Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hoá chất bảo quản

Dựa vào khả năng lên men acid lactic, sử dụng phương pháp ria 2 đường vikhuẩn, khả năng đối kháng nấm trên bánh mì cũng như khảo sát ảnh hưởng của các mật độ vi khuẩn Lactobacillus plant

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM

ĐỒNG LÊN MEN VỚI NẤM MEN BÁNH MÌ THAY THẾ

HOÁ CHẤT BẢO QUẢN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện MSSV: 1411100731

ThS Huỳnh Phương Quyên : Trần Kim Ngân

Lớp: 14DSH04

TP Hồ Chí Minh, 2018

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Quy trình làm bánh mì 4

1.1.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 12

1.1.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì 12

1.1.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật 13

1.1.3.3 Tác hại của nấm mốc 13

1.1.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì 14

1.2 Tổng quan về bột chua 16

1.2.1 Đặc tính của bột chua 16

1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua 17

1.2.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì 18

1.2.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua 19

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 21

1.3.1 Giới thiệu chung 21

1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 23

1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 25

1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 27

1.3.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 28

1.3.2.1 Quá trình trao đổi chất 28

1.3.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 29

1.3.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 30

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu 32

2.1.1 Mục tiêu 32

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 32

2.2.1 Nguồn vi sinh vật 32

2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn lactic 32

2.2.1.2 Nguồn nấm bệnh 32

2.2.1.3 Nấm men 33

2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng 33

2.2.2.1 Hoá chất 33

2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1) 33

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 33

2.2.3.1 Thiết bị 33

2.2.3.2 Dụng cụ 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Phương pháp luận 34

2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 35

2.3.3 Thuyết minh quy trình tổng quát 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 38

2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 38

2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa 38

2.4.1.2 Khả năng sinh acid 41

2.4.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro 43

2.4.2 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men 45

2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của LAB 49

2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào 49

2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51

2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích

giữa các loại bánh mì 53

2.4.3.4 Phương pháp phân tích các thông số đo 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64

3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum 64

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa 64

3.1.2 Khả năng sinh acid 65

3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro 66

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 68

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào 68

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh 80

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì 85

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93

1 Kết luận 93

2 Kiến nghị 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

Tài liệu tiếng Việt 95

Tài liệu tiếng Anh 96

PHỤ LỤC A 1

PHỤ LỤC B 3

DANH MỤC VIẾT TẮT

− MRS broth:de Man, Rogosa, Sharpe Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một sô hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm môc và nấm men

(Corsetti và cộng sự, 1998) 31

Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn L plantarum 64

Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus plantarum 66

Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus plantarum với nấm môc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 67

Bảng 3.4: Kết quả đôi kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản 69

Bảng 3.5: Kết quả đôi kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1, bánh mì chứa chất bảo quản và bánh mì không hoá chất bảo quản 70

Bảng 3.6: Kết quả đôi kháng nấm giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1 và Lactobacillus plantarum L5 72

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát các thông sô hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 và C1 trước lên men kết thúc 74

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát các thông sô hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum L5 sau lên men kết thúc 75

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát các thông sô hóa lý của bánh mì khi bổ sung Lactobacillus plantarum C1 sau lên men kết thúc 76

Bảng 3.10: Kết quả cảm quan giữa các mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5 và C1 với các môc thời gian lên men 78

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum L5-10 9 80

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát nhiệt độ nướng mẫu bánh mì Lactobacillus plantarum C1-10 9 83

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích giữa các mẫu bánh mì 86

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ acid giữa các mẫu bánh mì 87

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá cảm quan giữa các loại bánh mì 88

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát thời gian bảo quản các mẫu bánh mì 91

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tổng nấm men nấm môc giữa các mẫu bánh mì 92

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 : Quy trình làm bánh mì 5

Hình 1.2: Máy nhào bột 6

Hình 1.3 : Khôi bột nhào sau khi lên men ổn định sơ bộ 8

Hình 1.4 : Bột nhào sau khi tạo hình 9

Hình 1.5: Bột nhào sau khi lên men kết thúc 10

Hình 1.6 : Bánh mì thành phẩm 10

Hình 1.7: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008) 20

Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 23

Hình 2.1 : Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 35

Hình 2.2: Sơ đồ bô trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 36 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus plantarum 38 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum 41

Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đôi kháng của các chủng vi khuẩn với nấm môc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 43

Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 45

Hình 2.7: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.46 Hình 2.8: Sơ đồ bô trí thí nghiệm khảo sát mật độ LAB tôi ưu và thời gian lên men của bột nhào 49

Hình 2.9: Sơ đồ bô trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nướng bánh 51

Hình 2.10: Sơ đồ bô trí thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì 54

Hình 2.11 : Cân sấy ẩm 56

Hình 2.12 : Máy đo pH để bàn 57

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar 65

Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram 6

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men,

nhằm lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín Aspergillus niger là tác nhân

chính gây hư hỏng bánh mì mang lại những thiệt hại lớn về kinh tế đồng thời

A.niger sản sinh ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Song song

đó, chất bảo quản được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản nhưng để đảm bảo antoàn sức khỏe cần tạo ra hợp chất tinh khiết vì thế tốn nhiều chi phí cho việc xâydựng quy trình sản xuất

Quy trình sản xuất bột chua truyền thống sử dụng nấm men kết hợp vi khuẩnlên men xâm nhập từ không khí để tạo nên hương vị đặc trưng và cải thiện cấu trúc

Mặt hạn chế là khó kiểm soát được vi khuẩn xâm nhập Lactobacillus plantarum

được phân lập từ nem chua, cơm mẻ lên men truyền thống có khả năng sinh hợp

chất ức chế nấm mốc Aspergillus niger Sử dụng vi khuẩn lactic phân lập từ thực

phẩm lên men truyền thống đồng lên men với nấm men có thể kéo dài thời gian bảoquản, cải thiện cấu trúc đồng thời dễ kiểm soát được quy trình hơn

Dựa vào khả năng lên men acid lactic, sử dụng phương pháp ria 2 đường vikhuẩn, khả năng đối kháng nấm trên bánh mì cũng như khảo sát ảnh hưởng của các

mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và thời gian lên men bột nhào, khảo sát

nhiệt độ nướng bánh và đánh giá cảm quan sản phẩm khi đồng lên men bánh mì vớinấm men nhằm kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng sản phẩm

Từ khóa: bột chua, chất bảo quản, lactic acid bacteria (LAB), lên men bánh

mì, ức chế nấm mốc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cuộc sống hiện nay, mọi người đều bận rộn với công việc nên họ không cónhiều thời gian dành cho bữa sáng Do đó, sự lựa chọn tuyệt vời nhất cho bữa ănsáng của họ là bánh mì Vì bánh mì vừa đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng, cungcấp đủ năng lượng vừa tiện dụng, nhanh gọn, không mất nhiều thời gian để chuẩn

bị Ngoài dùng làm bữa sáng, bánh mì còn được sử dụng trong các bữa ăn chính nếu

họ không có thời gian nấu nướng hoặc dùng bánh mì ăn kèm với nhiều món khác

Trong những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn / các chấtchuyển hóa của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng) (Stiles, 1996) đã đạt được sựquan tâm của người tiêu dùng vì không độc hại và kéo dài được thời hạn sử dụngcủa thực phẩm LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các visinh vật gây hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thựcphẩm, có thể sản sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do

đó thường được coi là an toàn (GRAS) (Belal J.Muhialdin , Zaiton Hassan andNazamid Saari, 2011) Thời hạn bảo quản bánh mì được kéo dài khi một số chủngLAB nhất định được thêm vào các công thức bánh mì (Muhialdin và cộng sự, 2011,Ogunbanwo và cộng sự, 2008, Rizzello và cộng sự, 2010, Ryan và cộng sự, 2011)

Trong sản xuất bánh mì, đa phần sử dụng canxi propionate để kéo dài thờigian bảo quản bánh mì Canxi propionate là chất bảo quản thông dụng nhất hiện nayvới ngưỡng nồng độ cho phép sử dụng < 0.3% Sử dụng hóa chất bảo quản tiềm ẩnnguy cơ như canxi propionate tạo khối u ở chuột (Pattinson et al., 2004), các acidyếu khác phát triển nấm kháng thuốc (Belal et al., 2013) Việc sử dụng vi khuẩn antoàn trong bánh mì nhằm kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì là một lĩnh vựcnghiên cứu tuyệt vời Vì những lợi ích của LAB mang lại, người thực hiện đề tài đã

chọn hướng cho đề tài nghiên cứu là: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

đồng lên men với nấm men bánh mì thay thế hoá chất bảo quản”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì

1.1.1 Giới thiệu chung

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ

bột mì nhào với nước, muối, nấm men để

lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay

hấp chín Khoảng một nửa số dân trên

thế giới dùng bánh mì làm nguồn lương

thực chính Bánh mì cung cấp tinh bột và

protein Bánh mì có nhiều loại với nhiều

công thức chế biến khác nhau tùy thuộc

thói quen ăn uống của từng vùng như phân loại theo màu sắc của bánh có bánh mìđen, bánh mì trắng, phân loại theo độ cứng của vỏ bánh mì thì có bánh mì vỏ cứng,bánh mì mềm Một số bánh mì có bổ sung sắt, canxi, omega–3

Nguyên liệu chính làm bánh mì là bột mì và nấm men Ngoài ra còn cómuối, đường, sữa, trứng, chất béo, chất thơm, vitamin C, enzyme Phụ gia bổ sung

có thể vì mục đích dinh dưỡng hay mục đích kĩ thuật

❖

Hệ enzyme trong bột mì:

Enzyme trong bột có đầy đủ các hệ trong hạt mì, tuy nhiên trong sản xuấtcần đặc biệt lưu ý protease và amilase Protease phân giải protein cấu trúc bậc ba, do

đó gluten bị vụn nát làm giảm chất lượng bột nhào Protease bột mì có hoạt độ mạnh

ở 45 - 47°C và pH = 4,5 - 5,6 Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease tăngnhưng với chất oxy hoá và muối ăn thì bị kìm hãm Amylase thuỷ phân tinh bột giúpcho bột nhào lên men nhanh và tăng chất lượng bánh vì lượng đường trong bộtkhông đủ cho quá trình lên men Tác dụng tích cực này chỉ đối với amylase vì nóthuỷ phân tinh bột thành maltose, còn α - amylase thuỷ phân tinh

bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt,

Trứng gà

1⁄2 trứng

Cách tiến hành: Các nguyên liệu khô như bột mì, đường, muối, men sau khiđược rây thì trộn chung với nhau trước, sau đó mới cho hỗn hợp nhũ tương sữa,trứng, bơ vào chung vào Tất cả nguyên liệu đã cho vào máy nhào bột thì tiến hànhnhào bột với tốc độ chậm trong vòng 13 phút Khi đó bột nhào đã hết dình vàothành và đáy máy nhào do nguyên liệu liên kết chặt chẽ với nhau thì độ dính giảm.

Yêu cầu: Phải nhào trộn các nguyên liệu đúng công thức tạo điều kiện choprotein bột mì kết hợp với nước tạo gluten ướt Khối bột nhào xong phải dẻo, đànhồi tốt Thử ấn nhẹ lên mặt bột để kiểm tra, sẽ thấy bột đàn hồi (phồng) trở lại vàkhi nhắc ngón tay lên thì bột sẽ không dính vào tay

Hình 1.2: Máy nhào bột

và độ dính giảm Sau một thời gian nhào còn tạo ra pha khí do sự tích lũy các bọtkhí khi nhào và do nấm men tạo ra nên thể tích khối bột tăng.

Ngoài ra, sự ma sát và các phản ứng hóa học xảy ra trong quá trình nhàolàm cho nhiệt độ của khối bột nhào sẽ tăng

Biến đổi hóa lý:

Khi nhào bột, gliadin và glutenin hút nước tạo gluten Sự trương nở củagluten giúp tạo cấu trúc xốp, dẻo và đàn hồi của ruột bánh Tinh bột liên kết vớinước trong quá trình nhào bột

Đồng thời có sự phân ly của muối ăn thành các ion làm tăng độ chặt củakhung gluten Và còn có sự hòa tan của đường và muối

Biến đổi sinh học:

Hô hấp yếm khí sinh thêm khí CO2, rượu ethanol và các sản phẩm phụ cóquá trình lên men tạo ra acid hữu cơ như acid lactic, oxalic, acetic, succinic, malic,formic,…tạo vị chua và hương đặc trưng Lượng khí CO2 tích tụ trong khối bộtnhào tạo nên những túi khí, do đó khối bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt.Khi lượng khí sinh ra nhiều, khung gluten có tác dụng giữ cho các túi khí không bị

vỡ làm ảnh hưởng đến độ nở của bột

2 Lên men ổn định sơ bộ

Trong quá trình lên men bột nhào, nấm men chuyển đường và tinh bột qua các giai đoạn trung gian và cuối cùng tạo CO2 làm nở bột nhào Ngoài ra, còn có các

sản phẩm phụ như acid lactic, acetic, rượu etylic, aldehyt, ester tạo cho bánh mì cómùi thơm đặc trưng.

Trong quá trình lên men bột nhào, tinh bột và chất cao phân tử khác được thủyphân thành những chất có phân tử lượng thấp làm tăng độ tiêu hóa của bánh mì

Cách tiến hành: Sau khi nhào xong, bột nhào đạt yêu cầu thì đem đi lênmen sơ bộ Lên men trong quá trình này là lên men yếm khí, nên cho bột nhào vào

tô và sau đó lấy màng bao thực phẩm đậy kín miệng tô lại Để yên khối bột ủ trongvòng 30 phút ở nhiệt độ thường

Hình 1.3: Khối bột nhào sau khi lên men ổn định sơ bộ

3 Tạo hình

Quá trình tạo hình bán thành phẩm gồm có các bước chia, vê, ổn định cấutrúc và tạo hình bánh Chia bột nhằm định lượng khối bột và tạo ra sản phẩm bánh

mì đồng đều Sai số cho phép là 1 ÷ 1,5% Sau khi chia, cục bột nhào phải được lăn

vê ngay Lăn vê có tác dụng làm cho cấu trúc của bột nhào trở nên tốt hơn và ruộtbánh xốp đều

Đầu tiên, cả khối bột bạt lớn sẽ được chia thành từng phần có khối lượng đồngđều là 50 g Khi đó, mạng gluten của từng viên bột bị đứt gãy và một phần khí carbonicthoát ra ngoài Vê tròn viên bột nhào để củng cố lại mạng gluten đã đứt, làm cho cấutrúc bột nhào trở nên tốt hơn, ruột bánh xốp đều hơn Từng khối bột được vê thành cáckhối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên

men Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trìnhlên men.

Hình 1.4: Bột nhào sau khi tạo hình

4 Lên men kết thúc

Lên men kết thúc có mục đích là hoàn thiện, đây là một khâu quan trọngtrong quy trình sản xuất bánh mì Trong quá trình chia và tạo hình bánh thì mộtphần lớn khí CO2 trong chiếc “bánh sống” đã thoát ra ngoài Lên men cuối nhằmtích lũy thêm lượng khí CO2 tạo thành do nấm men có trong “bánh sống” tạo ra.Lượng khí này sẽ tích tụ làm cho “bánh sống” nở lên và hình thành kết cấu bánhnhư mong muốn

Bột nhào sau khi được tạo thành hình tròn, xếp đều lên khay nướng có lót giấynến và rồi cho vào lò nướng ủ ở nhiệt độ 400C, khoảng 40 phút Đồng thời cho cốcnước vào lò để giữ ẩm cho bột nhào không bị khô trên bề mặt trong quá trình ủ Sau đó,đóng kín cửa lò lại để giữ hơi ẩm lại trong lò và ổn định được nhiệt độ chính xác.Trong lần lên men này, khi bột ủ xong sẽ nở khoảng gấp rưỡi đến gấp đôi

Hình 1.5: Bột nhào sau khi lên men kết thúc

5 Nướng bánh

Mục đích của nướng bánh là để chế biến và bảo quản Nướng bánh là quá trìnhlàm chín sản phẩm, tạo hương vị, màu sắc cho bánh mì thành phẩm Nhiệt độ nướngcao còn có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật, ức chế hệ enzyme có trong bột nhào

Cách tiến hành: Sau khi lên men kết thúc xong thì đem đi nướng ở nhiệt độ

1700C trong vòng 13 phút Trước khi nướng, dùng bình tia phun nước lên khoảngkhông phía trên bánh và thành lò Rồi đóng nhanh cửa lò lại, làm như vậy để tạo hơinước cho quá trình nướng bánh Hơi nước giúp giữ ẩm cho mặt bánh, để mặt bánhkhô cứng chậm hơn, tạo điều kiện cho bánh nở tối đa và giúp cho vỏ bánh vàngchậm hơn Vì khi mặt bánh cứng lại quá nhanh sẽ kìm hãm độ nở của ruột bánh

Hình 1.6: Bánh mì thành phẩm

Các biến đổi trong quá trình nướng

Biến đổi độ ẩm và nhiệt độ của cục bột nhào

Trong quá trình nướng, các lớp khác nhau trong bánh như vỏ bề mặt, lớp sát

vỏ và ruột bánh có những thay đổi khác nhau Nước ở lớp ngoài vỏ bánh sẽ dichuyển vào bên trong ruột và một phần bốc hơi Điều này xảy ra là do quá trìnhtruyền nhiệt từ lớp ngoài vào trung tâm do chuyển ẩm từ nơi có độ ẩm cao (dưới lớp

vỏ bánh) đến nơi có độ ẩm thấp (môi trường)

Biến đổi sinh hóa và vi sinh vật

Trong quá trình nướng bánh, có gần 70 chất gây hương được tạo thànhthuộc các nhóm rượu, acid, ester, aldehyde, ceton, …tạo hương thơm đặc trưng chobánh mì Ở nhiệt độ 700C, nấm men và vi sinh vật sẽ ngừng hoạt động Nhiệt độ cao

có tác dụng thúc đẩy cường độ thủy phân tinh bột

Ngoài ra, phản ứng Maillard ở lớp vỏ tạo màu nâu và các chất thơm kháccho bánh Cường độ màu của vỏ bánh phụ thuộc vào hàm lượng acid amin vàđường khử trong bột nhào

Các quá trình keo hóa xảy ra

Quá trình đông tụ protein và hồ hóa tinh bột là hai quá trình keo hóa chủ yếutrong quá trình nướng giúp bánh chín và có giá trị cảm quan Tinh bột đã hồ hóa liênkết với nước tự do trong bột nhào và nước tách ra từ quá trình biến tính protein Nước

tự do trong bánh giảm đi làm cho ruột bánh mì khi chín trở nên khô ráo Protein bị biếntính tạo thành bộ khung cho bánh mì, cố định hình dạng của bánh Các hạt tinh bột đã

nở ra trong khi nướng thì bao quanh mạng lưới protein đông tụ

Thay đổi thể tích và khôi lượng bánh nướng

Việc tăng thể tích bánh là do các chất khí như CO2, chất mùi… và hơi nướcsinh ra trong quá trình lên men và nướng bánh Các chất khí này dãn nở trong quátrình nướng và tạo ra các lỗ trong ruột bánh

Trong quá trình nướng, khoảng 95% sự giảm trọng lượng của bánh là do ẩmtách ra khỏi bánh Ngoài ra còn do quá trình bay hơi của các chất khí khác.

6 Làm nguội

Sau quá trình nướng, bánh mì cần được làm nguội trước khi đưa vào baogói để bảo quản

1.1.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì

Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 200C, ẩm độcủa bột dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảoquản bột trong thời gian dài Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn

và nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ

ẩm không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt

độ ổn định Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 –13% giữ được 1 năm

1.1.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì

Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm Khilàm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bộtnhào Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào

tử chịu nhiệt còn tồn tại Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 2000C, các visinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử củachúng vẫn còn sống Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử phát triển làm hỏngbánh mì Trong quá trình vận chuyển và bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vậttrong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm Vì vậy khi vận chuyển và bảoquản cần đảm bảo vệ sinh an toàn

1.1.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật

Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêudiệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trongquá trình vận chuyển và bảo quản Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì

− Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn

khoai tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra Khi chúng phát triển sẽ tiết raenzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫmmàu và có mùi khó chịu Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột

nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5 - 5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus

mesentericus và Bacillus subtilis phát triển.

− Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trongruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ Bệnh này không nguy hiểm

đối với người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum.

− Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tửnấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh

mì cao và xếp quá chặt

− Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong

bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng.Nấm này chịu nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh Khi chúng pháttriển trên bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tốkhi ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu

1.1.3.3 Tác hại của nấm môc

Những tổn thất về kinh tế và các nguy cơ sức khoẻ do độc tố nấm gây ra làmối quan tâm chính của ngành công nghiệp thực phẩm (Gray & Bemiller, 2003).Theo Gerez và cộng sự (2009) sự hư hỏng do nấm của các sản phẩm bánh mì xảy raphổ biến nhất ở các nước có độ ẩm và nhiệt độ cao Pitt và Hocking (1999) ước tínhrằng khoảng 5-10% sản lượng lương thực bị hư hỏng do sự tăng trưởng của men vànấm trong các nguyên liệu thực phẩm Tương tự, ở Tây Âu, sự gia tăng của sự hư

hỏng của bánh mì ước tính đạt hơn 200 triệu Euro một năm (Legan, 1993; Schnürer

& Magnusson, 2005) Aspergillus và Penicillium là những loại nấm phổ biến nhất gây hư hỏng thức ăn trong khi các loài Fusarium được báo cáo là gây hư hại các hạt

ngũ cốc trong ruộng (Samson và cộng sự, 2000) Ngoài ra, nấm tạo ra hương vị khóchịu, sản xuất mycotoxins và các hợp chất gây dị ứng Có hơn 400 loại độc tố nấmgây ra bởi các loại nấm khác nhau (Filtenborg và cộng sự, 1996) Sáu loại chất độcđộc hại thường gặp trong các loại thực phẩm khác nhau là: aflatoxins, fumonisins,ochratoxins, patulin, trichothecenes và zearalenone (Dalié và cộng sự, 2009)

Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),

ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic Aspergillus niger chứa nhiều độc

tố, một số vô hại Các độc tố của nó chứa malformin C và ochratoxin A

1.1.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì

Nấm men được dùng trong sản xuất bánh mì thuộc giống Saccharomyces, loài cerevisae, lớp Ascomycetes, ngành Nấm Nấm men Saccharomyces cerevisae có

khả năng sử dụng glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn carbon; sửdụng acid amin, muối ammonium như nguồn nitơ

Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bộtnhào Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽtạo nên các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm Vì vậy, nấm men có vaitrò rất quan trọng trong lên men bánh mì Nấm men sử dụng đường có trong bột mìlàm cơ chất chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình:

6 12 6 → 2 2 5 + 2 2

Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối bộttrở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có trongmạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành

túi chứa CO2 Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nênnhững lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp.

Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra nhữngphản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton,furfurol nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì Đặc biệt khinướng bánh, gần 70 chất gây hương vị được tạo thành và có xảy ra phản ứng Maillardsinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là cácpolymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung

là melanoidin) Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp trongbột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng

Các dạng nấm men thường sử dụng trong

công nghệ sản xuất bánh mì là men ép, men khô,

men lỏng và men ủ chua Men ép và men khô

được sản xuất từ nhà máy chuyên sản xuất nấm

men Men lỏng và men ủ chua thường được chuẩn

bị ngay trong nhà máy sản xuất bánh mì Thường

trong sản xuất bánh mì, người ta dùng men khô

nhập khẩu của nước ngoài

Men khô có hai loại là Active dry yeast và Instant yeast Nhưng thườngđược sử dụng nhất là Instant yeast (men Instant), bởi vì có thể trộn thẳng với bột màkhông cần phải kích hoạt và có nhiều ưu điểm Men Instant cũng là men khô, hạtmịn, màu nâu nhưng không cần kích hoạt, giúp tạo ra nhiều hơi khí hơn, hoạt độngmạnh hơn và chịu được cồn cao hơn các loại men kia Cho nên cùng với một lượngbột thì lượng men instant sẽ ít hơn là men Active dry

Cần lưu ý rằng không phải càng nhiều men thì bánh càng nở to mà cho ra kếtquả ngược lại, men quá nhiều thì hoạt động càng nhiều sẽ sinh ra nhiều hơi rượu, hơi khí và làm cho bột chua hơn bình thường Hơn thế nữa, vì có quá nhiều hơi khí

trong bột nên khi nướng bánh nở rất nhanh trong khi các sợi gluten chưa kịp cứnglại, có thể làm bánh sẽ xẹp ngay từ trong lò.

1.2 Tổng quan về bột chua

Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhàochua là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999) Khối bộtlỏng sẽ được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ

để làm mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994;Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996) Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừnấm men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) Trong quá trình tạo bột chuatruyền thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độxốp, sau đó để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc vớikhông khí Khối bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài racòn có nước, muối và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trongmột thời gian ngắn trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng Kết quả, bánh mì cóhương vị tuyệt vời hơn nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc

bổ sung vào 2-5% phần sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz,1991) Trong quá trình chuẩn bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật

độ vi khuẩn lactic vào khoảng 108 – 109 cfu/g còn nấm men thì 106 – 107 cfu/g, để

có thể làm acid hóa giúp lên men khối bột và làm nở bột Tuy nhiên, LAB có thểnhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1 sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởiđộng thương mại có chứa các dòng LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trìnhlên men công nghiệp (Vuyst & Neysens, 2005)

1.2.1 Đặc tính của bột chua

Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơbản đại diện bởi LAB và nấm men Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa.Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước Cơ chế chuarất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998) Trong quá trình lên men, các thay đổi

sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt độngcủa vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983) Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựavào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổnghợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan trọngnhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng sự,1999) Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng độthích hợp 108 cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm menthông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng sự,2002) Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men / LABthường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996).

1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua

Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị chobánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983) Các hoạt động trao đổi chấtkết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến đặc tínhcủa bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự tăng trưởngcủa nấm mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura, Soumalainen

& Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần hương vị điểnhình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998; Katina và cộng sự,2005) Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được sản xuất Hợp chấtkhông bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn đồng hình (Gobbetti,Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti,

& De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh

mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985; Galal,Johnson, và Varriano-Marston, 1978) Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi

của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh Tất cả cáchợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóatrong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983)

Hợp chất không bay hơiPhản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đếnhoạt tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặctính kết cấu bánh mì Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinhtrong bột đã thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase, lipase, endo xylanase,amylase và protease

❖

Hợp chất bay hơi

Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bayhơi khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic Các sản phẩm được tạo racủa quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho khác Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chấtthơm Sản xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp

của các chủng đơn lẻ S cerevisiae và C guilliermondii, L plantarum đã được thử

nghiệm, được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose vàglucose (Stolz và cộng sự, 1993) Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bayhơi đã được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal,rượu isobutyl, và propanol

1.2.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương

vị của bánh mì

Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hìnhthành hương vị trong các sản phẩm khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đếncác tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe

& Ruttloff, 1983) Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình

lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và

cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983,Rothe, 1974) Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, &

De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị

bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002;Damiani và cộng sự, 1996) Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lýnhiệt độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và cácsản phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram,

& Guy, 2000) Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones,thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự,2002) Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh(Ji và Berhard, 1992) Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kểđến hương vị của bánh mì

1.2.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua

Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose,fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose Lượngglucose tăng trong quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện củanấm men do tác động của VSV Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lênmen maltose, một loại đường phổ biến trong bột Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn cóthể phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý

L sanfranciscensis Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic

qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất,ngoài acid lactic, CO2, acid acetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình) Hexoses khác vớiglucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6-phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson, 1999) Disaccharidesđược chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối với monosacarit, sau

đó nhập vào con đường chính Pentoses là phosphoryl hóa và chuyển đổi sang 5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases hoặc isomerase và sau đóchuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson, 1999) Sử dụng pentoseskhông chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa phosphoketolase cấu thành, cácenzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men

ribulose-dị hình bắt buộc); LAB lên men ribulose-dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông quaglycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành(enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắtbuộc Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hìnhtùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995) Quátrình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid axetic;không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt đượccác trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinaseacetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosinetriphosphate, buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson,1999) Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen

hoàn chỉnh của Lactobacilli, bao gồm L brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L.

plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và L reuteri cũng được tìm thấy trong

bột chua hoàn chỉnh

Hình 1.7: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid

lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008)

Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mìđược kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởngđến thế oxi hóa khử tế bào và môi trường Chuyển hóa đồng hình và dị hình khácnhau về yêu cầu tái tạo đồng phân giảm, giảm nicotinamide adenine dinucleotidehoặc nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Việc sử dụng các chất đồngnhất, như oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắtbuộc phải kết hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão Dựa trên các yêucầu trao đổi chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dịhình có ảnh hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua ảnh hưởng đếnchất lượng bánh mì ngoài sự hình thành của acetate.

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.3.1 Giới thiệu chung

Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:

− Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua

− Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic

− Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là

Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic).

− Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hìnhthành

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năngtạo bào tử Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom vàenzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh Chúng phângiải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển Chính do sự sinh acid lactic, một acid yếunên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng để ức chế

sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng LAB có thể lên men các loại

đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩnlactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lênmen saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic

không lên men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các

loại polysaccharide khác

Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trênhình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độkhác nhau, quy trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao,

và chịu được acid hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phầnacid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học ditruyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại Theo khóa phân loại của Bergey,

họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae.

− Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.

− Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus.

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là

cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột Một số loài trong họ vi

khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh Nhóm vi khuẩn lactic rất đa

dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hìnhque Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình Khả năng tổnghợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn ĐứcLượng, 2002) Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm Các tếbào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tếbào trực khuẩn lactic từ 1 – 8 μm Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi

Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồnetylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một

số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%) Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển

ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởngtối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC Khi gianhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút Sự phát triển của nó cần

có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin Chúng có yêu cầu đặc biệt vềchất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy

ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lênmen bị dừng lại Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: phân huỷ protein của sữathành các peptit và acid amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trựckhuẩn cao hơn Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit Một số loài có khảnăng tạo thành màng nhầy Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh vàcác vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm Như vậy, ngoài khả năng tạothành acid lactic, các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tínhkháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin) Những chất kháng sinhnày không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệuquả khả quan Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo

được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi ) như Streptococcus diacetylactic.

1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giông Lactobacillus

Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hìnhcầu và hình que Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài

Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus

Phân loại khoa học:

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L.

brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử,catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổichất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes

Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ

sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năngcũng có chứa các vi khuẩn này Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng

như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus,

Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum Sự phân chia của vi khuẩn

lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài

Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm.

− Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium,

có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) Chúng lên men đượchexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng pháttriển ở 450C

− Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên menđồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic

− Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruộtkích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do

nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp lactose, bệnh về da

như: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùngđường hô hấp

1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vikhuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Để sinh trưởng bìnhthường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồncarbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúngcòn có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

❖

Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ cácmonosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose,maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn carbonnày để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trìnhlên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

❖

Nhu cầu dinh dưỡng nitơMỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn

vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ

Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồnnitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như:cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay, caonấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất Tuy nhiên ởquy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

Nhu cầu về vitaminVitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tếbào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactickhông có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường cácloại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men

❖

Nhu cầu các chất hữu cơ khácNgoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu

cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.Một số acid hữu cơ

có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric,acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleiclàm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩnlactic Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quantrọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dướidạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

❖

Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần cácmuối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia

và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và

ổn định cấu trúc tế bào

❖

Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiếu khí (microaerophile), sinh trưởng

trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí

(B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995) Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống đượctrong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên,trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trongđiều kiện kị khí

1.3.1.3 Các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật pháttriển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệusuất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinhdưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trìnhnuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩmsinh khối sau này

❖

Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiếtcho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chấtvới môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic

có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trìnhnuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyểnhóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡnglàm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin),vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinhdưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nângcao hiệu suất lên men

❖

Yếu tố môi trường

− Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt

độ càng cao thì sự lên men càng mạnh Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃ Một số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5℃ (B.J.B

27

Wood and Holzapfel W.H, 1995).

− Ảnh hưởng của pH

Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid,khoảng pH của chúng có thể từ 4,5 – 8,5 Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh

ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuynhiên nó cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quátrình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp

− Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ởnhững mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quátrình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

1.3.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic

1.3.2.1 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thôngqua việc lên men lactic Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia

vi khuẩn lactic làm hai nhóm:

❖

Vi khuẩn lên men lactic đồng hình:

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acidlactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic,acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

6 12 6 → 2 3 CHOHCOOH + 21,8.10 4 J

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chutrình EMP (Embden - Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho

quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đếnpyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylasecho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.

❖

Lên men lactic dị hình:

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩmphụ như acid acetic, ethanol, acid succinic, CO2 Phương trình chung biểu diễn quátrình lên men:

6 12 6 → 3 CHOHCOOH + HOOC(CH 2 )COOH + CH 3 + 2 5 + 2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượuetylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó

là sự tích lũy một lượng lớn acid formic Như vậy, trong quá trình lên men lactic dịhình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trìnhnày phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình Theo quan điểmtiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình làhướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình

1.3.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tínhkháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiềutrong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trongnhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược vànhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm Khi ứng dụng trong bảo quản thựcphẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt,

có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữđược trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhucầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thựcphẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ

như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007) Vi khuẩnlactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinhhọc Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính khángnấm như reuretin, acid lactic,

1.3.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic

LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đếnviệc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2,phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặtcủa LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó Điều này thúcđẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong cácthực phẩm được xử lý nhiệt Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ pHrộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau Đây có thể coi là một yếu

tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so sánh với chấtbảo quản hóa học (Belal J Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011) Giống

Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo

nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt động kháng nấm của

L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3

-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001) Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đãxác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấmmen khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (bảng 1.1); Lavermicocca và cộng sự, 2000;Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren,2005) Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ

và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và

Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này

(Roy và cộng sự, 1996)