hệ số tương đồng di truyền chủng vi khuẩn héo xanh Để thuận lợi cho việc phân tích, đánh giá quan hệ di truyền chủng vi khuẩn, sử dụng phần mềm NTSYSpc chuyển hóa số liệu tƣơng quan di truyền mẫu bảng 3.5 thành dạng biểu đồ hình cây, mẫu có hệ số tƣơng đồng tƣơng đƣơng đƣợc xếp vào nhóm Dựa vào biểu đồ hình đánh giá đƣợc mức độ đa dạng tƣơng quan di truyền mẫu nghiên cứu (hình 3.7) Hình 3.4 Quan hệ di truyền chủng vi khuẩn héo xanh Dựa kết phân tích mồi nghiên cứu với chủng vi khuẩn, xây dựng đƣợc mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh (hình 3.7) Hệ số tƣơng đồng di truyền cao đƣợc ghi nhận chủng Rs2 chủng Rs8 đạt 0.69 Biểu đồ quan hệ di truyền cho thấy, hệ số tƣơng đồng 31 chủng vi khuẩn thấp dao động từ 0,05 đến 0,69 chủng vi khuẩn đƣợc chia thành nhóm Nhóm I gồm chủng: RS13 Hệ số tƣơng đồng di truyền 0,05 Nhóm II gồm chủng vi khuẩn lại đƣợc chia thành nhóm phụ: Nhóm II.1 gồm chủng: Rs2, Rs8, Rs19 Chủng Rs2 Rs8 có hệ số tƣơng đồng di truyền 0.69 gần chủng Rs19 phân thành nhánh riêng biệt Nhóm II.2 gồm chủng: Rs21 Hệ số tƣơng đồng di truyền đạt 0.19 Kết phân tích chủng vi khuẩn với mồi ngẫu nhiên cho thấy tƣơng đồng di truyền chúng thấp Xét mặt địa lý thấy chủng đƣợc phân lập từ vùng lân cận thƣờng nằm phân nhóm có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần, chí xuất xứ từ chủng (tƣơng đồng di truyền tới 100%) nhƣ chủng Rs2 Rs8 (Cẩm Lệ, Hòa Khánh), lại địa điểm khác có khác biệt rõ Xét mặt hình thái khuẩn lạc thấy chủng kiểu hình thái nhƣng lại khác khoảng cách di truyền Kết đánh giá đa dạng di truyền thí nghiệm phù hợp với kết công bố trƣớc Theo nghiên cứu Đinh Thị Phòng cs (2008) đánh giá đa dạng di truyền DNA chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc R solanacearum Smith đƣợc thu thập từ địa phƣơng: Hòa Bình, Hà Tây (cũ), Hải Dƣơng với 20 mồi RAPD độ tƣơng đồng di truyền chủng vi khuẩn từ 0,710 đến 0,980 Mức tƣơng đồng di truyền 44 chủng vi khuẩn R solanacearum thuộc nòi biovar đánh giá với 30 mồi RAPD 70% Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh địa phƣơng khác Việt Nam sở để đƣa biện pháp phòng chống thích hợp Mặt khác, phân tích đa dạng vi khuẩn R solanacearum, Gillings Fahy (1993) nhận thấy vi khuẩn R solanacearum đa dạng gợi ý vi khuẩn có lẽ loài phức (complex species) Theo Fegan Prior (2005) “loài phức” tập hợp cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc loài khác Các nghiên cứu đa dạng vi khuẩn dựa lai DNA cho thấy vi khuẩn héo xanh đa dạng với mức độ tƣơng đồng DNA mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt vi khuẩn mức loài) Hiện nay, vi khuẩn R solanacearum thức đƣợc xem lồi phức (Meng, 2013) 32 Nhƣ thấy, vi khuẩn R solanacearum loài phức nên việc giống hình thái nhƣng khác khoảng cách di truyền, có sở 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập thành công đƣợc 23 chủng vi khuẩn héo xanh vùng sản xuất nông nghiệp thành phố Đà Nẵng Phân loại đƣợc chủng vi khuẩn theo hình thái thành loại khác biệt kích thƣớc màu sắc khuẩn lạc môi trƣờng TZC 1.2 Đa số chủng vi khuẩn R solanacearum phân lập đƣợc thuộc biovar thuộc nòi 1.3 Kết phân tích thị RAPD cho thấy tính đa dạng di truyền cao chủng vi khuẩn R solanacearum đƣợc phân lập (với hệ số tƣơng đồng dao động từ 0,05 đến 0,69) Kiến nghị 2.1 Trong nghiên cứu 21 chủng số 23 chủng đƣợc phân lập thuộc Biovar Tuy nhiên, chủng chƣa xác định đƣợc Vì vậy, cần nghiên cứu thêm chủng (Rs12, Rs17) 2.2 Trong nghiên cứu cần phân tích mối quan hệ di truyền thị RAPD chủng vi khuẩn khác đƣợc phân lập 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Đinh Thị Phòng, Đỗ Tiến Phát Nguyễn Thị Yến (2008), "Đa dạng DNA genome chủng vi khuẩn (pseudomonas solanacearum) gây bệnh héo xanh lạc kĩ thuật RADP", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Tập 46, số 6,, tr 43-50 Egorov N X dịch Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực hành vi sinh vật, NXB Mir Matcova, NXB KT-KH Hà Nội 10 Hồ Thanh Hoàng (2013), "Sử dụng dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua" http://agriviet.com/threads/cay-ca-chua.180517/, Lê Thị Thanh Thủy (2014), "Nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trồng, luận án tiến sĩ sinh học " Đỗ Tấn Dũng (1999), Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith hại số trồng ngoại thành Hà Nội vùng phụ cận, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 181 trang Nguyễn Lân Dũng (1962), Giáo trình vi sinh vật hoc, chủ biên, Đại học Tổng hợp Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng Nguyễn V n Tuất (2011), "Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith hại khoai tây vùng Hà Nội- phụ cận, biện pháp phòng trừ” Tập 9, số 5,, tr 725 - 734 Trần Thị Ba Phạm Thanh Phong (2010), "Đánh giá khả n ng sống chống chịu bệnh héo tƣơi vi khuẩn Ralstonia solanacearum cà chua ghép nhà lƣới", Tạp chí Khoa học 2010 Trường Đại học Cần Thơ 16b, tr 272-279 Trần Vũ Phến cộng (2010), "Tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kích t ng trƣởng phòng trừ sinh học bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum cà chua ", Tạp chí khoa học 15a, tr 97-106 35 11 Nguyễn V n Tuất cộng (2007), “Nghiên cứu tính đa dạng quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh Rastonia solanacearum Smith hại vừng, lạc”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2007- Nghiên cứu khoa học sống, Đại học Quy Nhơn, NXB Khoa học kỹ thuật, tháng 10/2007, tr 611-615 [12] Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Huy Chung, Lê Tuấn Tỳ, Nguyễn Mạnh Hùng, Đinh Thị Phƣợng, Đỗ Tiến Phát (2008), “Phân tích đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc (Ralstonia solanacearum Smith) tuyển chọn giống kháng bệnh”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam, 2: 44-49 [13] Ngọ V n Ngôn (2015), " Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc xác định dòng, giống kháng bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam"; Luận án Tiến Sỹ nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội, 200 trang [14] Trƣơng Thị Hồng Hải (2016), " Nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn R solanacearum số tỉnh miền Bắc thị RAPD (Study on genetic diversity of Ralstonia solanacearum in Norther Vietnam by RAPD)"; Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, kỳ tháng 09/2016 [15] Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn V n Liễu (1997), “Kết nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 6: 27-31 [16] Lê Lƣơng Tề (1997a), Giáo trình bệnh cây, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, 1997 [17] Lê Nhƣ Kiểu, Trần Quang Minh, Lê Thị Thanh Thủy, Nguyễn V n Huân (2010), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc vừng” Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(3); 33-42 [18] http://jb.asm.org/content/183/12/3597/F3.expansion.html [19] Burgess L.V, Knight T.E, Tesorio L., Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210pp, ACIAR Tiếng Anh [20] Meng F (2013), “Ralstonia Solanacearum species complex and bacterial wilt disease”, Journal of Bacteriology and Parasitology, 4: e911 36 [21] (Williams J G K., Kubelik A R., Livak K J et al., 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 ) [22] Sam Cox (2000), "I Say Tomayto, You Say Tomahto" (Williams J G K., Kubelik A R., Livak K J et al., 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 ) [23] Kawa P G., Devarumath R M., Nerka Y., 2009 Use of RAPD marker for assessment of genetic diversity in sugarcane cultivars Indian J Biotechnol., 8: 67-81 [24] Khan A., Awan S., Sadia B., Rana R M., Khan I A., 2010 Genetic diversity study among coloured cotton genotypes by using RAPD markers Pak J Bot., 42(1): 71-77 [25] Hayward A.C (1994), “The hosts of Pseudomonas solanacearum”, CAB International, p 9-24 67 [26] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24663688 [27] Hayward A.C (1964), “Characteristics of Pseudomonas solanacerarum”, Journal of Applied Bacteriology, 27: 265 - 277 [28].Nguyen Duc Thanh, Nguyen Hoang Tinh, 2009 Application of molecular markers for the study of genetic diversity of forest trees and sub-tropical fruit species Adv in National Science, 3: 373-382 [29] Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, Nguyen Hoang Nghia, 2012 Genetic diversity of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib in Vietnam based on analyses of chloroplast markers and random amplified polymorphic DNA (RAPD) Afr J Biotechnol., 1(80): 14529-14535 [30] Martin C., Uberhuaga E., Pérez C., 2002 Application of RAPD markers in the characterisation of Chrysanthemum varieties and the assessment of somaclonal variation Euphytica, 127(2): 247-253 [31] Tivang J., Skroch P W., Nienhuis J., 1996 Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) variation among and within Artichoke (Cynara scolymus L.) cultivars and breeding Populations J Amer Soc Hort Sci., 121(5): 783-78 [32] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24663688 37 [33] https://www.eurofinsgenomics.eu/media/1610370/rapd_10mer_kits_sequences pdf [34] Mehan V.K and McDonald D (1995), “Techniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum, and for resistance screening against groundnut bacterial wilt”, Technical Report, International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics 38 PHỤ LỤC Môi trƣờng phân lập TZC (Tetrazolium Chloride Agar): Bảng 2.3 Môi trường phân lập vi khuẩn TZC (Tetrazolium Chloride Agar) Môi trƣờng ph n ập vi khuẩn TZC (Tetrazo ium Ch oride Agar): Pepton 10,0 g Glucose 5g Casein hydrolysate 1g Agar 17g 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 0,05g Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml pH môi trƣờng 28 ° C: 7,0 - 7,2 Môi trƣờng nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) Bảng 2.4 Môi trường nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) Môi trƣờng nhân nhanh vi khuẩn SPA (Sucrose - Peptone) Sacaroza (C12H 22O11) 20,0 g Pepton 5,0 g Agar 15 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) 0,25 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nƣớc (MgSO4.7H2O) 0,25 g Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml pH môi trƣờng 28 ° C: 7,2-7,4 39 PHỤ LỤC (C) Hình 3.2 Hình thái vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh (A)- môi trường TZC; (B) - môi trường SPA; (C) - bảo quản nguồn vi khuẩn 40 PHỤ LỤC Hình 3.3 : Xác định biovar chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh - Phản ứng nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum với đƣờng Maltose - Phản ứng nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum với đƣờng Lactose - Phản ứng nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum với rƣợu Mannitol - Phản ứng nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum với rƣợu Dulcitol 41 ...ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ngành... di truyền chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh Đà Nẵng thị phân tử Mục tiêu đề tài Phân lập đánh giá đƣợc tính đa dạng di truyền phƣơng pháp sinh học phân tử chủng vi. .. e Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn phân lập vi khuẩn gây bệnh 1.1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum 10 a Biovar nòi vi khuẩn R solanacearum 10 b Chủng