Đánh giá hiệu quả diệt muỗi của tinh dầu thô tách chiết từ cây Hương Thảo (Rosemary)

LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, nhóm nghiên cứu đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, nhóm nghiên cứu xin gửi đến quý thầy cô ở Viện Sinh học - Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm là nền tảng, cơ sở vững chắc cho nhóm nghiên cứu thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, nhóm nghiên cứu xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến thầy Phạm Hồng Hiếu và cô Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã tận tình hướng dẫn, gợi ý và giúp đỡ nhóm nghiên cứu trong việc nghiên cứu và hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Viện Sinh học - Thực phẩm đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. Đồ án tốt nghiệp này, nhóm nghiên cứu đã tìm hiểu và tiến hành trong suốt sáu tháng. Bước đầu đi vào thực tế, tìm hiểu về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô để kiến thức được hoàn thiện hơn. Sau cùng, xin kính chúc quý thầy cô thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. TÓM TẮT Hiện nay các chế phẩm sử dụng để diệt muỗi trên thị trường đa số là các hóa chất nên ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe người sử dụng. Tinh dầu hương thảo có khả năng diệt muỗi nhưng lại chưa được ứng dụng rộng rãi. Đề tài nghiên cứu tập trung vào hai nhiệm vụ chính: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu hương thảo bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước với các thông số tối ưu: Nồng độ NaCl trong nước ngâm chiết 4%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 3/1 (ml/g), thời gian ngâm nguyên liệu 0 giờ (nghĩa là không thực hiện công đoạn ngâm) trước khi chưng cất, thời gian chưng cất 80 phút - Đánh giá hiệu quả diệt muỗi tinh dầu thô tách chiết từ cây hương thảo (Rosemary) thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước: Hiệu quả nhạy kháng của muỗi Aedes aegypti với tinh dầu hương thảo ở dạng dung dịch (phun xịt) tối ưu khi sử dụng cồn 80º với tỷ lệ tinh dầu/cồn là 1/40 (ml/ml). Kết quả cho thấy tiềm năng sử dụng tinh dầu hương thảo làm dung dịch diệt muỗi an toàn cho sức khỏe người sử dụng và thân thiện với môi trường. MỤC LỤC Đề mụcTrang Lời cảm ơni Tóm tắtii Mục lụciii Danh mục hìnhiv Danh mục bảng biểuv Danh mục từ viết tắtvi LỜI MỞ ĐẦU1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN3 1.1. Nguồn gốc cây hương thảo3 1.1.1. Đặc điểm cây hương thảo3 1.1.2. Thành phần hóa học3 1.1.3. Một số lợi ích của cây hương thảo5 1.2. Tổng quan về tinh dầu5 1.2.1. Khái quát về tinh dầu5 1.2.2. Quá trình tích lũy tinh dầu6 1.2.3. Tính chất lý, hoá của tinh dầu6 1.2.4. Một vài nét về tinh dầu Rosemary7 1.2.5. Tình hình nghiên cứu về tinh dầu Rosemary trên thế giới8 1.3. Các phương pháp trích ly tinh dầu10 1.3.1. Phương pháp tẩm trích10 1.3.2. Phương pháp chưng cất hơi nước13 1.4. Các phương pháp hỗ trợ trong việc trích ly tinh dầu15 1.4.1. Phương pháp vi sóng15 1.4.2. Phương pháp siêu âm17 1.5. Tổng quan về khả năng diệt muỗi của tinh dầu thực vật19 1.5.1. Một số loại thực vật có khả năng diệt muỗi19 1.5.2. Tổng quan về muỗi Aedes aegypti22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU25 2.1. Vật liệu25 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu25 2.1.2. Dụng cụ thiết bị - Hóa chất25 2.2. Phương pháp nghiên cứu26 2.2.1. Quy trình nghiên cứu26 2.2.2. Bố trí thí nghiệm28 2.2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN38 3.1. Xác định một số chỉ tiêu nguyên liệu38 3.1.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu38 3.1.2. Xác định các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu hương thảo38 3.1.3. Xác định thành phần hóa học tinh dầu bằng phương pháp GC-MS39 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly tinh dầu hương thảo bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước41 3.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong nước ngâm chiết tới hàm lượng tinh dầu thu được41 3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu được42 3.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu được44 3.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chưng cất tới hàm lượng tinh dầu thu được46 3.3. Đánh giá hiệu quả diệt muỗi của tinh dầu thô hương thảo48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ51 4.1. Kết luận51 4.2. Kiến nghị51 TÀI LIỆU THAM KHẢO53 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tinh dầu hương thảo (Rosemary) thương mại7 Hình 1.2. Giống muỗi Aedes aegypti22 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình trích ly tinh dầu26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm28 Hình 2.3. Sơ đồ xác định độ ẩm của nguyên liệu29 Hình 2.4. Sơ đồ xác định hàm lượng NaCl trong nước ngâm chiết30 Hình 2.5. Sơ đồ xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu31 Hình 2.6. Sơ đồ xác định thời gian ngâm nguyên liệu32 Hình 2.7. Sơ đồ xác định thời gian chưng cất33 Hình 2.8. Sơ đồ đánh giá hiệu của diệt muỗi của tinh dầu hương thảo34 Hình 3.1. Tinh dầu hương thảo thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước38 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl trong nước ngâm chiết tới hàm lượng tinh dầu thu được41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu được43 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu được45 Hình 3.5. Thể tích tinh dầu thu được theo thời gian chưng cất47 Hình 3.6. Tỷ lệ muỗi chết của dung dịch diệt muỗi với tỉ lệ 1/40 ở ba mức cồn 70º, 80º và 90º50   DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Bảng thành phần dinh dưỡng trên 100g lá hương thảo tươi4 Bảng 1.2. Tỷ lệ % thành phần hóa học trong tinh dầu hương thảo khi trích lý bằng chưng cất hơi nước và CO2 siêu tới hạn ở 50ºC/100bar so với chất khô9 Bảng 1.3. Hoạt tính diệt côn trùng, muỗi của tinh dầu một số loài bạch đàn21 Bảng 1.4. Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Aedes aegypti của chế phẩm từ nhân hạt cây neem trong lồng kính 70×70×70 cm23 Bảng 1.5. Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Aedes aegypti của chế phẩm từ nhân hạt cây neem trong lồng kính 180×180×180cm24 Bảng 1.6. Bảng khảo sát tỷ lệ muỗi chết ở mức nồng độ cồn, thời gian khác nhau24 Bảng 3.1. Thành phần chính trong tinh dầu hương thảo (phần trăm khối lượng)39 Bảng 3.2. Hiệu quả nhạy kháng của muỗi với tinh dầu hương thảo ở dạng dung dịch (phun xịt) cồn 70º, 80º và 90º48   DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DEETN,N – Diethyl – meta – toluamide CTChemotype TCVNTiêu chuẩn Việt Nam LT50Thời gian phơi nhiễm LC50Nồng độ hóa chất phơi nhiễm LỜI MỞ ĐẦU 1.ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam theo báo cáo của Bộ Y tế tháng 12 năm 2015, cả nước ghi nhận 81441 trường hợp mắc bệnh sốt suất huyết tại 58 tỉnh, thành phố, 52 trường hợp tử vong, Số mắc bệnh tăng 11.5% so với trung bình giai đoạn 2010 - 2014 nhưng tăng cao so với cùng kỳ năm 2014 (vì năm 2014 là năm có số mắc thấp nhất trong vòng 25 năm qua) [60]. Mặc khác hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm diệt muỗi được tạo từ các hợp chất hóa học (DEET) mang hương liệu, hóa chất tổng hợp, độc hại cho con người gây nên các bệnh mẫn cảm, dị ứng cho người sử dụng, nguy hiểm cho trẻ em, ảnh hưởng đến môi trường và có giá thành khá cao. Việc đánh giá hiệu quả và tạo ra những sản phẩm diệt muỗi có nguồn gốc thiên nhiên, sử dụng các nguồn nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên là hết sức cần thiết. Điều này cũng sẽ giải quyết được các vấn đề nan giải từ sản phẩm có nguồn gốc hóa học và bệnh sốt xuất huyết đang đe dọa tính mạng con người, đặc biệt là trẻ em [50]. Hương thảo (Rosemery) là một trong những loại cỏ rất tự nhiên, dễ trồng và khá nhiều tinh dầu. Từ xa xưa cha ông ta đã biết đến loại thực vật này và đã ứng dụng chúng rất nhiều trong cuộc sống, tiêu biểu là ứng dụng khả năng diệt muỗi của nó trong việc phòng ngừa muỗi đốt, sốt xuất huyết. Tuy nhiên, đó cũng chỉ là những kinh nghiệm của cha ông để lại và chưa có một nghiên cứu khoa học nào tại Việt Nam tìm hiểu về hiệu quả diệt muỗi của tinh dầu hương thảo. Dung dịch diệt muỗi hiện nay thường được bán trên thị trường chủ yếu được pha trộn với hương liệu để tạo mùi cho sản phẩm mà chưa có sản phẩm pha trộn với tinh dầu để diệt muỗi. Bên cạnh đó, giá thành của các loại sản phẩm này khá cao, chủ yếu được gia công tại Việt Nam hoặc nhập khẩu từ các nước khác như Nhật, Indonesia, Malaysia,… Với mục tiêu xa hơn là tạo ra các sản phẩm diệt muỗi dạng dung dịch từ tinh dầu hương thảo, cần xác định được chất hòa tan tạo nhũ hóa tinh dầu đó và tỉ lệ tinh dầu trong sản phẩm để tăng hiệu lực diệt muỗi lên cao nhất nhưng với chi phí thấp nhất. Vì những lý do trên, việc nghiên cứu, đánh giá khả năng diệt muỗi từ tinh dầu cây hương thảo (Rosemary) được thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước là hết sức cần thiết với mục tiêu xa hơn là tạo ra sản phẩm thân thiện môi trường và người sử dụng, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam với giá thành có tính cạnh tranh. 2.NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu cơ sở lí luận và thực tiễn của đề tài. - Xác định một số chỉ tiêu nguyên liệu. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu hương thảo bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. - Đánh giá hiệu quả diệt muỗi tinh dầu thô tách chiết từ cây hương thảo (Rosemary) thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. 3.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu lí thuyết: tìm hiểu, phân tích, tổng hợp tài liệu - Thực nghiệm hóa học: + Phương pháp trích ly tinh dầu: Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. + Phương pháp sinh hóa: Đánh giá hiệu quả diệt muỗi Aedes aegypti của tinh dầu thô Rosemary. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nguồn gốc cây hương thảo Tên khoa học Rosmarinus officinalis, là một loài thực vật có hoa trong họ Hoa môi. Loài này được Carl Linnaeus mô tả khoa học đầu tiên năm 1753 [35]. Ngành (divisio) Magnoliophyta Lớp (class) Magnoliopsida Bộ (ordo) Lamiales Họ (familia) Lamiaceae Tông (tribus)Mentheae Chi (genus)Rosmarinus L. Loài (species)Rosmarinus officinalis [40, 52] Hương thảo có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, Bồ Đào Nha và Tây Bắc Tây Ban Nha, được trồng nhiều ở Nam Âu châu, Tây Á và Bắc Phi trước đây [34]. Hương thảo mới được du nhập về Việt Nam thời gian ngắn nhưng đã nhận được sự quan tâm của nhiều người. Đặc biệt là những người yêu thiên nhiên, thích khám phá. Tại Việt Nam cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam, thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt. 1.1.1. Đặc điểm cây hương thảo Theo tài liệu Tuệ Tĩnh Toàn Tập (2010), hương thảo là loài cây nhỏ cao 1 - 2 m, phân nhánh, mọc thành bụi, lá nhiều, hẹp, hình dải, dai, có mép gập xuống, không cuống, màu xanh sẫm và nhẵn ở trên, phủ lông rải rác màu trắng ở mặt dưới [10]. Hoa xếp 2 - 10 ở các vòng lá, dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi có màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các thuỳ, toàn cây có mùi rất thơm [10]. 1.1.2. Thành phần hóa học Hương thảo là một loại thảo dược nên cây có chứa một số chất có lợi cho sức khỏe như tinh dầu (0.5% ở cây khô, 1.1 - 2% ở lá, 1.4% ở hoa) [35]. Tinh dầu hương thảo có các thành phần chính 1,8-cineole, α -pinene, camphene, α -terpineol và borneol [21, 43]. Ngoài ra cây chứa choline, một glucosid không tan trong nước, một saponosid acid, các acid hữu cơ (citric, glycolic), heterosid, acid rosmarinic [35]. Bảng 1.1. Bảng thành phần dinh dưỡng trên 100g lá hương thảo tươi [32] Thành phầnGiá trị dinh dưỡngĐơn vị Năng lượng131Kcal Carbohydrates20.70g Protein3.31g Tổng số chất béo5.86g Cholesterol0mg Chất xơ14.10g Folates109µg Niacin0.912mg Acid Pantothenic0.804mg Pyridoxine0.336mg Riboflavin0.152mg Thiamin0.036mg Vitamin A2924IU Vitamin C21.8mg Natri26mg Kali668mg Canxi317mg Đồng0.301mg Sắt6.65mg Magie91mg Mangan0.960mg Kẽm0.93mg 1.1.3. Một số lợi ích của cây hương thảo - Cây hương thảo trong ẩm thực: là một loại gia vị đặc trưng không thể thiếu trong thực phẩm [36]. Ngoài ra còn có chứa một số chất chống oxy hóa tự nhiên an toàn và hiệu quả cho bảo quản thực phẩm [59]. - Cây hương thảo trong y học: + Cây hương thảo giúp cải thiện trí nhớ, tốt cho não bộ [42]. + Cây hương thảo có tác dụng lợi tiểu [51]. + Cây hương thảo có tác dụng giảm đau, kháng viêm [38]. + Cây hương thảo chống ung thư [24]. + Cây hương thảo chống huyết khối [30]. + Cây hương thảo kháng độc tố [39]. + Cây hương thảo có chứa chất chống oxy hóa [46]. 1.2. Tổng quan về tinh dầu 1.2.1. Khái quát về tinh dầu [9] Tinh dầu là hỗn hợp của nhiều hợp chất thiên nhiên, có mùi đặc trưng gặp nhiều trong thực vật, có trong động vật, bay hơi ngoài không khí ở nhiệt độ thường, không để lại vết trên giấy, tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong dầu béo và các dung môi hữu cơ. Các hợp phần của tinh dầu hòa tan lẫn nhau, nếu một lượng tinh dầu nào đó là một khối đồng nhất (một pha) bắt đầu sôi ở một nhiệt độ nào đó phụ thuộc vào thành phần và tỷ lệ các hợp phần. Tinh dầu có thể sử dụng trực tiếp hoặc chế ra các chất thơm khác đáp ứng các nhu cầu xã hội (thuốc, chất thơm thực phẩm, nước hoa,...) Concrete oil: Sản phẩm chiết xuất hương thơm thu được từ thực vật khi dùng phương pháp chiết xuất với dung môi, sau khi bốc hơi dung môi phần còn lại được gọi là Concrete oil thường có chứa sáp và ở thể đặc. Pomade: Chất béo thơm được lấy từ các loại hoa bằng phương pháp chiết lạnh hay chiết nóng. Absolute oil: khi hoà tan concrete oil, pomade trong cồn có nồng độ cao, khi để lạnh phần sáp bị đông đặc, lọc loại bỏ phần này, phần còn lại đem chưng cất lôi cuốn hơi nước, sản phẩm thu được có tên absolute oil. Water absolute oil: một số trường hợp khi chưng cất lôi cuốn hơi nước một lượng đáng kể tinh dầu nằm trong nước ở dạng nhũ tương. Tinh dầu này được

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ DIỆT MUỖI CỦA TINH DẦU THÔ TÁCH CHIẾT TỪ ROSEMARY GVHD: Th.S PHẠM HỒNG HIẾU SVTH: NGUYỄN HẢI DƯƠNG 13030051 PHAN VĂN ĐẠI 13021581 PHAN THÀNH ĐẠT 13057121 LỚP: DHTP9A NIÊN KHÓA: 2013 – 2017 VIỆN CN SINH HỌC – THỰC PHẨM TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành cơng mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập giảng đường đại học đến nay, nhóm nghiên cứu nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cô, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, nhóm nghiên cứu xin gửi đến q thầy Viện Sinh học - Thực phẩm Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh với tri thức tâm huyết để truyền đạt kiến thức kinh nghiệm tảng, sở vững cho nhóm nghiên cứu thực tốt đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, nhóm nghiên cứu xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Hồng Hiếu cô Nguyễn Thị Minh Nguyệt tận tình hướng dẫn, gợi ý giúp đỡ nhóm nghiên cứu việc nghiên cứu hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn tập thể cán phòng thí nghiệm Viện Sinh học - Thực phẩm tạo điều kiện tốt trang thiết bị máy móc, dụng cụ suốt thời gian tiến hành thí nghiệm Đồ án tốt nghiệp này, nhóm nghiên cứu tìm hiểu tiến hành suốt sáu tháng Bước đầu vào thực tế, tìm hiểu lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, kiến thức hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, mong nhận ý kiến đóng góp q báu q thầy để kiến thức hồn thiện Sau cùng, xin kính chúc quý thầy cô thật dồi sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau i TÓM TẮT Hiện chế phẩm sử dụng để diệt muỗi thị trường đa số hóa chất nên ảnh hưởng đến mơi trường sức khỏe người sử dụng Tinh dầu hương thảo có khả diệt muỗi lại chưa ứng dụng rộng rãi Đề tài nghiên cứu tập trung vào hai nhiệm vụ chính: - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly tinh dầu hương thảo phương pháp chưng cất lôi nước với thông số tối ưu: Nồng độ NaCl nước ngâm chiết 4%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 3/1 (ml/g), thời gian ngâm nguyên liệu (nghĩa không thực công đoạn ngâm) trước chưng cất, thời gian chưng cất 80 phút - Đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu thô tách chiết từ hương thảo (Rosemary) thu phương pháp chưng cất lôi nước: Hiệu nhạy kháng muỗi Aedes aegypti với tinh dầu hương thảo dạng dung dịch (phun xịt) tối ưu sử dụng cồn 80º với tỷ lệ tinh dầu/cồn 1/40 (ml/ml) Kết cho thấy tiềm sử dụng tinh dầu hương thảo làm dung dịch diệt muỗi an toàn cho sức khỏe người sử dụng thân thiện với môi trường ii MỤC LỤC Đề mục Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh mục hình iv Danh mục bảng biểu v Danh mục từ viết tắt vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc hương thảo 1.1.1 Đặc điểm hương thảo .3 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Một số lợi ích hương thảo 1.2 Tổng quan tinh dầu 1.2.1 Khái quát tinh dầu 1.2.2 Q trình tích lũy tinh dầu 1.2.3 Tính chất lý, hố tinh dầu .6 1.2.4 Một vài nét tinh dầu Rosemary 1.2.5 Tình hình nghiên cứu tinh dầu Rosemary giới 1.3 Các phương pháp trích ly tinh dầu .10 1.3.1 Phương pháp tẩm trích 10 1.3.2 Phương pháp chưng cất nước .13 1.4 Các phương pháp hỗ trợ việc trích ly tinh dầu 15 1.4.1 Phương pháp vi sóng 15 1.4.2 Phương pháp siêu âm 17 1.5 Tổng quan khả diệt muỗi tinh dầu thực vật 19 1.5.1 Một số loại thực vật có khả diệt muỗi 19 1.5.2 Tổng quan muỗi Aedes aegypti 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 iii 2.1 Vật liệu .25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Dụng cụ thiết bị - Hóa chất 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Quy trình nghiên cứu 26 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 28 2.2.3 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Xác định số tiêu nguyên liệu 38 3.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu .38 3.1.2 Xác định tiêu hóa lý tinh dầu hương thảo 38 3.1.3 Xác định thành phần hóa học tinh dầu phương pháp GC-MS 39 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly tinh dầu hương thảo phương pháp chưng cất lôi nước 41 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl nước ngâm chiết tới hàm lượng tinh dầu thu 41 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu 42 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu 44 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất tới hàm lượng tinh dầu thu 46 3.3 Đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu thô hương thảo 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tinh dầu hương thảo (Rosemary) thương mại Hình 1.2 Giống muỗi Aedes aegypti 22 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình trích ly tinh dầu 26 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28 Hình 2.3 Sơ đồ xác định độ ẩm nguyên liệu 29 Hình 2.4 Sơ đồ xác định hàm lượng NaCl nước ngâm chiết 30 Hình 2.5 Sơ đồ xác định tỷ lệ dung mơi/ngun liệu 31 Hình 2.6 Sơ đồ xác định thời gian ngâm nguyên liệu 32 Hình 2.7 Sơ đồ xác định thời gian chưng cất .33 Hình 2.8 Sơ đồ đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu hương thảo .34 Hình 3.1 Tinh dầu hương thảo thu phương pháp chưng cất lôi nước .38 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl nước ngâm chiết tới hàm lượng tinh dầu thu 41 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu .43 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu .45 Hình 3.5 Thể tích tinh dầu thu theo thời gian chưng cất .47 Hình 3.6 Tỷ lệ muỗi chết dung dịch diệt muỗi với tỉ lệ 1/40 ba mức cồn 70º, 80º 90º .50 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Bảng thành phần dinh dưỡng 100g hương thảo tươi Bảng 1.2 Tỷ lệ % thành phần hóa học tinh dầu hương thảo trích lý chưng cất nước CO2 siêu tới hạn 50ºC/100bar so với chất khô Bảng 1.3 Hoạt tính diệt trùng, muỗi tinh dầu số loài bạch đàn .21 Bảng 1.4 Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Aedes aegypti chế phẩm từ nhân hạt neem lồng kính 70×70×70 cm .23 Bảng 1.5 Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Aedes aegypti chế phẩm từ nhân hạt neem lồng kính 180×180×180cm 24 Bảng 1.6 Bảng khảo sát tỷ lệ muỗi chết mức nồng độ cồn, thời gian khác .24 Bảng 3.1 Thành phần tinh dầu hương thảo (phần trăm khối lượng) 39 Bảng 3.2 Hiệu nhạy kháng muỗi với tinh dầu hương thảo dạng dung dịch (phun xịt) cồn 70º, 80º 90º 48 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DEET CT N,N – Diethyl – meta – toluamide Chemotype TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam LT50 Thời gian phơi nhiễm LC50 Nồng độ hóa chất phơi nhiễm vi LỜI MỞ ĐẦU LỜI MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam theo báo cáo Bộ Y tế tháng 12 năm 2015, nước ghi nhận 81441 trường hợp mắc bệnh sốt suất huyết 58 tỉnh, thành phố, 52 trường hợp tử vong, Số mắc bệnh tăng 11.5% so với trung bình giai đoạn 2010 - 2014 tăng cao so với kỳ năm 2014 (vì năm 2014 năm có số mắc thấp vòng 25 năm qua) [60] Mặc khác thị trường xuất nhiều sản phẩm diệt muỗi tạo từ hợp chất hóa học (DEET) mang hương liệu, hóa chất tổng hợp, độc hại cho người gây nên bệnh mẫn cảm, dị ứng cho người sử dụng, nguy hiểm cho trẻ em, ảnh hưởng đến môi trường có giá thành cao Việc đánh giá hiệu tạo sản phẩm diệt muỗi có nguồn gốc thiên nhiên, sử dụng nguồn nguyên liệu có sẵn tự nhiên cần thiết Điều giải vấn đề nan giải từ sản phẩm có nguồn gốc hóa học bệnh sốt xuất huyết đe dọa tính mạng người, đặc biệt trẻ em [50] Hương thảo (Rosemery) loại cỏ tự nhiên, dễ trồng nhiều tinh dầu Từ xa xưa cha ông ta biết đến loại thực vật ứng dụng chúng nhiều sống, tiêu biểu ứng dụng khả diệt muỗi việc phòng ngừa muỗi đốt, sốt xuất huyết Tuy nhiên, kinh nghiệm cha ông để lại chưa có nghiên cứu khoa học Việt Nam tìm hiểu hiệu diệt muỗi tinh dầu hương thảo Dung dịch diệt muỗi thường bán thị trường chủ yếu pha trộn với hương liệu để tạo mùi cho sản phẩm mà chưa có sản phẩm pha trộn với tinh dầu để diệt muỗi Bên cạnh đó, giá thành loại sản phẩm cao, chủ yếu gia công Việt Nam nhập từ nước khác Nhật, Indonesia, Malaysia,… Với mục tiêu xa tạo sản phẩm diệt muỗi dạng dung dịch từ tinh dầu hương thảo, cần xác định chất hòa tan tạo nhũ hóa tinh dầu tỉ lệ tinh dầu sản phẩm để tăng hiệu lực diệt muỗi lên cao với chi phí thấp Vì lý trên, việc nghiên cứu, đánh giá khả diệt muỗi từ tinh dầu hương thảo (Rosemary) thu phương pháp chưng cất lôi nước hết Trang LỜI MỞ ĐẦU sức cần thiết với mục tiêu xa tạo sản phẩm thân thiện môi trường người sử dụng, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Việt Nam với giá thành có tính cạnh tranh NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu sở lí luận thực tiễn đề tài - Xác định số tiêu nguyên liệu - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly tinh dầu hương thảo phương pháp chưng cất lôi nước - Đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu thô tách chiết từ hương thảo (Rosemary) thu phương pháp chưng cất lôi nước CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu lí thuyết: tìm hiểu, phân tích, tổng hợp tài liệu - Thực nghiệm hóa học: + Phương pháp trích ly tinh dầu: Phương pháp chưng cất lơi nước + Phương pháp sinh hóa: Đánh giá hiệu diệt muỗi Aedes aegypti tinh dầu thô Rosemary Trang PHỤ LỤC Phụ lục C: Kết nghiên cứu thí nghiệm  Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu Mẫu G: nguyên liệu tươi (g) KL cốc sấy đến không đổi (g) G1: cốc có chứa nguyên liệu (g) 10.2638 10.0116 10.3912 34.0422 34.4422 36.9054 44.3060 44.4538 47.2866 G2: Khối lượng nguyên liệu so với thời gian sấy (g) 4h 5h 6h 7h 8h 37.5110 36.7216 36.3613 36.3514 36.3501 37.8190 37.0265 36.6587 36.6463 36.6456 40.6367 39.7373 39.3184 39.2185 39.2173 2h 38.1969 38.5031 41.4443 9h 36.3500 36.6455 39.2173 - Độ ẩm ngun liệu tính theo cơng thức: %H2O = (G1−G2) G X 100% Lần Độ ẩm (%) 77.51 77.99 77.66 Độ ẩm trung bình (%) 77.72 ± 0.25  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl nước ngâm chiết tới hàm lượng tinh dầu thu %NaCl 0% 2% 4% 6% 8% KL tinh dầu (g) Lần Lần Lần 0.4356 0.4315 0.4215 0.4415 0.4472 0.4461 0.4838 0.4882 0.4822 0.4607 0.4590 0.4630 0.4088 0.4199 0.4200 Hàm lượng tinh dầu (%) Lần Lần Lần 1.955 1.937 1.892 1.982 2.007 2.002 2.171 2.191 2.164 2.068 2.060 2.079 1.835 1.885 1.885 C1 Hàm lượng tinh dầu trung bình (%) 1.928 ± 0.032 1.997 ± 0.013 2.175 ± 0.014 2.069 ± 0.010 1.868 ± 0.029 PHỤ LỤC So sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê hay khơng nồng độ NaCl: So sánh nồng độ NaCl Method: 95.0 percent LSD NaCl 0% NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6% NaCl 8% Count 3 3 Mean H.Groups a b c d e 1.928 1.997 2.175 2.069 1.868  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu Tỷ lệ Dm/nguyên liệu (ml/g) 2/1 3/1 4/1 5/1 6/1 7/1 8/1 KL tinh dầu (g) Hàm lượng tinh dầu (%) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Hàm lượng tinh dầu trung bình (%) 0.3023 0.5979 0.5469 0.5037 0.4837 0.4632 0.4502 0.3076 0.6074 0.5519 0.4989 0.4889 0.4601 0.4539 0.3042 0.6059 0.5432 0.5085 0.4840 0.4615 0.4551 1.357 2.684 2.455 2.261 2.171 2.079 2.021 1.381 2.726 2.477 2.239 2.194 2.065 2.037 1.365 2.719 2.438 2.282 2.172 2.071 2.043 1.368 ± 0.012 2.710 ± 0.023 2.457 ± 0.020 2.261 ± 0.022 2.179 ± 0.013 2.072 ± 0.007 2.034 ± 0.011 So sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê hay khơng tỷ lệ: So sánh tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Method: 95.0 percent LSD Count Mean H Groups 2/1 1.368 a 3/1 2.710 b 4/1 2.457 c 5/1 2.261 d 6/1 2.179 e 7/1 2.072 f 8/1 2.034 g C2 PHỤ LỤC  Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu tới hàm lượng tinh dầu thu Thời gian ngâm giờ giờ giờ KL tinh dầu (g) Lần Lần Lần 0.6255 0.5479 0.5773 0.5765 0.5240 0.5100 0.5658 0.5103 0.5059 0.5265 0.5038 0.5047 0.4817 0.4983 0.4759 0.5083 0.4747 0.4547 Hàm lượng tinh dầu (%) Lần Lần Lần 2.810 2.728 2.681 2.590 2.437 2.473 2.364 2.290 2.271 2.363 2.261 2.265 2.162 2.237 2.136 2.192 2.131 2.041 Hàm lượng tinh dầu trung bình (%) 2.740 ± 0.065 2.500 ± 0.080 2.308 ± 0.049 2.296 ± 0.058 2.178 ± 0.052 2.121 ± 0.076 So sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê hay không thời gian ngâm: giờ giờ giờ Method: 95.0 percent LSD Count Mean 2.740 2.500 2.308 2.296 2.178 2.121 Homogeneous Groups a b c c d d  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất tới hàm lượng tinh dầu thu Thời gian 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Lần 0.65 0.85 0.90 0.94 0.95 0.99 1.01 1.01 1.02 1.02 1.02 1.02 Lần 0.68 0.85 0.94 0.96 1.00 1.03 1.03 1.04 1.04 1.04 1.04 1.04 Thể tích tinh dầu (ml) Lần Lần 0.64 0.66 0.82 0.84 0.90 0.90 0.94 0.95 0.96 0.96 0.97 0.97 0.99 0.98 1.01 1.02 1.02 1.04 1.04 1.04 1.04 1.04 1.04 1.04 C3 Thể tích trung bình 0.66 ± 0.02 0.84 ± 0.01 0.91 ± 0.02 0.95 ± 0.01 0.97 ± 0.02 0.99 ± 0.03 1.00 ± 0.02 1.02 ± 0.01 1.03 ± 0.01 1.04 ± 0.01 1.04 ± 0.01 1.04 ± 0.01 PHỤ LỤC So sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê hay khơng mốc thời gian: Bảng so sánh cặp giá trị thời gian Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups tg_10p 0.6575 a tg_20p 0.84 b tg_30p 0.91 c tg_40p 0.9475 d tg_50p 0.9675 de tg_60p 0.99 ef tg_70p 1.0025 fg tg_80p 1.02 gh tg_90p 1.03 h tg_100p 1.035 h tg_110p 1.035 h tg_120p 1.035 h  Thí nghiệm 6: Đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu thô hương thảo Thời gian 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút Sau 24 Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 1) Nồng độ Cồn 70 Tỷ lệ tinh dầu/cồn Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 2) (Lần 3) 10 13 14 18 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 19 0 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 16 19 21 22 22 22 16 19 20 21 21 14 15 18 19 11 12 17 18 20 21 23 23 12 15 16 19 20 20 11 14 16 17 18 10 13 14 14 16 17 18 19 20 11 13 17 20 21 22 12 15 17 18 19 23 22 19 14 24 20 20 16 20 23 19 C4 Đối chứng PHỤ LỤC Thời gian 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút Sau 24 Thời gian 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút Sau 24 Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 1) Nồng độ Cồn 80 Tỷ lệ tinh dầu/cồn Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 2) (Lần 3) 17 18 21 22 23 24 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 24 0 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 20 22 25 25 25 25 19 22 23 25 25 25 19 21 24 24 24 25 18 20 20 21 21 21 23 25 25 25 25 25 21 23 25 25 25 25 20 21 25 25 25 25 17 19 20 21 22 22 23 24 25 25 25 25 22 23 24 24 25 25 18 21 22 23 25 25 25 25 25 21 25 25 25 22 25 25 25 Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 1) Đối chứng Nồng độ Cồn 90 Tỷ lệ tinh dầu/cồn Tỷ lệ tinh dầu/cồn (Lần 2) (Lần 3) 11 14 17 20 21 21 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 Lần 0 0 0 21 0 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 1/20 1/30 1/40 1/50 20 22 24 25 25 25 17 21 23 25 25 25 15 17 22 22 23 25 16 18 18 20 20 23 20 22 23 25 25 25 20 21 25 25 25 25 16 19 22 22 23 25 13 15 16 18 18 19 19 22 25 25 25 25 19 22 23 25 25 25 19 22 23 24 24 25 25 25 25 23 25 25 25 21 25 25 25 C5 Đối chứng PHỤ LỤC Phụ lục D: Xác định thành phần hóa học tinh dầu hương thảo phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) Tinh dầu hương thảo thu sau trích ly phương pháp chưng cất lơi nước phân tích thành phần hóa học máy sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) THERMO SCIENTIFIC Cột sử dụng phân tích cột có kí hiệu TG – SQC (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang heli, với điều kiện chạy phân tích sau: Điều kiện sắc ký Chương trình nhiệt độ sau: Ram 1: Nhiệt độ đầu 60°C, giữ phút Ram 2: Tăng lên 120°C với tốc độ 5°C /phút, giữ phút Ram 3: Tăng lên 135°C với tốc độ 3°C /phút, giữ phút Ram 4: Tăng lên 200°C với tốc độ 10°C /phút, giữ phút D1 PHỤ LỤC Điều kiện khối phổ Nguồn ion hóa EI: Nhiệt độ bắn phá ion: 200°C Nhiệt độ stranferline: 230°C Chế độ quét: Fullscan Khối quét: 40-400 amu Tiêm mẫu: Chế độ tiêm mẫu chia dòng Tỉ lệ chia dòng: 42 Thể tích mẫu tiêm: µl D2 PHỤ LỤC Thành phần tinh dầu xác định sau: - Xác định thời gian lưu chất GC giống với thời gian lưu chất biết trước - Đối chiếu phổ khối lượng thu với phổ gốc thư viện phổ NIST, từ định danh cấu tử tinh dầu hương thảo Alpha-Pinene Eucalyptol Bicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one, 4,6,6-trimethyl- D3 PHỤ LỤC 2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl Borneol Bornyl acetate 1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl D4 PHỤ LỤC Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one, 1,7,7-trimethyl- (1S)- Camphene 3-Cyclohexene-1-methanol beta-Pinene D5 PHỤ LỤC Caryophyllene Limonene beta-Myrcene D6 PHỤ LỤC Phụ lục E: Hình ảnh trình nghiên cứu Hình E1: Cây hương thảo tiến hành thí nghiệm Hình E2: Ngun liệu cắt nhỏ sau đưa vào bình cầu lit E1 PHỤ LỤC Hình E3: Chuẩn bị nguyên liệu trước tiến hành chưng cất Hình E4: Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger E2 PHỤ LỤC Hình E5: Tinh dầu sau chưng cất Hình E6: Tinh dầu bảo bọc paraphin giấy bạc sau bảo quản lạnh nhiệt độ 4ºC E3 PHỤ LỤC Hình E7: Lồng làm thí nghiệm đánh giá hiệu đuổi muỗi tinh dầu thô hương thảo E4 ... chưng cất 80 phút - Đánh giá hiệu diệt muỗi tinh dầu thô tách chiết từ hương thảo (Rosemary) thu phương pháp chưng cất lôi nước: Hiệu nhạy kháng muỗi Aedes aegypti với tinh dầu hương thảo dạng... tan tinh dầu để khảo sát khả diệt muỗi mẫu, kết cho thấy hiệu diệt muỗi tốt [3] Từ kết nghiên cứu diệt muỗi từ tinh dầu sả Trương Ngọc Bảo Trân cộng (2014) cho thấy hiệu lực diệt muỗi tinh dầu. .. tan tạo nhũ hóa tinh dầu tỉ lệ tinh dầu sản phẩm để tăng hiệu lực diệt muỗi lên cao với chi phí thấp Vì lý trên, việc nghiên cứu, đánh giá khả diệt muỗi từ tinh dầu hương thảo (Rosemary) thu phương