Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong cao chiết n hexane lá cây tầm gửi trên cây khế chua

Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách vàxác đinḥ thành phần hóa học trong cao chiết n-hexane của látầm gửi trên cây khếchua”.. Qua tìm hiểu thìhiêṇ nay trên thếgiới đãcónhiều

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA HỌC



TRÂ ̀

N THI ̣THUC̣ HANḤ

T TÁCH VÀXÁC ĐINḤ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

T N–HEXANE LÁ

CHUA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

CHUYÊN NGÀNH SƯ PHAṂ HÓA

Đà Nẵng - 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Trần Thi ̣Thuc ̣ Hanḥ

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách vàxác đinḥ thành phần hóa học trong cao

chiết n-hexane của látầm gửi trên cây khếchua”

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị

- Nguyên liệu: Látầm gửi đươc ̣ thu hái taịquâṇ Liên Chiểu, thành phốĐà

+ Bộ chiết chưng ninh, bình tam giác, cột sắc ký, bản mỏng sắc ký, đèn UV,cân phân tích, bếp cách thủy, tủ sấy, lò nung …

+ Thiết bi ṣắc kýghép khối phổ7890A/5975C, Agilent technology, USA

(Trung tâm kỹthuâṭtiêu chuẩn đo lường chất lương ̣ 2 – ĐàNẵng)

- Phân lập một số hợp chất trong cao tổng n – hexane bằng phương pháp sắc

ký cột và sắc ký bản mỏng

- Xác định thành phần hóa học trong các phân đoạn bằng phương pháp GC –MS

4 Giáo viên hướng dẫn: GS.TS Đào Hùng Cường

5 Ngày giao đề tài: 01/08/2017

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày 22 tháng 04 năm 2018Kết quả điểm đánh giá:…….

Đà Nẵng, ngày … tháng … năm 2018

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo GS.TS Đào Hùng Cường đã tận tìnhhướng dẫn, giúp đỡ cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành tốt khóaluận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn và các thầy cô phụ tráchphòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã nhiệttình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong thời gian vừa qua

Bước đầu làm quen với việc nghiên cứu nên bài báo cáo này không tránhkhỏi thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp, bổ sung của thầy côđể em có thể thu nhận thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm cho bản thân sau này

Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô sức khỏe, hạnh phúc và thành côngtrong cuộc sống cũng như sự nghiệp giảng dạy của mình Em xin chân thành cảmơn

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2018

Sinh viên

Trần Thi Tḥuc ̣ Hanḥ

MUC̣ LUC̣

̉e ̀

MƠ ĐÂU 1

̉e CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ TẦ M GỬI 4

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY TẦ M GỬI 4

1.2.1 Tên gọi 4

1.2.2 Mô tả thực vật 4

1.2.3 Phân bố và cách trồng 5

1.3 CÔNG DUNG̣ VÀ CÁCH SỬ DUNG̣ CÂY TẦ M GỬI 6

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỌ TẦ M GỬI 7

1.4.1 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 7

1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 8

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THƯC̣ NGHIÊṂ 10

2.1 NGUYÊN LIÊU,̣ DUNG̣ CU,̣ HÓA CHẤ T 10

2.1.1 Nguyên liêụ 10

2.1.2 Thiết bi,̣dung ̣ cu,̣hóa chất 10

2.1.3 Sơ đồ nghiên cứu thưc ̣ nghiêṃ 12

́́ ̀ ̉ ̀ 2.2 PHƯƠNG PHAP NGÂM DÂM TAỌ TÔNG CAO ETHANOL TƯ BÔṬ CÂY TẦ M GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA……… ………13

2.2.1 Nguyên tắc 13

2.2.2 Cách tiến hành 13

́́ ́ ́ ̉ ̉ ̀ ̉ 2.3 PHƯƠNG PHAP CHIÊT PHÂN BÔ LONG – LONG TƯ TÔNG CAO ETHANOL 13

2.3.1 Nguyên tắc 13

2.3.2 Cách tiến hành 14

2.4 PHÂN LÂP ̣ PHÂN ĐOAṆ BẰ NG SẮ C KÝ CÔṬ VÀ SẮ C KÝ BẢN MỎNG 14 2.4.1 Sắc kýcôṭ 14

2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐINḤ TÍNH THÀNH PHẦ

N NHÓM CHỨC TRONG DICḤ CHIẾ

T 21

2.6 XÁC ĐINḤ THÀNH PHẦ N HÓA HOC̣ BẰ NG PHƯƠNG PHÁP GC/MS 24 2.6.1 Nguyên tắc 24

2.6.2.Cấu taọ thiết bi ̣ 25

2.6.3 Chương trinh̀ chaỵ GC/MS 26

̉́ e ̀ e CHƯƠNG 3 KÊT QUA VA THAO LUÂṆ 288

́́ ̉ ̀ ́ ̉ ̀ ́ 3.1 KÊT QUA ĐIÊU CHE TÔNG CAO ETHANOL BĂNG PHƯƠNG PHAP NGÂM CHIẾ T 288

3.2 KẾ T QUẢ XÁC ĐINḤ THÀNH PHẦ N HÓA HOC̣ TRONG DICḤ CHIẾ T ́̀ ̉ ̉ ́ ̀ ̉ N-HEXAN TƯ CAO TÔNG ETHANOL CUA LA CÂY TÂM GƯI TRÊN CÂY KHẾ CHUA 29

3.2.1 Kết quả chiết phân bố lỏng–lỏng tổng cao ethanol bằng n-hexan 29

3.2.2 Định tính và định danh thành phần hóa học các chất trong phân đoạn cao hexane tách từ tổng cao ethanol 300

́́ ̉ ̀ ̉ 3.3 KÊT QUA PHÂN LÂP ̣ PHÂN ĐOAṆ CAO N-HEXANE TƯ TÔNG CAO ETHANOL CỦA CÂY TÂM GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA 39

3.3.1 Kết quảchaỵ sắc kýcôṭcao n-hexane (13,45g) tách từ tổng cao ethanol 39 3.3.2 Kết quả chạy sắc ký cột phân đoạn TH.I (3,718g) 422

3.3.3 Đinḥ danh thành phần hóa hoc ̣ trong phân đoaṇ TH.I1 466

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 499

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

̉́DANHMUC̣CAC CHỮVIẾT TẮT

GC MS STT TCCS USA

D

: Gas Chromatography: Mass Spectrometry: Số thứ tự

: Tiêu chuẩn cơ sở: The United States of America

: Chloroform

: Dichloromethane

DANH MUC̣ CÁC BẢNG Số

3.2 Khối lượng cao thu được sau khi cô quay chân không dịch 29

chiết ethanol

3.3 Khối lượng cao thu được sau khi cô quay chân không dịch 30

chiết n-hexan

3.5 Tổng hợp kết quả định tính thành phần hóa học trong cao 34

chiết n-hexane

3.6 Thành phần hóa học chính của dịch chiết lá tầm gửi trong 35

dung môi n-hexan

DANH MUC̣ CÁC HÌNH Số

Cac vết chất trên cac ban mong cua phân đoaṇ TH.I, TH.II, 42

TH.III

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với các dung môi đơn n-hexane, 423.12 benzen, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, acetone (từ

trái sang phải)

3.13 Cột sắc ký (d=3,5cm, h=50cm) va cac lọ dung dịch hứng (15ml) 43

3.19 Sắc ký đồ GC-MS cua phân đoaṇ TH.I1 tư lá cây tầm gửi 46

̉e ̉̀

MƠ ĐÂU

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng nguyên liệu từ thiên nhiên để làm thuốcchữa bệnh Nguyên liệu từ thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng, mỗi loài cây

có những đặc tính và tác dụng khác nhau Qua nhiều thế kỉ, bằng kinh nghiệm dângian và dựa trên nhiều thành tựu nghiên cứu khoa học hiện đại, Y dược học cổtruyền đã xây dựng nên một hệ thống các chế phẩm thảo dược có giá trị to lớn,chiếm vị trí quan trọng trong nền y học nước ta Đa số các chế phẩm này là hỗn hợpphức tạp của nhiều hợp chất hóa học mà trong đó hợp chất có hiệu lực chủ yếutrong quá trình điều trị lại chưa được phân lập và xác định Do đó, hướng nghiêncứu thành phần hóa học các thảo dược là công việc quan trọng có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn cao hiện nay

Tầm gửi làmôṭ loài cây rất quen thuôc ̣ với con người vànó cũng đươc ̣ sử dung ̣ rông ̣ raĩ trong dân gian đểchữa nhiều loaịbênḥ khác nhau Từ nhiều thếkỷ trước, tầm gửi đươc ̣ sử dung ̣ đểchữa tai biến macḥ máu, đau đầu vàmôṭsốbênḥ khác, ngoài ra tầm gửi còn đươc ̣ sử dung ̣ đểchữa ung thư taịcác nước châu Âu [6] Qua tìm hiểu thìhiêṇ nay trên thếgiới đãcónhiều nghiên cứu vềcây tầm gửi ký sinh trên các

loaịthưc ̣ vâṭkhác nhau như tầm gửi cây mit,́ tầm gửi cây gao,̣ tầm gửi cây nghiến,… Tuy nhiên các công trinh̀ nghiên cứu vềtầm gửi cây khếvẫn còn haṇ chếmăc ̣ dùtheo kinh nghiêṃ dân gian thìtầm gửi cây khếcótác dung ̣ chữa sốt, sốt rét, ho gà Việc nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, ứng dụng các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của tầm gửi cây khếlà một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Vì vậy, để làm đa dang ̣ hơn vềnghiên cứu thành phần hóa hoc ̣ của loài cây này, chúng tôi đã

choṇ đềtài: “Nghiên cứu chiết tách vàxác đinḥ thành

phần hóa học cao chiết n-hexane của látầm gửi cây khếchua ởLiên Chiểu, Đà Nẵng”, với mục tiêu đóng góp một phần tư liệu vào hệ thống các công trình khoa

học về loài cây này

2 Muc ̣ đích nghiên cứu

- Xác đinḥ đươc ̣ thành phần hóa hoc ̣ các chất cótrong cao chiết n-hexan của lá tầm gửi trên cây khếchua.

- Phân lâp ̣ phân đoaṇ môṭsốchất cótrong cây tầm gửi trên cây khếchua

3 Đối tương ̣ vàphaṃ vi nghiên cứu

a) Đối tương ̣ nghiên cứu

Látầm gửi (Loranthaceae) trên cây khếchua đươc ̣ thu hái taịquâṇ Liên Chiểu,

thành phốĐàNẵng

b) Phaṃ vi nghiên cứu

Thành phần hóa hoc ̣ trong cao chiết n-hexan của látầm gửi trên cây khếchua

- Tham khảo các công trinh̀ nghiên cứu trong vàngoài nước vềloài nghiên cứu

- Thu thâp,̣ tổng hơp,̣ phân tich́ các tài liêu,̣ tư liêụ về đăc ̣ điểm hình thái thưc ̣ vât,̣nguồn nguyên liêu,̣ thành phân hóa hoc,̣ ứng dung ̣ của látầm gửi trên cây khế chua

- Tổng hơp ̣ tài liêụ vềphương pháp lấy mẫu, chiết tách, phân lâp ̣ vàxác đinḥ thành phần hóa hoc ̣ các chất từ thưc ̣ vâṭ

b) Phương pháp nghiên cứu thưc ̣ nghiêṃ

- Xử límẫu: cây tầm gửi đươc ̣ rửa sach,̣ phơi khô vàxay nhỏ

- Phương pháp sắc kíkhí– khối phổliên hơp ̣ (GC/MS) dùng đểxác đinḥ các thànhphần cótrong dicḥ chiết khi chiết lỏng – lỏng cao chiết ethanol với dung môi n-hexan

- Phân lâp ̣ phân đoaṇ môṭsốchất trong dicḥ chiết látầm gửi trên cây khếchuabằng phương pháp sắc kýcôt,̣ sắc kýlớp mỏng

5 Ý nghiã khoa hoc ̣ vàthưc ̣ tiêñ của đềtài

Cung cấp cóthông tin cóýnghiã khoa hoc ̣ vềthành phần đươc ̣ chiết tách từ loài

Loranthaceae vàqua đó nâng cao giátri ̣ứng dung ̣ của chúng trong ngành dươc ̣ liêụ.

6 Bốcuc ̣ khóa luâṇ

Luâṇ văn gồm 50 trang, 9 bảng, 30 hinh,̀ 22 tài liêụ tham khảo Ngoài phần mở đầu (3 trang) vàkết luân,̣ kiến nghi (3̣ trang), nôịdung chinh́ gồm các phần sau:Chương 1 Tổng quan (5 trang)

Chương 2 Nguyên liêụ vàphương pháp nghiên cứu (18 trang)

Chương 3 Kết quảvàthảo luâṇ (20 trang)

CHƯƠNG 1

̉e

TÔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ TÂM GƯI

Ho ̣tầm gửi, tằm gửi, chùm gởi hay chùm gửi (Loranthaceae) làmôṭho ̣thưc ̣

vâṭ có hoa, đươc ̣ các nhà khoa hoc ̣ công nhâṇ rông ̣ khắp Trên thếgiới hiêṇ có

khoảng 60-68 giống và700-950 loài tâp ̣ trung chủyếu ởvùng nhiêṭđới vàvùng câṇ nhiêṭđới [17] , [1] Hầu hết các loài tầm gửi đều sống bán kýsinh trên những cây

khác ngoaịtrừ 3 loài sống trên măṭđất làNuytsia Floribunda – cây giáng sinh của Australia, Atkinsonia ligustrina – môṭ loài cây buị rất hiếm của daỹ núi Blue taị Australia vàmôṭloài ởNam MỹlàGaiadendron punctatum Các loài sống kýsinh trên

cây khác tuy cóláxanh cóthểquang hơp ̣ đươc ̣ nhưng cây không vâṇ dung ̣ khả năng này màlaịsống nhờ kýsinh trên cây khác bằng những rễmút thoc ̣ sâu hút nhưạ cây chủ[7]

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY TÂM GƯI

1.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Taxillus chinensis (DC.) Danser

Tên thông thường: Tầm gửi, Mộc vệ trung quốc, Chùm gửi

Theo phân loại thực vật:

Lá: ládày, moc ̣ đối xứng nhau hoăc ̣ so le, cuống láthường không rõràng, phiếnláđơn, hinh̀ bầu duc,̣ gân láthường cóhinh̀ lông chim, lúc non cólông ởgân [5].

Hoa: Hoa lưỡng tinh,́ it́ khi đơn tinh,́ khoảng 4 – 6 cánh hoa, đối xứng hai bênhoăc ̣ đối xứng tỏa tia, nhi ̣hoa nhiều bằng cánh hoa, moc ̣ đối nhau, vòi nhuỵ ngắnhoặc không có

Quả: Cây tầm gửi cóthểlàcây cái (taọ quảmong)̣ hoăc ̣ cây đưc ̣ (chỉtaọ ra phấnhoa) Quảmong ̣ của cây cái thìnhỏ, vỏ thường có chất dính giúp cho việc phát tántrên thân cây chủ vàcómàu hơi vàng

Rễ: Không rễ hoặc có rễ (đúng hơn là giác mút), nửa ký sinh ở các phần trênmặt đất của cây chủ, ít khi ký sinh trên rễ của cây chủ

Hat:̣ Hầu hết hạt của các loại tầm gửi đều được phủ bởi 1 lớp chất lỏng sền sệttrên bề mặt, điều này cho phép chúng bám được trên cây chủ, haṭcóvỏngoài khó nhiǹthấy, nôịnhũnhiều, phôi to [13], [17]

Hinh̀ ảnh lá, hóa vàquảcủa cây tầm gửi đươc ̣ thểhiêṇ ởHình 1.1

Hình 1.1 Lá, hoa, quả của cây Tầm gửi (Nguồn: Internet) 1.2.3 Phân bố và cách trồng

Phân bố

Tầm gửi phân bốchủyếu ởvùng nhiêṭđới vàcâṇ nhiêṭđới Ở châu Á, tầm gửi phân bốchủyếu ởBắc Philippin, Malaysia, Trung Quốc vàViêṭNam [15] Cách trồng

Với việc trồng cây tầm gửi nên được thực hiện vào các tháng mùa xuân (tháng 3-5) là thích hợp nhất cho tầm gửi phát triển.Sau khi trồng thìviệc chăm sóc cây

tầm gửi thường có liên quan chặt chẽ với việc chăm sóc cây chủ Chính vì thế tùyvào từng loại cây chủ bạn trồng tầm gửi mà có chế độ chăm sóc phù hợp sẽ giúptầm gửi bên trên phát triển một cách tốt nhất.

1.3 CÔNG DUNG̣ VA CACH SƯ DUNG̣ CÂY TÂM GƯI

Hầu hết các bộ phận của tầm gửi đều có công dụng chữa bệnh Trong y học cổtruyền người ta sử dụng các thành phần của lá tầm gửi để chữa một số bệnh Câytầm gửi kýsinh trên các cây chủ khác nhau thìcókhảnăng chữa các bênḥ khác nhau

- Tầm gửi trên cây dâu tằm: tên thuốc là tang ký sinh có vị đắng, có tác dụngtrừ phong thấp, mạnh gân cốt, dùng khi chức năng can thận kém dẫn đến đau lưng mỏigối Dùng riêng bằng cách rửa sạch, phơi khô, chặt thành đoạn, sao vàng, sắc uống; hoặcphối hợp với các vị thuốc bổ can thận khác như tục đoạn, cẩu tích, đau xương, tang chi

- Tầm gửi cây chanh dùng trị các chứng ho khan, ho gió, ho có đờm đặc Khidùng thường cũng sao chế như tang ký sinh, có thể phối hợp với các vị trị ho khác nhưtrần bì, tang bạch bì, xạ can, mạch môn dưới dạng thuốc sắc, siro hay viên ngậm

- Tầm gửi cây na, cây tầm gửi trên cây mít còn dùng trị bệnh sốt rét hoặcchứng “hàn nhiệt vãng lai”, tức bệnh có lúc sốt, lúc rét Có thể phối hợp với thanh hao,sài hồ, hoàng cầm, thảo quả, binh lang

- Tầm gửi cây dẻ trị thấp khớp, viêm họng, các bệnh dị ứng, bệnh ngoài da

- Tầm gửi trên cây xoan chữa bệnh đường ruột, kiết lỵ, táo bón

- Tầm gửi trên cây cúc tần cho hạt là vị thuốc thỏ ty tử tác dụng bổ thận trángdương, chữa di tinh, liệt dương, tiểu dầm : hạt tơ hồng (thỏ ty tử) 8g, thục địa 16g, lụcgiác giao, đỗ trọng, mỗi vị 12g, kỷ tử, nhục quế, mỗi vị 10g, sơn thù du, phụ tử chế,đương quy, mỗi vị 8g Ngày một thang, dạng thuốc sắc

- Tầm gửi trên cây gạo có tác dụng tốt để điều trị viêm cầu thận, phù thận, sỏi thận, chức năng gan yếu, gan nóng; đặc biệt làm tăng khả năng thải độc của gan

Lưu ý: tránh dùng những loài tầm gửi trên các cây chủ có độc tính như lim,

trúc đào, thông thiên [12]

6

̉̀ e

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỌ TÂM GƯI

1.4.1 Các công trình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2006, nhóm tác giả người Indonesia gồm Nina Artani, Yelli Ma’arifa vàMuhammad Hanafi đã tách được hợp chất chống oxy hóa là quercitrin (C21H20O11)

và querceti (C15H10O7) từ cao ethanol của cây Tầm gửi Năm nhi ̣Dendrophthoe

pentandra (L.) Miq ký sinh trên cây Khế (Averrhoa carambola) [19] Cấu trúc của

quercitrin vàquerceti đươc ̣ thểhiêṇ ởHình 1.2

Hinh̀ 1.2 Cấu trúc quercitrin và querceti

Tháng 3 năm 2011, nhóm tác giả người Indonesia gồm Wahyu Widowati,Tjandrawati Mozet, Chandra Risdian, Hana Ratnawati, Susy Tjahani, và FerrySandra đã so sánh tính chống oxy hóa và đặc tính ức chế sinh trưởng dòng tế bàoung thư T47D của cao ethanol từ Trầu không Piper betle L., Dừa cạn Catharanthus

roseus (L.) G Don, Tầm gửi Năm nhi ̣Dendrophthoe pentandra L., và Nghệ

Curcuma mangga Val Nhóm nghiên cứu đã sử dụng lá P betle, rễ C roseus, lá và

cành nhỏ của D pentandra ký sinh trên cây xoài, thân rễ (củ) của C mangga làm vật liệu Kết quả cho thấy P betle là nguồn dược liệu thiên nhiên đầy hứa hẹn về khả năng chống oxy hóa và ức chế tăng trưởng tế bào ung thư, cao ethanol của C.

roseus có thể ức chế tăng trưởng tế bào ung thư nhưng không có hoạt tính chống

oxy hóa, cao 6 ethanol của C mangga không chứa cả hai hoạt tính trên Xét riêng cao ethanol của Tầm gửi Năm nhi ̣D pentandra, thấy rằng D pentandra có hoạt

tính kháng tế bào ung thư rất thấp, thậm chí không có Kết quả này kiểm chứng

nghiên cứu trước đây với nước sắc thô của D pentandra trên đối tượng chuột đã

được xử lý với dimetilaminobenzena (DAB) – chất gây ung thư, kết quả cho thấy

không tác dụng (Windarti, 1990), chất querceti ly trích từ D pentandra cũng không

có hoạt tính kháng ung thư theo phương pháp BST (Brine Shrimp Letahlity Test)

(Dewiyanus, 1996), nhưng cao dichlorometan của D pentandra thử nghiệm trên ấu trùng tôm A salina trong 24 giờ lại cho kết quả là có hoạt tính kháng tế bào ung thư (Wahjudi, 1996) Bằng các phương pháp khác nhau, nhóm nghiên cứu cho thấy D.

pentandra có hoạt tính chống oxy hóa rất cao, tương đương với acid ascorbic và

querceti [22]

1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam

Những nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, thời gian qua có một số côngtrình nghiên cứu về Tầm gửi năm nhị đã được công bố Năm 2009, nhóm nghiêncứu của Nguyễn Hoàng Hạt đã tách được 2 hợp chất là β-sitosterol, β-sitosteryl

arachidate từ lá Tầm gửi Năm nhi ̣ký sinh trên cây Mít (Artocarpus heterophyllus

Lamk.) Đây là lần đầu tiên hợp chất β-sitosteryl arachidate được cô lập trong chi

Dendrophthoe [3] Dung dịch của β-sitosteryl arachidate ở nồng độ 3 M đến

10-4 M được biết có tác dụng bảo vệ tế bào MT-10-4 khỏi sự tấn công của virut HIV [110-4].Cấu trúc của β-sitosterol, β-sitosteryl arachidate đươc ̣ thểhiêṇ ởHình 1.3

Hinh̀ 1.3 Cấu trúc hơp ̣ chất β-sitosterol, β-sitosteryl arachidate

Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và cộng sự nghiên cứu khả năng kháng khuẩn củaloài này; bước đầu cho thấy cao ethyl acetate được điều chế từ Dendrophthoe

pentandra ký sinh trên cây Xoài (Mangifera indica) có hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 và Bacillus subtilis PY 79 ở nồng độ 1024 µg/ml [8]

Năm 2011, Phạm Văn Ngọt và cộng sự cho biết:

- Nước sắc của loài Tầm gửi Năm nhi ̣ký sinh trên cây Mít, Xoài, Dâu Tằm

không có khả năng kháng Escherichia coli, Klensiella pneumoniae.

- Nước sắc loài Tầm gửi Năm nhi ̣ký sinh trên cây Dâu tằm có hoạt tính kháng

Bacillus subillis, Staphylococus aureus ở mức yếu; không có hoạt tính kháng

Pseudomomas aeruginosa.

- Nước sắc loài Tầm gửi Năm nhi ̣ký sinh trên cây Mít, Xoài có hoạt tính

kháng khuẩn Bacillus subillis ở mức yếu; kháng Staphylococus aureus và

- Cao khô li trích từ loài Tầm gửi Năm nhi ̣kí sinh trên cây Mít, Xoài, Dâutằm ở nồng độ 1.000µg/ml đều có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, dòng tế bào ung thư phổi NIC – H460 và tế bào ung thư vú MCF – 7 [4]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THƯC̣ NGHIÊṂ

2.1 NGUYÊN LIÊU,̣ DUNG̣ CU,̣HOA CHÂT

2.1.1 Nguyên liêụ

Cây tầm gửi (họ Loranthaceae) đươc ̣ thu hái taịquâṇ Liên Chiểu, thành phố

ĐàNẵng Nguyên liêụ sau khi thu hái, phơi khô, nghiền bôṭđươc ̣ thểhiêṇ ởHinh̀ 2.1

Hinh̀ 2.1 Cây tầm gửi tươi đươc ̣ thu hái, phơi khô vànghiền bôṭ

Mẫu sau thu hái đươc ̣ rửa sach,̣ đểkhô trong không khi,́ nghiền min,̣ bảo quảntrong bao polyetylene vàđưng ̣ trong hôp ̣ cónắp đểnơi râm mát theo quy đinḥ bảoquản bôṭdươc ̣ liêụ

2.1.2 Thiết bi, ̣dung ̣ cu,̣hóa chất

2.1.2.2 Hóa chất

Các hóa chất mua vềđươc ̣ sử dung ̣ trưc ̣ tiếp màkhông qua tinh chếhay chưngcất laị Các hóa chất đươc ̣ sử dung ̣ trong nghiên cứu này đươc ̣ tổng hơp ̣ trong Bảng2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất đã sử dụng

4 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc

2.1.2.1 Thiết bi,̣ dung ̣ cu ̣

Tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh,phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký, bản mỏng và các dụng cụ thínghiệm khác

Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC – MS 7890A/5975C, Agilent technology,USA sử dung ̣ đươc ̣ thểhiêṇ ởHình 2.2

Hinh̀ 2.2 Thiết bi ̣ắsc kýghép khối phổ7890A/5975C, Agilent technology, USA

Đèn UV bước sóng 254 và 365 nm đươc ̣ thểhiêṇ ởHình 2.3.

Hinh̀ 2.3 Đèn soi sắc kýbản mỏng model: WFH – 203B.

2.1.3 Sơ đồ nghiên cứu thưc ̣ nghiêṃ

Sơ đồnghiên cứu thưc ̣ nghiêṃ đươc ̣ trinh̀ bày ởHinh̀ 2.4

Lá cây tầm gửi

(Nguyên liêụ tươi, đươc ̣ thu hái taị quâṇ Liên Chiểu, thành

phố đà nẵng)

Xay

Bột lá cây tầm gửi

Chiết ngâm dầm 3 lần với ethanol

Dịch chiết ethanol

Lọc, cô đuổi dung môi

Tổng cao ethanol

Lắc, chiết phân bố lỏng – lỏng 3 lần với n-hexane

Cô đuổi dung môi

Phân lập phân đoạn

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu thưc ̣ nghiêṃ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGÂM DẦM TAỌ TỔNG CAO ETHANOL TỪ BÔṬ CÂY TẦM GỬI TRÊN CÂY KHẾ CHUA

2.2.1 Nguyên tắc

Ngâm chất rắn (đa ̃đươc ̣ nghiền nhỏ) vào dung môi thich́ hơp ̣ ở nhiêṭđô ̣và thờigian xác đinḥ Sau đóloc ̣ lấy phần dung dicḥ rồi cô đuổi dung môi ởáp suất thấp.Cóthểlăp ̣ laịvài lần đểcơ bản lấy hết lương ̣ chất cókhảnăng hòa tan trong dung môiđó[9]

2.2.2 Cách tiến hành

Lấy 1000 gam bôṭkhô lácây tầm gửi nguyên liêụ vào binh̀ thủy tinh, cho 8 lit́

hệ ethanol-nước tỷ lệ 96 - 4 (w:w) vào, đâỵ nắp binh̀ thủy tinh vàđểyên trong 24giờởnhiêṭđô ̣phòng, sau đólắc đều sau mỗi 15 phút trong vòng 12 giờđểđảm bảo cho

sư ̣khuếch tán tốt Loc ̣ gaṇ lấy phần dicḥ chiết rồi tiếp tuc ̣ loc ̣ qua giấy loc ̣ trên phễuBuschle Lăp ̣ laị2 lần, mỗi lần dùng 7 lit́ ethanol Gôp ̣ các dicḥ chiết vàcô đuổiethanol ta đươc ̣ cao ethanol của látầm gửi trên cây khếchua ởĐàNẵng

Cân xác đinḥ khối lương ̣ cao ethanol thu đươc ̣ vàtinh́ % khối lương ̣ cao chiếtethanol so với khối lương ̣ mẫu ban đầu

K = Ca/Cb

Ca: nồng đô ̣chất tan trong pha (a) taịgiai đoaṇ cân bằng

Cb: nồng đô ̣chất tan trong pha (b) taịgiai đoaṇ cân bằng

Lưạ choṇ dung môi chiết [9]: dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Hòa tan tốt các chất được chiết

- Không tương tác với chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp

- Không hòa tan lẫn với dung môi cũ, nghĩa là có tỉ khối khác nhiều với dung môi cũ.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:

- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan

2.3.2 Cách tiến hành

Lấy 75g cao ethanol đem hòa tan bằng môṭlương ̣ ethanol tối thiểu, tiếp theocho nước cất vào đểđươc ̣ tổng thểtich́ 500 ml, lắc kỹđểcao phân tán đều trong nướcrồi sau đótiến hành chiết lỏng – lỏng với dung môi n-hexane Chiết 3 lần, mỗi lần

400 ml dung môi Thời gian lắc chiết mỗi lần là4 giờ, sau đóchuyển lên phễu chiếtchờtách lớp vàchiết riêng phần dung môi Gôp ̣ dicḥ chiết 3 lần rồi cô đuổi dung môidưới áp suất giảm ta thu đươc ̣ cao n-hexane Cân xác đinḥ khối lương ̣ cao n-hexanethu đươc ̣ vàtinh́ % khối lương ̣ cao chiết n-hexane so với khối lương ̣ của tổng caoethanol

MỎNG

2.4.1 Sắc kýcôṭ

2.4.1.1 Nap ̣ chất hấp thu vào côṭ

Chuẩn bi:̣Sử dung ̣ côṭsắc kýcókich́ thước phùhơp ̣ với lương ̣ cao khảo sát Lấy cốc 500 ml chứa sẵn dung môi n-hexane, cho từ từ silicagel (đa ̃sấy ở130oC trong vòng 6 giờ) vào vàkhuấy đều đăṇ đểđuổi hết boṭkhi.́ Chúý, không rót trưc ̣ tiếp dung môi vào chất hấp thu (silicagel) bởi vìchất hấp thu găp ̣ dung môi se ̃phát nhiêt,̣ cóthểlàm chất hấp thu vón cuc,̣ không đồng nhất Lương ̣ dung môi sử dung ̣ phải vừađủđểhỗn hơp ̣ không đươc ̣ quásêṭ

Ngâm hỗn hơp ̣ khoảng 12 giờhoăc ̣ qua đêm đểsilicagel trương nởhết trong hexane Trước khi nhồi côṭphải quan sát hỗn hơp ̣ n-hexane:silicagel, nếu hỗn hơp ̣không códang ̣ sêṭthìthêm n-hexane vào đểhỗn hơp ̣ trởnên sêt,̣ như vâỵ khi nhồicôṭhỗn hơp ̣ mới cóthểrót chảy xuống côṭdễdàng Dùng kep ̣ đểgiữcho côṭthẳng đứngtrên giá Nới lỏng kep ̣ đểcóthểxoay côṭtheo vòng tròn, không nới kep ̣ rông ̣

n-quáđểtránh trường hơp ̣ côṭkhông đươc ̣ cốđinḥ cókhảnăng rơi vỡ Cho mẫu bông nhỏvào đáy côṭ(tránh silicagel loṭxuống binh̀ hứng) [9].

Cách tiến hành

Dùng môṭ phễu loc ̣ có đuôi dài đăṭ trên đầu côt,̣ cho vào côṭ môṭ lương ̣

hexane (cóthểdùng hexane từ hỗn hơp ̣ hexane:silicagel đa ̃ngâm), dung môi hexane se ̃thấm qua bông gòn, giúp cốđinḥ bông gòn ởbên trong ởbên dưới côṭ không

n-bi ̣lêcḥ khỏi đáy côṭ trong lúc cho hỗn hơp ̣ n-hexane:silicagel vào Mởnhe ̣ khóa ởbêndưới côṭvàdùng lo ̣thủy tinh hứng n-hexane chảy ra bên dưới côṭ Khi bông gòn đa

̃đươc ̣ cốđinh,̣ ta văṇ khóa laịvàchúýtrong côṭbây giờvẫn còn dung dicḥ n-hexane cao khoảng 40 cm so với chiều cao làm viêc ̣ côṭ Đổnhe ̣từ từ hỗn hơp ̣ dang ̣ sêṭvào côṭ Sau khi đổmôṭít hỗn hơp ̣ vào côt,̣ ta xoay nhe ̣côṭtheo vòng tròn vàdùng môṭthanh cao

su gõnhe ̣quanh thành côṭtừ dưới lên trên đểchất hấp thu nén đều trong côṭvàkhông bi

̣lỏng Tiến hành mởnhe ̣khóa ởbên dưới côṭđể dung môi n-hexane tiép tuc ̣ chảy ra từ

từ vàhứng vào môṭlo ̣thủy tinh trống đểở bên dưới côt,̣ tiến hành liên tuc ̣ như vâỵ cho đến khi hết hỗn hơp ̣ đểviêc ̣ nap ̣ côṭ đươc ̣ chăṭche,̃ cho thấy chất hấp thu trong

côṭcódang ̣ đồng nhất

Ta phải làm cho măṭthoáng hấp thu (silicagel) ởđầu côṭnằm ngang Nếu măṭthoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm lên trên phần đầu côt,̣ dùng đũathủy tinh khuấy đảo nhe ̣phần dung môi gần sát măṭthoáng, làm xáo trôṇ môṭphầnchất hấp thu ởtrên đầu côṭ Sau đóđểyên, chất hấp thu lắng xuống từ từ taọ nênmăṭthoáng bằng phẳng Đểổn đinḥ côṭqua đêm nhằm tránh tinh̀ trang ̣ nứt côṭ

2.4.1.2 Nap ̣ mẫu vào côṭ

Cao nghiên cứu đươc ̣ trôṇ với môṭ lương ̣ silicagel vừa đủ rồi cô quay chânkhông đến khô hoàn toàn Sau đólấy ra, nghiền miṇ bằng cối chày sứ thu đươc ̣ mẫucao đa ̃thấm đều trên bềmăṭsilicagel Cho mẫu cao này vào côṭ(đãnap ̣ silicagel) quamôṭphễu nhỏmôṭcách từ từ đểtránh taọ boṭkhívàvón cuc ̣ Côṭsắc kýsau khi nap ̣silicagel đươc ̣ điều chinh̉ lương ̣ dung môi n-hexane cho phùhơp ̣ (đủthấm ướt mẫukhô cho vào) Phủlên trên mẫu môṭlớp silicagel mỏng nữa vàcho môṭit́ dung môi n-hexane ởtrên đầu côt,̣ đểcôṭổn đinḥ qua 3 giờ

2.4.1.3 Chaỵ sắc kýcôṭ silicagel

Rửa giải bằng hê ̣dung môi thich́ hơp ̣ dưạ theo kết quảsắc kýbản mỏng Tốc đô

̣giải ly thay đổi tùy từng trường hơp ̣ cu ̣thể, thông thường từ 0,5 đến 1,5 ml/phút

- Giải ly sử dung ̣ dung môi đơn nồng đô:̣chỉsử dung ̣ đơn dung môi hoăc ̣ hỗnhơp ̣ dung môi nhưng trong hỗn hơp ̣ tỉlê ̣giữa các thành phần không thay đổi, đểgiải

ly cho đến khi viêc ̣ tách chất hoàn tất

- Giải ly cónồng đô ̣tăng dần: đôi khi, viêc ̣ sử dung ̣ môṭdung môi se ̃chỉgiải

ly ra khỏi côṭmôṭsốcấu tử nhất đinḥ nào đóvàmôṭsốcấu tử khác cótinh́ phân cưc ̣ hơnvẫn còn ởđầu côṭ Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi côt,̣ phải dùng môṭdung môi cólưc ̣manḥ hơn Trong quátrinh̀ sắc ký, cần thay đổi nhiều loaịdung môi khác nhau, cólưc ̣manḥ tăng dần đểcóthểđuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi côṭ Muốn tăng tinh́phân cưc ̣ cho môṭ dung môi nào, nhất thiết phải tăng châm;̣ nếu tăng tinh́ phân cưc ̣nhanh, đôṭngôṭse ̃làm gaỹ côṭ Côṭgãy làm mất đi sư ̣liên tuc ̣ của chất hấp thuvàvìthếkhông tách chất tốt đươc ̣

- Theo dõi quátrinh̀ giải ly: hứng dung dicḥ giải ly trong những lo ̣cóđánh số thứ tư.̣ Hứng mỗi lần thểtich́ như nhau là15ml dung dicḥ trong những lo ̣hứng

đươc ̣ làm bay hơi còn khoảng 5 ml vàchấm bản mỏng Những lo ̣cho kết quảsắc ký bản mỏng giống nhau đươc ̣ gôp ̣ chung thành môṭphân đoaṇ

Choṇ phân đoaṇ có lương ̣ cao nhiều vàcó hơp ̣ chất cần phân lâp ̣ (khi đinḥ danh bằng GC/MS) đểtiếp tuc ̣ khảo sát Các phân đoaṇ cólương ̣ cao it,́ kết quả đinḥ danh bằng GC/MS cho nhiều tap ̣ chất, rất khókhảo sát tiếp, vìnếu cócô lâp ̣ đươc ̣ chất tinh khiết se ̃không đủ lương ̣ mẫu đểkhảo sát cấu trúc hóa hoc ̣ bằng phương pháp hóa lýhiêṇ đaị

2.4.2 Sắc kýbản mỏng

Phương pháp này đươc ̣ Izmailop vàSchreiber đềnghi ̣năm 1938, đươc ̣ Stan phát triển, hoàn thiêṇ vào năm 1955 vàcóứng dung ̣ rông ̣ raĩ

Phương pháp sắc kýlớp mỏng đươc ̣ dùng đểđinḥ tinh,́ thử đô ̣tinh khiết vàđôi khi đểbán đinḥ lương ̣ hoăc ̣ đinḥ lương ̣ hoaṭchất thuốc Sắc kýlớp mỏng làmôṭkỹ thuâṭtách các chất đươc ̣ tiến hành khi cho pha đông ̣ di chuyển qua pha tinh̃ trên đó đa

̃đăṭhỗn hơp ̣ các chất cần tách Pha tinh̃ làchất hấp phu ̣đươc ̣ choṇ phùhơp ̣ theo từng yêu cầu phân tich,́ đươc ̣ trải thành lớp mỏng đồng nhất vàđươc ̣ cốđinḥ trên

các phiến kinh́ hoăc ̣ phiến kim loaị Pha đông ̣ là môṭ hê ̣dung môi đơn hoăc ̣ đa thànhphần đươc ̣ trôṇ với nhau theo tỉlê ̣quy đinḥ trong từng chuyên luâṇ Trong quátrinh̀

di chuyển qua lớp hấp phu,̣các cấu tử trong hỗn hơp ̣ mẫu đưuoc ̣ di chuyển trên lớpmỏng, theo hướng pha đông,̣ với những tốc đô ̣khác nhau Kết quả, ta thu đươc ̣ môṭsắc kýđồtrên lớp mỏng Cơ chếcủa sư ̣tách cóthểlàcơ chếhấp phu,̣ phân bố, trao đổiion, sàng loc ̣ phân tử hay sư ̣phối hơp ̣ đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuôc ̣ vào tinh́chất của chất làm pha tinh̃ vàdung môi làm pha đông ̣

Đaị lương ̣ đăc ̣ trưng cho mức đô ̣di chuyển của chất phân tich́ là hê ̣số dichuyển Rf đươc ̣ tinh́ bằng tỷ lê ̣giữa khoảng cách dicḥ chuyển của chất thử vàkhoảng cách dicḥ chuyển của dung môi:

Rr= a/bTrong đó:

a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu

b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi củavết, tính bằng cm

Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thườngđược dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên Nó cũng được các nhà hóahọc tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu đượctrong phản ứng

Nhược điểm của kỹ thuật:

- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển

- Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi

- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫunhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn [9]

2.4.2.1 Chuẩn bi ̣dung ̣ cụ

Hinh̀ 2.5 Hôp ̣ bản mỏng cókich́ thước 20 x 20 cm

- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín đươc ̣ thểhiêṇ ởHinh̀ 2.6

Hình 2.6 Bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy

- Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20ml hoặc các ống mao quản

- Côṭsắc ký(d = 4,5 cm, h = 50 cm)

- Côṭsắc ký(d = 3,5 cm, h = 50 cm)

- Các lo ̣thủy tinh (15 ml)

2.4.2.2 Chuẩn bi ̣bình triển khai

Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bảnmỏng một ít Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa mộtkhoảng để có thể quan sát bên trong Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khivào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5-0,7 cm Dùng môṭmăṭkinh́ đồng hồđâỵkiń binh̀ triển khai đểdung môi không bay hơi trong quátrinh̀ giải ly

2.4.2.3 Chuẩn bi ̣bản mỏng chaỵ sắc ký

Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 1 × 10 cm Dùng bút chìmũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1 cm, mức tiền tuyến dungmôi cách mép trên bản mỏng 0,5 cm

2.4.2.4 Lưạ choṇ dung môi giải ly

Chọn dung môi triển khai phụ thuộc vào mẫu cần tách Với mẫu chưa biếtthành phần, chưa có tài liệu tham khảo cần thử nghiệm với nhiều loại dung môikhác nhau, từ loại không phân cực đến phân cực

Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng nhau, đều nhau trên cùng mộtbản mỏng, các vết chấm cách nhau 1 cm Dùng những vi quản để đưa các dung môi

có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết mẫu một loại dungmôi khác nhau Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo thành vòng tròn Dùng viếtchì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi Quan sát các vòng tròn đồng tâm:dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi

đó quá phân cực, dung môi nào vẫn nằm tại chỗ là dung môi đó không đủ phân cực.Để dễ quan sát hơn, nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triểnkhai sắc ký bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phâncực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone,methanol Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau rồi nhúngmỗi tấm vào một bình như đã chuẩn bị Ghi nhận độ di động của các cấu tử trongmẫu:

+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì dung môi đó chưa đủ phân cực (dung môi không phù hợp)

+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực (dung môi không phù hợp)

+ Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vếtkhác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dàibản sắc ký thì dung môi đó phù hợp

+ Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống dung môi đơn không có những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi

2.4.2.5 Chấm bản mỏng vàsửdung ̣ bình triển khai

Trước khi chấm mẫu lên bản phải dùng bút chì vót nhọn vạch đường mức xuấtphát cách đáy khoảng 1cm và vạch đường kết thúc cách đầu bản 0,5cm

Mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1 mg mẫu đặtlên mặt kiếng đồng hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu với vàigiọt dung môi dễ bay hơi như acetone Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vàodung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầunhọn có chứa mẫu lên trên bản mỏng tại một điểm cách đáy khoảng 1 cm (điểm nàyphải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫnnằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).

Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏngđể không nhìn thấy lỗ bề mặt Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi về mặt thật nhanh đểdung dịch thấm mẫu vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu,điểm này sẽ lan to Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh, không lanthành vết chấm to Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần để có vết đậm,rõ, đường kính không quá 2mm Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dungdịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu

Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cáchđáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm

Khi cho bản mỏng vào dinh̀ triển khai thìphải cầm thẳng đứng bản mỏng rồimới nhúng vào dung môi trong bình Khi nhúng vào phải cẩn thâṇ để2 canḥ bên củabản không chaṃ vào thành binh,̀ lúc đóvi ̣trícủa các vết chấm mẫu nằm trên caocách măṭthoáng của dung môi khoảng 0,5 cm

Đâỵ nắp bình triển khai, dung môi se ̃đươc ̣ hút lên bản bởi lưc ̣ hút mao dẫn.Theo dõi khi mưc ̣ dung môi lên đến vacḥ tiền tuyến dung môi đa ̃đươc ̣ vacḥ sẵntrước đó(cách đầu bản 0,5 cm) thìlấy bản ra khỏi binh,̀ sấy khô bản bằng máy sấy

Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằngcác phương pháp hóa học và vật lý phù hợp

Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử

có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằngmắt thường

Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tiatử ngoại Ngoài ra có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với cáccấu tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ Quansát trong buồng soi UV dưới ánh sáng tử ngoaịbước sóng 254 nm và366 nm.

Nhâṇ xét vềmàu sắc, từ giátri ̣Rf của các vết thu đươc,̣ choṇ hê ̣dung môi khaitriển làhê ̣dung môi cho các vết tách riêng biêṭrõràng

Đểđinḥ tinh́ nhóm chức alkaloid ta sử dung ̣ các thuốc thử: Mayer vàWagner

* Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,36g HgCl2 trong 60ml nước cất và hòa tan 5g KI trong 10ml nướccất,hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100ml

Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu

có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

* Thuốc thử Wagner

Hòa tan 1,27g I2 và 2g KI trong 20ml nước cất Thêm nước cho đủ 100ml.Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu

có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

* Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ethanol

Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong ethanol sẽ cómàu từ vàng đến cam đỏ Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon,

leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron chomàu đến đỏ tím.

*Tác dụng với dung dịch 1% AlCl 3 /ethanol

Tùy theo số lượng, vị trí của các nhóm –OH, hợp chất flavonoid có màu khácnhau từ xanh lục đến xanh đen

* Phản ứng Rosenthaler

Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong ethanol (2 giọt), HClđậm đặc (1 giọt) Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hoặctím

d) Định tính glycosid

Đểđinḥ tinh́ nhóm chức glycosid ta sử dung ̣ các thuốc thử: Keller–Killiani và phenol – H2SO4

* Thuốc thử Keller–Killiani (Phản ứng đặc trưng của đường 2–deoxy)

Dung dịch thuốc thử: dung dịch 5% sulfat sắt Fe2(SO4)3 (1ml), acid aceticbăng (99ml)

Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mớipha, H2SO4 đậm đặc (1–2 giọt) Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu xanh lục sau 1–2 phút.

* Thuốc thử phenol–H 2 SO 4 (Phản ứng của đường)

Dung dịch thuốc thử: phenol (5g), ethanol (95ml), H2SO4 đậm đặc (5ml) Chỉsử dụng thuốc thử mới pha

Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mớipha Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu nâu