Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (pangasius bocourti sauvage, 1880) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 9620301 NGUYỄN THỊ KIM HÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NITRITE, CO2, NHIỆT ĐỘ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÁ BASA GIỐNG (Pangasius bocourti Sauvage, 1880) Cần Thơ, 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Đỗ Thị Thanh Hương Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Thị Kim Hà, Nguyễn Trần Phương Thảo, Nguyễn Thanh Phương, Mark Bayley Đỗ Thị Thanh Hương, 2017 Ảnh hưởng nitrite lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá ba sa (Pangasius bocourti) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 52, Phần B: 93-102 Nguyen Thi Kim Ha, Nguyen Xuan Bieu, Nguyen Thanh Phuong and Do Thi Thanh Huong, 2018 Effect of CO2 on acid-base regulation and growth performance of basa catfish (Pangasius bocourti) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số 54 (2): 18-26 Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam từ nhiều năm với sản lượng nuôi thủy sản năm 2017 đạt 3.835 nghìn tăng 5,2 % so với năm 2016 (Tổng cục Thống kê, 2017) Trong đó, cá tra cá basa đối tượng ni xuất chủ lực vùng Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) Cá tra basa hai loài cá da trơn nuôi với số lượng lớn tỉnh/thành phố An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ,… Cá basa (Pangasius bocourti) có thịt trắng lớn nhanh nên có giá trị thương phẩm cao xuất Các nghiên cứu trước cá basa thường tập trung vào kỹ thuật nuôi, kỹ thuật sản xuất giống (Cacot et al., 2002 Cacot et al., 2003) nhu cầu dinh dưỡng (Phuong, 1998 Hung et al., 2004) Các nghiên cứu sâu khả chịu đựng thích nghi cá basa tác động yếu tố môi trường (nitrite/nhiệt độ/CO2) chưa thực Nitrite tồn ao nuôi thủy sản vấn đề đáng lo ngại nitrite gây độc với tất động vật (Lewis and Morris, 1986) Nitrite xâm nhập vào máu cá oxy hóa hemoglobin (Hb) tế bào hồng cầu chuyển thành hợp chất khác methemoglobin (metHb) gây bệnh máu nâu cá Ngoài ra, nitrite gây ảnh hưởng đến sinh lý, hơ hấp, điều hòa ion, nội tiết,… tốc độ tăng trưởng cá (Kosaka and Tyuma, 1987; Siikavuopio and Saether, 2006; Jensen, 2009; Lefevre et al., 2011) Bên cạnh đó, hàm lượng CO2 khí ngày tăng lên theo phát triển kinh tế công nghiệp hóa Ở cá, nồng độ CO2 nước tăng lên ảnh hưởng tới trình khuếch tán CO2 từ máu mơi trường bên ngồi, gây cân a-xít ba-zơ, gây rối loạn trình diễn tế bào điều hòa ion, tăng nhịp hơ hấp,…(Ishimatsu et al., 2005; Brauner et al., 2004; Gilmour, 2001; Cameron and Iwama, 1987) Nhiệt độ biết đến có ảnh hưởng đến trình sinh lý, sinh trưởng, tỷ lệ sống,… sinh vật yếu tố số tác giả cho có ảnh hưởng đến độc tính nitrite, nhiệt độ tăng hấp thu nitrite cá gia tăng ngược lại (Jeberg and Jensen, 1994; Huey et al., 1984) Trong điều kiện mà nhiệt độ CO2 có xu hướng tăng cao tác động biến đổi khí hậu với thâm canh ương cá basa, đặc biệt ương nuôi ao khí độc mơi trường nitrite yếu tố có ảnh hưởng đến cá, kết hợp với yếu tố với Với lý cho thấy cấp thiết phải có nghiên cứu ảnh hưởng nitrite, nhiệt độ CO2 đến lên cá basa q trình ương ni nhằm cung cấp thơng tin cho quản lý ương ni cá nói chung cá basa nói riêng 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thực với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng yếu tố môi trường nitrite, nhiệt độ gia tăng nồng độ CO2 nước lên sinh lý, tăng trưởng cá basa Kết nghiên cứu cung cấp thêm nguồn thông tin đặc điểm sinh lý thích ứng cá basa với yếu tố nghiên cứu Kết giúp người nuôi nhận biết ảnh hưởng yếu tố đến cá basa nói riêng ngành ni trồng thủy sản nói chung nhằm có biện pháp giảm thiểu ảnh hưởng chúng đến sức khỏe cá q trình ương ni 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu thực với nội dung là: a) Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite nhiệt độ lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá basa b) Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite CO2 lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá basa c) Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite lên hoạt tính enzyme metHb reductase tiêu hao oxy (MO2) cá basa d) Khảo sát số yếu tố môi trường ao ương cá basa giống 1.4 Những đóng góp tính ứng dụng luận án Nghiên cứu cung cấp bổ sung thông tin ảnh hưởng yếu tố nitrite, nhiệt độ CO2 lên đặc điểm sinh lý tăng trưởng cá basa Kết luận án qóp phần đánh giá ảnh hưởng yếu tố nghiên cứu điều kiện biến đổi khí hậu lên ngành ni trồng thủy sản nói chung nghề ni cá basa nói riêng Kết luận án cho thấy nhiệt độ tăng cao đến 33ºC cá có tốc độ tăng trưởng tốt hơn, nhiệt độ dự đoán tăng vào kỷ 21 Do tăng nhiệt độ liên quan đến biến đổi khí hậu theo dự đốn khơng gây ảnh hưởng xấu đến loài cá Tuy nhiên, tiếp xúc với nitrite nồng độ 10% LC50-96 cho kết tiêu sinh lý tăng trưởng bị ảnh hưởng; tiếp xúc CO2 nồng độ từ mmHg trở lên tiêu sinh lý bị thay đổi tăng trưởng cá giảm Đây sở để khuyến cáo người nuôi cần hạn chế tồn nitrite CO2 hệ thống nuôi nhằm quản lý tốt sức khỏe cá nuôi góp phần phát triển nghề ni thủy sản bền vững Bên cạnh ý nghĩa khoa học thực tiễn, kết nghiên cứu nguồn tài liệu tham khảo quan trọng phục vụ cho giảng dạy nghiên cứu liên quan đến cá basa nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nitrite, nhiệt độ CO2 lên đối tượng khác Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite nhiệt độ lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá basa Nội dung thực cá basa có kích cỡ cá 1020 g/con Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ gây độc cấp tính (LC5096 giờ) nitrite tác động nhiệt độ Thí nghiệm gồm 11 nồng độ nitrite: 0; 0,54; 0,65; 0,76; 0,87; 0,98; 1,09; 1,20; 1,31; 1,42 1,53 mM mức nhiệt độ 27°C (nhiệt độ trung bình Việt Nam (Gasparrini et al., 2017) 33°C (nhiệt độ cao, mức nhiệt độ dự đoán tăng kỷ 21 (IPCC, 2014) Thí nghiệm lặp lại lần Mật độ cá 12 con/bể 100 L Đối với nghiệm thức 27°C sử dụng máy làm lạnh hiệu Teco SeaChill TR10 để ổn định nhiệt độ Ở nhiệt độ 33°C dùng heater tiến hành nâng 2°C/ngày giữ ổn định 33°C suốt thí nghiệm Khi nhiệt độ ổn định đạt nhiệt độ thí nghiệm cho nitrite vào bể Nitrite bổ sung thí nghiệm có nguồn gốc từ muối NaNO2 99,9% (Merck) Chuẩn bị sẵn dung dịch gốc có nồng độ NaNO2 M, sau tính tốn thể tích NaNO2 M cần thiết bổ sung vào bể để đạt nồng độ NO2- mong muốn Nitrite kiểm tra lần/ngày để theo dõi bổ sung (nếu nồng độ nitrite thấp mức yêu cầu) nhằm để trì theo nồng độ nghiệm thức suốt thí nghiệm Theo dõi ghi nhận lại số cá chết khoảng thời gian gồm 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 96 Giá trị LC50-96 tính phương pháp Probit sử dụng phần mềm SPSS 16.0 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nitrite lên số tiêu sinh lý cá basa mức nhiệt độ khác Thí nghiệm bố trí với hai nhân tố nhiệt độ nồng độ nitrite Nhiệt độ gồm mức 27°C 33°C kết hợp với nồng độ nitrite: mM; 0,09 mM; 0,22 mM; 0,44 mM, mức tương ứng với 10% (nồng độ thấp), 25% (nồng độ trung bình) 50% (nồng độ cao) giá trị LC50–96 27°C xác định thí nghiệm Cá nuôi với mật độ 40 con/bể 500 L (300 L nước) với lần lặp lại Cách kiểm soát nhiệt độ bổ sung nitrite thực tương tự thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành 14 ngày Thu mẫu máu cá con/bể thời điểm 0; 24; 48; 72, 96 giờ, ngày 14 ngày sau bổ sung nitrite Máu cá thu động mạch đuôi kim tiêm mL có tráng heparin Trước lấy máu, cá bắt nhẹ nhàng vợt lưới gây mê với benzocain nồng độ 0,1 g/L Mẫu máu sau thu chứa eppendorf 1,5 mL giữ lạnh nước đá suốt trình thu Một phần mẫu máu sử dụng sau thu để phân tích tiêu khí máu áp suất CO2 (pCO2) máu pH máu (pHe) máy iSTAT (Mỹ) sử dụng thẻ Cartridge CG3+ Giá trị thực pHe pCO2 tính đền bù nhiệt độ theo nhiệt độ bể thí nghiệm sau đo máy iSTAT, áp dụng theo công thức hướng dẫn sử dụng máy iSTAT Nồng độ HCO3- huyết tương ([HCO3-]) tính theo cơng thức Henderson and Hasselbach (Boutilier et al., 1985) [HCO3-] = αCO2 pCO2 10pHe-pK Phần mẫu máu sử dụng để phân tích tiêu sinh lý hồng cầu, hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct) methemoglobin (metHb) Phần mẫu máu lại ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút phút thu huyết tương để phân tích tiêu glucose, [Na+], [K+], [Cl-], [NO2-], [NO3-], áp suất thẩm thấu (ASTT) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nitrite lên tăng trưởng hoạt tính enzyme (men) tiêu hóa cá basa mức nhiệt độ khác Thí nghiệm bố trí với nồng độ nitrite kết hợp với hai mức nhiệt độ tương tự thí nghiệm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Cá bố trí với mật độ 40 con/bể 500 L (300 L nước) Thí nghiệm tiến hành 60 ngày Cá cho ăn lần/ngày thức ăn viên công nghiệp Cargill 30% đạm với 3% khối lượng thân Thức ăn cân trước cho cá ăn sau cho ăn 30 phút vớt thức ăn thừa (nếu có) đếm viên để xác định lượng thức ăn cá ăn vào hàng ngày nhằm đánh giá hệ số FCR cá Cá chết theo dõi ngày đếm số cá lại kết thúc thí nghiệm để xác định tỷ lệ sống cá Nồng độ nitrite nước phân tích lần/ngày để theo dõi bổ sung thêm nitrite để đạt nồng độ thí nghiệm Khối lượng cá xác định thời điểm trước bắt đầu thí nghiệm, sau 30 60 ngày để đánh giá tiêu tăng trưởng tăng trọng (WG), tốc độ tăng trưởng theo ngày (DWG), tốc độ tăng trưởng đặc biệt (SGR) Ở lần thu mẫu 60 ngày cá thu con/bể Mẫu máu cá dùng để phân tích tiêu miễn dịch Ig (Immunoglobulin) lysozyme Giải phẩu cá thu ruột dày để phân tích loại enzyme chymotrypsine, trypsine, amylase ruột trước (thu khoảng cm tính từ dày) pepsine dày 2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite CO2 lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá basa Nội dung thực cá basa có kích cỡ cá 1020 g/con Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng CO2 lên số tiêu sinh lý cá basa Thí nghiệm gồm nghiệm thức CO2: đối chứng (không bổ sung CO2); mmHg (1% CO2), 14 mmHg (2% CO2) 21 mmHg (3% CO2) Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Cá bố trí với mật độ 45 con/bể 200 L Cho cá ăn lần/ngày thức ăn Cargill 30% đạm Hàm lượng khí CO2 bể thí nghiệm điều khiển tự động máy CO2 hiệu Oxy Guard (Đan Mạch) Hệ thống bao gồm hình cảm ứng Oxyguard Pacific, điện cực CO2 (G10 ps) điện cực pH (K01svpld) (Oxyguard International A/S, Farum, Đan Mạch) kết nối với bình khí CO2 van tự động đóng mở để cung cấp khí CO2 vào bể Thu mẫu máu cá (3 con/bể) thời điểm 1, 6, 24, 48, 72, 96 168 (7 ngày) sau bổ sung CO2 Mẫu máu cá thu để phân tích tiêu khí máu pCO2, pHe, [HCO3-] máy iSTAT (Mỹ) sử dụng thẻ Cartridge CG3+; tiêu huyết học hồng cầu, Hb, Hct, metHb; nồng độ glucose nồng độ ion [Na+], [K+], [Cl-], ASTT huyết tương Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng CO2 lên tăng trưởng tỷ lệ sống cá basa Thí nghiệm gồm nghiệm thức CO2: đối chứng (không bổ sung CO2), mmHg, 14 mmHg 21 mmHg Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Mật độ cá thí nghiệm 30 con/bể 200 L Phương pháp bổ sung kiểm soát nồng độ CO2 thí nghiệm thực tương tự mơ tả Thí nghiệm - Nội dung Thí nghiệm thực 60 ngày Cá cho ăn lần/ngày thức ăn viên công nghiệp Cargill 30% đạm (35% chất béo) với 3% khối lượng thân Thức ăn cân trước cho cá ăn, thức ăn thừa ghi nhận sau 30 phút cho ăn cách vớt đếm số viên (nếu có) Lượng nước bể thay định kỳ tuần/lần với lượng 30% Khối lượng cá cân thời điểm bắt đầu thí nghiệm, sau 30 60 ngày để đánh giá tiêu tăng trưởng tăng trọng (WG), tốc độ tăng trưởng theo ngày (DWG), tốc độ tăng trưởng đặc biệt (SGR) Theo dõi cá chết hàng ngày, có cá chết vớt cân khối lượng để tính FCR Đếm số cá lại kết thúc thí nghiệm để xác định tỷ lệ sống cá Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng kết hợp nitrite CO2 lên số tiêu sinh lý máu cá basa Thí nghiệm gồm nghiệm thức với lần lặp lại: Đối chứng (không bổ sung NO2- CO2), 0,09 mM NO2-, 0,22 mM NO2-, 14 mmHg CO2, 0,09 mM NO2- + 14 mmHg CO2, 0,22 mM NO2- + 14 mmHg CO2 Cá bố trí với mật độ 45 con/bể 200 L Cách bổ sung khí CO2 thực tương tự Thí nghiệm Nội dung 2; cách bổ sung NO2- thực tương tự thí nghiệm Nội dung Thu mẫu máu cá con/bể thời điểm 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 168 (7 ngày) để phân tích tiêu khí máu pCO2, pHe, [HCO3-] tiêu sinh lý hồng cầu, Hb, Hct, metHb; nồng độ glucose ion [NO2-], [NO3-] [Cl-] huyết tương Mẫu mang cá thu con/nghiệm thức thời điểm 1, 6, 24, 72, 96 ngày để quan sát biến đổi cấu trúc mô mang Mẫu mang cố định dung dịch PBS 0,1 M pH 7,4 Đúc khối mẫu methyl methacrylate Technovit®7100 mẫu nhuộm với Eosin Hematoxylin Quan sát mẫu chụp hình kính hiển vi với độ phóng đại 20X Đặc điểm cấu trúc mô học cá khoẻ dựa theo mô tả Wilson and Laurent (2002) Evans et al (2005); cá tiếp xúc với CO2 theo Good et al (2010) Fivelstad et al (2003); cá tiếp xúc nitrite theo Gisbert et al (2004) 2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nitrite lên hoạt tính enzyme metHb reductase tiêu hao oxy (MO2) cá basa đo thuốc thử Griess reaction (Miranda et al., 2001 có hiệu chỉnh) [NO3-] huyết tương đo thuốc thử Griess reaction sau khử NO3- thành NO2- vanadium (III) chloride (Lefevre et al., 2011) Phương pháp phân tích tiêu miễn dịch (Ig lysozyme) Hàm lượng Ig phân tích theo Siwicki and Anderson (1993) hiệu chỉnh Milla et al (2010) Lysozyme phân tích theo Ellis (1990) hiệu chỉnh Milla et al (2010) Phương pháp phân tích enzyme tiêu hố Pepsine chymotrypsine phân tích theo phương pháp Worthington (1982) Amylase phân tích theo phương pháp Bernfeld (1951) 2.6 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu nhập, tính tốn trung bình, độ lệch chuẩn sai số chuẩn phần mềm Microsoft excel 2007 So sánh thống kê khác biệt nghiệm thức one-way ANOVA two-way ANOVA với phép thử DUNCAN, so sánh cặp T-Test Independent T-test sử dụng thí nghiệm xác định tiêu hao oxy cá Các phép so sánh thực phần mềm SPSS 16.0 với mức ý nghĩa α=0,05 10 Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng nitrite nhiệt độ lên số tiêu sinh lý tăng trưởng cá basa 3.1.1 Giá trị LC50-96 nitrite cá basa mức nhiệt độ khác Giá trị LC50-96 nitrite lên cá basa giống (10-20 g/con) mức nhiệt độ 27oC 0,88 mM (Hình 3.1A) cao giá trị LC50-96 33oC 0,60 mM (Hình 3.1B) Như vậy, điều kiện nhiệt độ tăng khả chịu đựng độ độc nitrite cá basa bị giảm Giá trị LC50-96 nitrite cá basa thấp LC50-96 số lồi cá có quan hơ hấp khí trời ĐBSCL cá lóc (Channa striata) 4,7 mM (Lefevre et al., 2012); cá tra (Pangasius hypophthalmus) 1,65 mM (Lefevre et al., 2011); cá thát lát 7,82 mM (Gam et al., 2017) A B Raw data Redicted mean Lower 95% Uppe 95% 1.0 1.0 Proportion mortality Tỷ lệ chết Proportion mortality Tỷ lệ chết 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.6 0.8 1.0 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.2 1.4 [NO2- ] (mM) Raw data predicted mean Lower 95 % Upper 95 % 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 [NO2- ] (mM) Hình 3.1: LC50-96 cá basa 27oC (A) 33oC (B) 3.1.2 Ảnh hưởng nitrite nhiệt độ lên tiêu sinh lý cá basa Khi cá basa tiếp xúc với nitrite nồng độ mức cấp tính số lượng hồng cầu, Hb Hct cá nghiệm thức có nitrite giảm thấp nghiệm thức đối chứng sau 24 giờ, khác biệt thể nghiệm thức 0,22 mM 0,44 mM Sau tiêu tăng trở lại sau ngày (p>0,05) Tỷ lệ metHb, [NO2-] [NO3-] huyết tương bị ảnh hưởng tương tác nitrite nhiệt độ q trình thí nghiệm Các tiêu tăng cao sau 48 tiếp xúc có xu hướng giảm xuống vào cuối thí nghiệm cao có ý nghĩa so với đối chứng (p