15.37 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Vi POLYSACARID CỦA VẮC XIN THƯƠNG HÀN Vi POLYSACHARID Nguyên lý Xác định hàm lượng Vi polysacarid phương pháp hố miễn dịch thích hợp, sử dụng polysacharid tinh chế chuẩn làm mẫu chuẩn Sử dụng phản ứng điện di miễn dịch rocket để xác định hàm lượng Vi polysacharid vắc xin thương hàn Vi Phương pháp tiến hành Pha dung dịch đệm thạch agarose - Pha dung dịch đệm barbital ½ - Rót dung dịch đệm barbital ½ vào bể điện di - Pha thạch agarose (0,5g thạch agarose hoà vào 40 ml dung dịch đệm bacbital ½), đun cách thuỷ đun máy khuấy từ gia nhiệt thạch tan chảy hoàn toàn - Để thạch nguội đến khoảng 56 oC, cho ml huyết thỏ kháng Vi vào lắc nhẹ tròn chai thạch cho huyết thỏ kháng Vi hoà tan vào thạch không bị tạo bọt Tạo gel đục lỗ thạch - Đổ thạch khuôn, chờ thạch nguội hoàn toàn - Đục lỗ thạch đục lỗ chuyên dụng cho giếng gel phải cách mép gel cm cách 1cm Số lượng giếng gel phải tính tốn cho có đủ giếng cho hàm lượng kháng nguyên Vi chuẩn, giếng (làm kép) cho mẫu thử Pha mẫu kháng nguyên Vi chuẩn - Pha loãng kháng nguyên Vi chuẩn dung dịch PBS độ pha loãng sau: 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg Vi polysacharid /ml - Lần lượt nhỏ mẫu chuẩn độ pha lỗng vào giếng gel (5µl/giếng); cho vào giếng giếng 5µl vắc xin mẫu thử Chạy điện di miễn dịch Rocket - Đặt gel vào máy điện di theo hướng mẫu từ cực âm sang cực dương - Bật nguồn, cài đặt thơng số thích hợp hiệu điện thế, cường độ dòng điện thời gian chạy điện di mẫu - Dùng giấy lọc Whatman làm cầu nối từ bể dung dịch điện di tới gel đầu gel - Bấm nút ”Run” để chạy điện di Rửa gel - Sau chạy điện di xong, tắt nguồn, lấy gel khỏi máy điện di, cho vào hộp nhựa có nắp kín - Cho nước muối sinh lý ngập gel ngâm, lắc nhẹ máy lắc (thay nước muối sinh lý giờ/lần) - Hút muối sinh lý thay nước cất Ngâm lắc hộp nước cất có chứa gel liên tục Sau ngâm giờ, thay nước cất 30 phút/ lần Ủ gel - Đổ toàn nước cất khỏi hộp - Phủ lớp giấy lọc lên mặt gel để tránh cho gel không bị khô không đồng - Ủ gel qua đêm tủ ấm 37 oC Nhuộm tẩy gel - Bóc bỏ lớp giấy lọc mặt gel - Nhuộm gel dung dịch nhuộm màu 15 phút Trong trình nhuộm, lắc hộp dung dịch nhuộm màu có chứa gel máy lắc - Hút bỏ toàn dung dịch nhuộm màu bơm dung dịch tẩy màu vào hộp chứa gel; ngâm, lắc liên tục nhìn rõ cột tên lửa gel Nếu gel xanh đậm, thay dung dịch tẩy màu nhằm rút ngắn thời gian tẩy màu gel Đọc tính kết - Bản gel đưa khỏi hộp nhựa đặt phiến kính - Dùng thước đo chuyên dụng để đo chiều cao cột tên lửa gel, từ giếng kháng nguyên chuẩn mẫu thử - Dựa vào chiều cao cột tên lửa, xây dựng đường chuẩn tính kết hàm lượng kháng nguyên Vi từ mẫu thử chương trình Excell Đánh giá kết - Loạt vacxin thương hàn Vi polysacharid coi đạt yêu cầu số hàm lượng Vi polysacarid thử nghiệm có giá trị (valid) đạt 35 – 65 µg polysacharid/ 0,5 ml vắc xin - Nếu thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysacharid khơng có giá trị (invalid) lý phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu lượng mẫu lần kiểm tra thứ - Nếu thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysacharid có giá trị (valid) khơng đạt yêu cầu hàm lượng quy định nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu gấp đôi Ở lần kiểm tra thứ hai hàm lượng Vi polysacarid đạt yêu cầu (nằm khoảng cho phép tiêu chuẩn chấp thuận loạt vắc xin coi đạt yêu cầu hàm lượng Vi polysacharid Nếu kết hàm lượng Vi polysacharid không đạt yêu cầu loạt vacxin phải huỷ bỏ, khơng phép xuất xưởng đưa vào sử dụng Tiêu chuẩn chấp thuận (25 µg ± 30%) Vi polysacharid/ 0,5ml (1 liều đơn vắc xin dùng cho người) ... Loạt vacxin thương hàn Vi polysacharid coi đạt yêu cầu số hàm lượng Vi polysacarid thử nghiệm có giá trị (valid) đạt 35 – 65 µg polysacharid/ 0,5 ml v c xin - Nếu thử nghiệm xác định hàm lượng Vi. .. kết hàm lượng Vi polysacharid khơng đạt u cầu loạt vacxin phải huỷ bỏ, khơng phép xuất xưởng đưa v o sử dụng Tiêu chuẩn chấp thuận (25 µg ± 30%) Vi polysacharid/ 0,5ml (1 liều đơn v c xin dùng... thử nghiệm v i số lượng mẫu gấp đôi Ở lần kiểm tra thứ hai hàm lượng Vi polysacarid đạt yêu cầu (nằm khoảng cho phép tiêu chuẩn chấp thuận loạt v c xin coi đạt yêu cầu hàm lượng Vi polysacharid