Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hóa chất bảo quản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN BÁNH MÌ THAY THẾ HỐ CHẤT BẢO QUẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương ThS Huỳnh Phương Quyên Sinh viên thực : Trần Kim Ngân MSSV: 1411100731 Lớp: 14DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2018 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan công nghệ sản xuất bánh mì 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Quy trình làm bánh mì .4 1.1.3 Ảnh hưởng vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 12 1.1.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì 12 1.1.3.2 Hư hỏng bánh vi sinh vật 13 1.1.3.3 Tác hại nấm mốc .13 1.1.4 Vai trò nấm men lên men bánh mì 14 1.2 Tổng quan bột chua .16 1.2.1 Đặc tính bột chua 16 1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu bột chua 17 1.2.3 Ảnh hưởng phản ứng Maillard Caramel hóa hương vị bánh mì .18 1.2.4 1.3 Con đường trao đổi chất vi khuẩn LAB bột chua 19 Tổng quan vi khuẩn lactic 21 1.3.1 Giới thiệu chung 21 1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus .23 1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 25 1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men – trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 27 1.3.2 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic .28 1.3.2.1 Quá trình trao đổi chất 28 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 29 1.3.3 Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 30 CHƯƠNG MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 2.2 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu .32 2.1.1 Mục tiêu 32 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 32 2.2.1 Nguồn vi sinh vật .32 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn lactic 32 2.2.1.2 Nguồn nấm bệnh 32 2.2.1.3 Nấm men 33 2.2.2 Hố chất mơi trường sử dụng 33 2.2.2.1 Hoá chất 33 2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem Phụ lục 1) 33 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 33 2.2.3.1 Thiết bị 33 2.2.3.2 Dụng cụ 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.4 2.3.1 Phương pháp luận .34 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 35 2.3.3 Thuyết minh quy trình tổng quát 36 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 38 2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum .38 2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh lý, sinh hóa 38 2.4.1.2 Khả sinh acid 41 2.4.1.3 Khảo sát khả kháng nấm A.niger Lactobacillus plantarum in vitro 43 2.4.2 Khảo sát khả đối kháng nấm A.niger đồng lên men bánh mì vi khuẩn LAB với nấm men 45 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng LAB 49 2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu thời gian lên men bột nhào 49 2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51 ii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản mức độ ưa thích loại bánh mì 53 2.4.3.4 Phương pháp phân tích thông số đo .55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 64 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát sinh lý, sinh hóa 64 3.1.2 Khả sinh acid 65 3.1.3 Khảo sát khả kháng nấm A.niger Lactobacillus plantarum in vitro 66 3.2 Khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 68 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu thời gian lên men bột nhào 68 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh 80 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản mức độ ưa thích loại bánh mì 85 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 Kết luận .93 Kiến nghị 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 Tài liệu tiếng Việt 95 Tài liệu tiếng Anh 96 PHỤ LỤC A .1 PHỤ LỤC B .3 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT − DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol − LAB: Lactic acid bacteria − MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar − MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth − PDA: Potato Dextrose Agar − PDB: Potato Dextrose Broth − VSV: Vi sinh vật iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mớc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) .31 Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái sinh lý vi khuẩn L plantarum 64 Bảng 3.2: Độ acid (% TA) chủng Lactobacillus plantarum 66 Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế vi khuẩn Lactobacillus plantarum với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 67 Bảng 3.4: Kết đối kháng nấm mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5, bánh mì chứa chất bảo quản bánh mì khơng hố chất bảo quản 69 Bảng 3.5: Kết đối kháng nấm mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1, bánh mì chứa chất bảo quản bánh mì khơng hoá chất bảo quản 70 Bảng 3.6: Kết đới kháng nấm mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1 Lactobacillus plantarum L5 72 Bảng 3.7: Kết khảo sát thơng sớ hóa lý bánh mì bổ sung Lactobacillus plantarum L5 C1 trước lên men kết thúc .74 Bảng 3.8: Kết khảo sát thông số hóa lý bánh mì bổ sung Lactobacillus plantarum L5 sau lên men kết thúc 75 Bảng 3.9: Kết khảo sát thơng sớ hóa lý bánh mì bổ sung Lactobacillus plantarum C1 sau lên men kết thúc 76 Bảng 3.10: Kết cảm quan mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5 C1 với mớc thời gian lên men .78 Bảng 3.11: Kết khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5-109 80 Bảng 3.12: Kết khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1-109 83 Bảng 3.13: Kết khảo sát thể tích mẫu bánh mì 86 Bảng 3.14: Kết khảo sát độ acid mẫu bánh mì 87 Bảng 3.15: Kết đánh giá cảm quan loại bánh mì .88 v Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.16: Kết khảo sát thời gian bảo quản mẫu bánh mì 91 Bảng 3.17: Kết khảo sát tổng nấm men nấm mớc mẫu bánh mì 92 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Quy trình làm bánh mì .5 Hình 1.2: Máy nhào bột Hình 1.3: Khối bột nhào sau lên men ổn định sơ bộ Hình 1.4: Bột nhào sau tạo hình Hình 1.5: Bột nhào sau lên men kết thúc 10 Hình 1.6: Bánh mì thành phẩm 10 Hình 1.7: Các đường lên men dị hình bột chua điển hình vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu cộng sự, 2008) .20 Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 23 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu .35 Hình 2.2: Sơ đồ bớ trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 36 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hố chủng Lactobacillus plantarum 38 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum 41 Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn .43 Hình 2.6: Mơ tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch đường vi khuẩn 45 Hình 2.7: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm bánh mì.46 Hình 2.8: Sơ đồ bớ trí thí nghiệm khảo sát mật độ LAB tới ưu thời gian lên men bột nhào 49 Hình 2.9: Sơ đồ bớ trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51 Hình 2.10: Sơ đồ bớ trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản mức độ ưa thích loại bánh mì 54 Hình 2.11: Cân sấy ẩm .56 Hình 2.12: Máy đo pH để bàn 57 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc MRS agar 65 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2: Kết nhuộm Gram .65 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger Lactobacillus plantarum L5 Lactobacillus plantarum C1 67 Hình 3.4: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum L5 67 Hình 3.5: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus plantarum C1 68 Hình 3.6: Khảo sát đối kháng in vivo .73 Hình 3.7: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh mì bổ sung vi khuẩn L plantarum L5 109 82 Hình 3.8: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh mì bổ sung vi khuẩn L plantarum C1 - 109 85 Hình 3.9: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan 90 Hình 3.10: Tiến hành thí nghiệm cảm quan phép thử Cho điểm thị hiếu (n= 30 người) 91 viii Đồ án tốt nghiệp TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bánh mì sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối nấm men, nhằm lên men cho nở xốp, sau nướng hay hấp chín Aspergillus niger tác nhân gây hư hỏng bánh mì mang lại thiệt hại lớn kinh tế đồng thời A.niger sản sinh độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Song song đó, chất bảo quản sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản để đảm bảo an toàn sức khỏe cần tạo hợp chất tinh khiết tốn nhiều chi phí cho việc xây dựng quy trình sản xuất Quy trình sản xuất bột chua truyền thống sử dụng nấm men kết hợp vi khuẩn lên men xâm nhập từ khơng khí để tạo nên hương vị đặc trưng cải thiện cấu trúc Mặt hạn chế khó kiểm sốt vi khuẩn xâm nhập Lactobacillus plantarum phân lập từ nem chua, cơm mẻ lên men truyền thống có khả sinh hợp chất ức chế nấm mốc Aspergillus niger Sử dụng vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống đồng lên men với nấm men kéo dài thời gian bảo quản, cải thiện cấu trúc đồng thời dễ kiểm sốt quy trình Dựa vào khả lên men acid lactic, sử dụng phương pháp ria đường vi khuẩn, khả đối kháng nấm bánh mì khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum thời gian lên men bột nhào, khảo sát nhiệt độ nướng bánh đánh giá cảm quan sản phẩm đồng lên men bánh mì với nấm men nhằm kéo dài thời gian bảo quản cải thiện chất lượng sản phẩm Từ khóa: bột chua, chất bảo quản, lactic acid bacteria (LAB), lên men bánh mì, ức chế nấm mốc Đồ án tốt nghiệp Level BM.T BM.Na BM.Ca BM.C1 BM.L5 Least Sq Mean 3,0302036 2,9524442 2,9178610 2,7781513 2,6830727 A A A A A Levels not connected by same letter are significantly different 11 Khảo sát kháng nấm loại bánh mì Response số Ngày nấm mọc – cảm nhiễm với BM.L5 Summary of Fit RSquare 0,639706 RSquare Adj 0,485294 Root Mean Square Error 0,288675 Mean of Response 3,47619 Observations (or Sum Wgts) 21 Analysis of Variance Source DF Sum of Squares Model 2,0714286 Error 14 1,1666667 C Total 20 3,2380952 Effect Tests Source Nparm Loại BM DF Sum of Squares 2,0714286 Least Squares Means Table Level Least Sq Mean BM.L5-10^7 3,5000000 BM.L5-10^8 3,6666667 BM.L5-10^9 3,8333333 BM.L5-10^10 3,6666667 BM.Na 3,0000000 BM.Ca 3,6666667 BM.T 3,0000000 Level BM.L5-10^9 BM.L5-10^8 BM.L5-10^10 BM.Ca BM.L5-10^7 BM.Na BM.T A A A A A B B B B B B Mean Square 0,345238 0,083333 Std Error 0,16666667 0,16666667 0,16666667 0,16666667 0,16666667 0,16666667 0,16666667 Least Sq Mean 3,8333333 3,6666667 3,6666667 3,6666667 3,5000000 3,0000000 3,0000000 47 F Ratio 4,1429 Prob > F 0,0133* F Ratio 4,1429 Mean 3,50000 3,66667 3,83333 3,66667 3,00000 3,66667 3,00000 Prob > F 0,0133* Đồ án tốt nghiệp Levels not connected by same letter are significantly different Response số Ngày nấm mọc – BM.L5 không cảm nhiễm Summary of Fit RSquare 0,873303 RSquare Adj 0,819005 Root Mean Square Error 0,377964 Mean of Response 7,785714 Observations (or Sum Wgts) 21 Analysis of Variance Source DF Sum of Squares Model 13,785714 Error 14 2,000000 C Total 20 15,785714 Effect Tests Source Nparm Loại BM DF Sum of Squares 13,785714 Least Squares Means Table Level Least Sq Mean BM.L5-10^7 7,3333333 BM.L5-10^8 7,6666667 BM.L5-10^9 7,8333333 BM.L5-10^10 8,5000000 BM.Na 8,1666667 BM.Ca 8,8333333 BM.T 6,1666667 Level BM.Ca BM.L5-10^10 BM.Na BM.L5-10^9 BM.L5-10^8 BM.L5-10^7 BM.T Mean Square 2,29762 0,14286 A A B A B C A B C B C C D Std Error 0,21821789 0,21821789 0,21821789 0,21821789 0,21821789 0,21821789 0,21821789 F Ratio 16,0833 Mean 7,33333 7,66667 7,83333 8,50000 8,16667 8,83333 6,16667 Least Sq Mean 8,8333333 8,5000000 8,1666667 7,8333333 7,6666667 7,3333333 6,1666667 Levels not connected by same letter are significantly different Response số Ngày nấm mọc – cảm nhiễm bánh mì BM.C1 Summary of Fit RSquare 0,81457 RSquare Adj 0,735099 Root Mean Square Error 0,377964 Mean of Response 3,785714 48 F Ratio 16,0833 Prob > F F F 0,0002* Prob > F 0,0002* Mean 3,66667 4,00000 5,00000 4,16667 3,00000 3,66667 3,00000 Least Sq Mean 5,0000000 4,1666667 4,0000000 3,6666667 3,6666667 3,0000000 3,0000000 Levels not connected by same letter are significantly different Response số Ngày nấm mọc – BM.C1 không cảm nhiễm Summary of Fit RSquare 0,87049 RSquare Adj 0,814986 Root Mean Square Error 0,48795 Mean of Response 7,47619 Observations (or Sum Wgts) 21 Analysis of Variance Source DF Sum of Squares Model 22,404762 Error 14 3,333333 C Total 20 25,738095 Mean Square 3,73413 0,23810 49 F Ratio 15,6833 Prob > F F F 0,0116* Prob > F 0,0116* Đồ án tốt nghiệp Least Squares Means Table Level Least Sq Mean BM.L5-10^7 3,5000000 BM.L5-10^8 3,6666667 BM.L5-10^9 3,8333333 BM.L5-10^10 3,6666667 BM.C1-10^7 3,6666667 BM.C1-10^8 4,0000000 BM.C1-10^9 5,0000000 BM.C1-10^10 4,1666667 Std Error 0,24295633 0,24295633 0,24295633 0,24295633 0,24295633 0,24295633 0,24295633 0,24295633 Mean 3,50000 3,66667 3,83333 3,66667 3,66667 4,00000 5,00000 4,16667 Level Least Sq Mean BM.C1-10^9 A 5,0000000 BM.C1-10^10 A B 4,1666667 BM.C1-10^8 A B 4,0000000 BM.L5-10^9 A B 3,8333333 BM.L5-10^8 B 3,6666667 BM.L5-10^10 B 3,6666667 BM.C1-10^7 B 3,6666667 BM.L5-10^7 B 3,5000000 Levels not connected by same letter are significantly different Response số Ngày nấm mọc – BM.L5 BM.C1 không cảm nhiễm Summary of Fit RSquare 0,805707 RSquare Adj 0,720704 Root Mean Square Error 0,456435 Mean of Response 7,5625 Observations (or Sum Wgts) 24 Analysis of Variance Source DF Sum Squares Model 13,822917 Error 16 3,333333 C Total 23 17,156250 Effect Tests Source Nparm DF Loại BM 7 of Mean Square 1,97470 0,20833 Sum Squares 13,822917 Least Squares Means Table Level Least Sq Mean BM.L5-10^7 7,3333333 F Ratio 9,4786 Prob > F 0,0001* of F Ratio 9,4786 Std Error 0,26352314 51 Prob > F 0,0001* Mean 7,33333 Đồ án tốt nghiệp Level BM.L5-10^8 BM.L5-10^9 BM.L5-10^10 BM.C1-10^7 BM.C1-10^8 BM.C1-10^9 BM.C1-10^10 Least Sq Mean 7,6666667 7,8333333 8,5000000 6,3333333 6,5000000 7,8333333 8,5000000 Std Error 0,26352314 0,26352314 0,26352314 0,26352314 0,26352314 0,26352314 0,26352314 Mean 7,66667 7,83333 8,50000 6,33333 6,50000 7,83333 8,50000 Level Least Sq Mean BM.L5-10^10 A 8,5000000 BM.C1-10^10 A 8,5000000 BM.L5-10^9 A 7,8333333 BM.C1-10^9 A 7,8333333 BM.L5-10^8 A B 7,6666667 BM.L5-10^7 A B C 7,3333333 BM.C1-10^8 B C 6,5000000 BM.C1-10^7 C 6,3333333 Levels not connected by same letter are significantly different 52 ... nghiên cứu là: Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay hoá chất bảo quản Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan công nghệ sản xuất bánh mì 1.1.1 Giới... mì, đa phần sử dụng canxi propionate để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì Canxi propionate chất bảo quản thông dụng với ngưỡng nồng độ cho phép sử dụng < 0.3% Sử dụng hóa chất bảo quản tiềm ẩn... bánh mì Lactobacillus plantarum L5, bánh mì chứa chất bảo quản bánh mì khơng hố chất bảo quản 69 Bảng 3.5: Kết đối kháng nấm mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1, bánh mì chứa chất bảo