Trong nghiên cứu khoa học sự sống, việc tìm kiếm và so sánh trình tự gen hoặc protein giữa các sinh vật là vô cùng quan trọng, để tìm kiếm các gen protein tương tự như trình tự đã biết. Việc tìm kiếm này cho phép nhà khoa học suy đoán chức năng của gen mới, dự đoán các thành viên mới của một họ gen, tìm ra mối quan hệ tiến hóa, hay tìm ra sự phân bố và chức năng của các vùng phiên mã hoặc mã hóa cho protein trong hệ gen thông qua việc tìm kiếm sự tương đồng của các trình tự của các hệ gen đã được giải trình tự.BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là một công cụ tìm kiếm trình tự tương đồng phổ biến trong đó cung cấp các biến khác nhau cho các trình tự được đưa và đối với từng cơ sở dữ liệu khác nhau. Bài này sẽ tập trung vào tìm hiểu cách BLAST hoạt động và đưa ra kết quả.PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20. Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến. PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending). ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense). Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.
TIN SINH HỌC Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng (BLAST) Trong nghiên cứu khoa học sống, việc tìm kiếm so sánh trình tự gen protein sinh vật vô quan trọng, để tìm kiếm gen/ protein tương tự trình tự biết Việc tìm kiếm cho phép nhà khoa học suy đoán chức gen mới, dự đốn thành viên họ gen, tìm mối quan hệ tiến hóa, hay tìm phân bố chức vùng phiên mã mã hóa cho protein hệ gen thơng qua việc tìm kiếm tương đồng trình tự hệ gen giải trình tự BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng phổ biến cung cấp biến khác cho trình tự đưa sở liệu khác Bài tập trung vào tìm hiểu cách BLAST hoạt động đưa kết Phần lớn người dùng đưa vào BLAST trình tự nucleotide protein thơng qua textbox để phân tích dựa tất (hoặc phần) trình tự công bố Nếu người dùng sử dụng công cụ BLAST NCBI (National Center for Biotechnology Information), liệu chuyển đến xử lí máy chủ sở liệu NCBI sau thơng tin trả trình duyệt người sử dụng theo định dạng hiển thị lựa chọn Tuy nhiên, người dùng cài đặt phiên BLAST độc lập riêng để phân tích sở liệu cục tùy chỉnh BLAST để phù hợp với nhu cầu họ BLAST có sẵn nhiều dạng khác để so sánh trình tự khác ví dụ phân tích DNA với sở liệu DNA, phân tích protein với sở liệu protein Kết đưa mặc định hiển thị trang web BLAST file kết dạng XML ASN lựa chọn để tối ưu cho ứng dụng Giao diện công cụ BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Thuật toán BLAST phương pháp kinh nghiệm, dựa số lối tắt thơng minh để thực tìm kiếm nhanh BLAST giúp xếp cục bộ, ví dụ protein thường có dạng module với domain chức lặp lại protein tương tự khác loài khác mRNA so sánh trình tự với phần DNA hệ gene Do đó, BLAST cố gắng tìm kiếm trình tự có tương đồng domain motif Khi trình tự truy vấn đưa vào, BLAST tạo bảng gồm “từ” (trình tự ngắn) “từ lân cận” (từ tương đồng với trình tự truy vấn) để tìm kiếm Khi quét kết tương tự, sử dụng để bắt đầu tìm phần mở rộng chứa gap không chứa gap “từ” Các flatfile sở liệu chia thành hai file chứa thơng tin tiêu đề chứa trình tự Khi chạy chế độ độc lập, liệu gộp lại Khi thuật toán quét tất “từ” phần mở rộng tối đa, tập hợp tất xếp cặp tối ưu vào cấu trúc liệu SeqAlign chứa đường dẫn tới trình tự sở liệu BLAST Các kết hiển thị theo nhiều cách khác Kết đưa đưa nhiều dạng cấu trúc tùy theo mục đích người sử dụng phổ biến dạng truyền thống dạng bảng kết Ngoài ra, dạng thứ đưa cấu trúc đầu XML hay ASN.1 có tích hợp chức kiểm tra hồn thiện sai sót cú pháp q trình phân tích người dung thay đổi thêm chức năng, dạng cuối dạng mã BLAST sử dụng cho công cụ kiểm kê sử dụng cho mục đích đặc biệt người sử dụng Dạng truyền thống: đưa cách tổng quát kết tìm kiếm Đồ thị tổng quát Đưa cách khái quát mức độ bắt cặp vùng trình tự bạn Màu đỏ, xanh lục, cam: vùng mức độ bắt cặp tốt; màu xám: vùng mức độ bắt cặp trung bình; màu xanh dương: vùng mức độ bắt cặp Các kết tìm kiếm Bao gồm thơng tin rút gọn giá trị bắt cặp nằm dòng Bit score: điểm bắt cặp sau normalize để so sánh kết lần phân tích phép phân tích khác nhau, điểm bắt cặp định ma trận khác khác E-value: giá trị mong đợi, E-value nhỏ kết có ý nghĩa thống kê Kết xếp bắt cặp trình tự: kết chi tiết trình tự tương đồng Dạng bảng Đối với nghiên cứu cần chạy BLAST cho mục đích đặc biệt cần tập hợp thông tin báo cáo dạng truyền thống Các báo cáo định dạng bảng kết khơng chứa trình tự mà đưa thông tin cần thiết theo cấu trúc rõ ràng điểm bắt đầu, kết thúc, phần trăm xác định, bit score E-value Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 1) PCR phát minh quan trọng kỉ 20 Phản ứng nhằm chép tạo lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, phát mầm bệnh lây nhiễm HIV, viêm gan phát thay đổi mặt di truyền đột biến PCR thực thơng qua bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), kéo dài chuỗi (extending) ADN sử dụng làm khn có cấu trúc xoắn kép, bị biến tính nhiệt tách thành mạch đơn, mạch mang nghĩa (sense) mạch đối nghĩa (antisense) Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, mồi gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa mồi khác gắn vào mạch đối nghĩa Trong đó, mồi trình tự oligonucleotide ngắn bám đặc hiệu vào vùng trình tự định Mồi điểm khởi đầu để polymerase thực hiển tổng hợp mạch bổ sung xác định đoạn ADN khuếch đại Do đó, việc thiết kế mồi định mức độ đặc hiệu suất phản ứng Nguyên tắc thiết kế mồi Độ dài mồi: Nên nằm khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu khoảng từ 18-22 base Điều phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu đủ ngắn để gắn dễ dàng vào khuôn nhiệt độ gắn mồi Đầu 3’ 5’ mồi: Cần thiết kế cho đầu 3’ mồi xi mở rộng phía mồi ngược đầu 3’ mồi ngược mở rộng phía mồi xi gắn vào mạch bổ sung Nếu ngược lại sản phẩm PCR khơng thể tạo Nguồn Ảnh: Antisense Science Nhiệt độ nóng chảy mồi Tm: Điểm nhiệt độ định nghĩa điểm nhiệt mà 50% sợi đôi ADN phân tách tạo sợi đơn Điểm nhiệt quan trọng pha gắn mồi, Tm nên nằm khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng mồi 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn khơng xác Nhiệt độ Tm hai mồi không chênh lệch oC, nhiệt độ chênh lệch q 5oC khơng thể tạo sản phẩm Cơng thức tính Tm sau: • Cơng thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) • Cơng thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n Trong đó: [Na+] nồng độ phân tử muối, n số base mồi Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy mồi Nhiệt độ gắn mồi thấp dẫn đến lượng sản phẩm PCR tạo thấp, không đủ số lượng phức hợp lai mồi khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu tạo nhiều nhiệt độ gắn mồi thấp Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau: Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9 Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, mật độ GC nên nằm khoảng 50 – 60% Kẹp GC: Nên có G C đầu 3’ mồi để giúp cho đầu 3’ mồi liên kết mạnh Tuy nhiên nên tránh việc base đầu 3’ có nhiều G C gây liên kết đầu 3’ mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu Lưu ý cấu trúc bậc thiết kế mồi a) Hình thành tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay gắn vào khn gắn vào mồi ngược với với nó, tạo sản phẩm PCR có kích thước nhỏ làm giảm lượng mồi bắt cặp với khn Do cần tránh tạo tượng kết cặp Hình thành dimer hai mồi Nguồn ảnh: PREMIER Biosoft b) Cấu trúc kẹp tóc: hình thành tương tác bên đoạn mồi Cần tránh điều làm giảm hiệu phản ứng PCR Lặp: tượng lặp lại nhiều lần trình tự mồi trình tự đơi (VD: ATATATATAT) đơn (VD: GGGGG) Điều gây bắt cặp nhầm số lần lặp tối đa mồi lần lặp cho hai trường hợp Tương đồng chéo: Là tượng mà cặp mồi khuếch đại gene khác có hỗn hợp ban đầu Để tránh tượng này, mồi sau thiết kế cần đưa lên BLAST để so sánh kiểm tra độ đặc hiệu Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 2) Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer – Blast Primer-BLAST công cụ phát triển NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR cụ thể PrimerBLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để thiết kế mồi, sau dùng cơng cụ BLAST thuật tốn định tuyến tổng quát (global alignment) để kiểm tra sở liệu NCBI nhằm tránh sai sót kết cặp, tương đồng chéo nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR khơng hiệu Q trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn theo bước: • Thu thập khn mẫu • Thiết kế đoạn mồi 1.1 Thu thập khuôn mẫu Một ưu điểm lớn sử dụng Primer-BLAST người dùng tận dụng tối đa nguồn sở liệu từ NCBI Ví dụ sau chúng tơi hướng dẫn thiết kế mồi cho đoạn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein virus viêm gan siêu vi B Bước 1: Truy cập sở liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) chọn “Nucleotide database” tìm kiếm sử dụng từ khóa “Hepatitis B virus genome” Bước 2: Kết trả hàng loạt liệu gen khác virus viêm gan siêu vi B Chúng ta chọn kết Ở phần kết số này, có định dạng là: GenBank, FASTA Graphics Để thu chuỗi khuôn mẫu chọn FASTA Graphics chúng tơi có lời khun nên sử dụng Graphics NCBI hiệu nhiều Vì mục chọn Graphics để đánh giá trực quan tồn bộ gen virus (xem hình 1) Bước 3: Bộ gen virus biểu diễn dạng hình ảnh trực quan (Hình 2) Tồn gen thích click vào gen thông tin chi tiết gen Trong ví dụ này, chọn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein Bước 4: Bảng nhỏ lên sau chọn gen có chứa dòng “FASTA View” Click vào vào mục bắt đầu ký hiệu NC_ chuỗi gene dạng file FASTA (hình) Vậy bước đầu thu thập khn mẫu hồn thành sở liệu NCBI Lưu ý: Như phần Graphics cung cấp cho đoạn gen theo chiều ngược lại (Gen mang màu đen) Vì trước thực thiết kế mồi, cần phải đảo ngược đoạn khuôn mẫu lại cho chiều 5’-3’ 1.2 Thiết kế đoạn mồi Bước 1: Truy cập trang chủ phần mềm Primer-BLAST địa chỉ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Giao diện Primer-BLAST hình (1) Khung nhập liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dạng file FASTA (2) Thông số nhiệt độ nóng chảy (Tm )của đoạn mồi : điều chỉnh giống với thông số nguyên tắc thiết kế mồi phần loạt viết thiết kế mồi cho phản ứng PCR Ngồi nhiều thông số nâng cao khác mặt Vì hầu hết thông số dạng mặc định Bước 2: Đánh giấu bỏ dòng “Enable search for primer pairs specific to the intended PCR template” để bỏ qua việc tìm kiếm cặp mồi có sẵn sở liệu NCBI Sau thu thiết kế primer cách ấn vào ô “Get Primers” Cuối cùng, kết đoạn mồi thu dạng: hình ảnh trực quan thơng tin chi tiết kết 2 Đánh giá phần mềm phổ biến • Phần mềm FastPCR cơng cụ tích hợp hàng loạt tính tồn diện chuyên nghiệp dùng để thiết kế loại mồi cho PCR Mặc dù vậy, điểm yếu phần mềm phức tạp sử dụng • Primer-BLAST phần mềm online cung cấp The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Phần mềm tạo nên nhờ kết hợp Primer3 BLAST Nổi trội nhờ khả sử dụng sở liệu lớn NCBI BLAST công cụ online, Primer-BLAST không tránh khỏi hạn chế • Primer3 phần mềm mã nguồn mở tiếng BatchPrimer3 phát triển sau Đặc điểm bật BatchPrimer việc chạy web online khả chạy thông lượng lớn đầu vào giúp BatchPrimer3 công cụ phổ biến thiết kế mồi cho PCR nhằm thay cho người anh Primer3 IDT SciTools: NCBI/PrimerjPCR Đặc điểm BatchPrimer3 PrimerQuest, (Primer3) OligoAnalyzer BLAST Tool &FastPCR PerlPrimer (Primer3) 3.1 Độ dài Primer (nt) 12-500 15-30 Chưa rõ 16-35 Không giới hạn 50,000 Chưa rõ Không giới hạn Giới hạn độ dài khuôn mẫu (nt) 12-30 Không giới hạn IDT SciTools: NCBI/PrimerjPCR Đặc điểm BatchPrimer3 PrimerQuest, (Primer3) OligoAnalyzer BLAST Tool &FastPCR PerlPrimer (Primer3) 3.1 Tốc độ tính tốn nhanh chậm chậm chậm chậm có khơng có khơng khơng có có có có có có khơng có có khơng Cho phép chạy thông lượng lớn với hàng loạt khuôn mẫu hàng loạt mục tiêu khuôn lúc Tùy chọn PCR cho khuôn mẫu Degenerated nucleotides at all operation (Tm calculation, searches and probe, primer design etc.) IDT SciTools: NCBI/PrimerjPCR Đặc điểm BatchPrimer3 PrimerQuest, (Primer3) OligoAnalyzer BLAST Tool &FastPCR PerlPrimer (Primer3) 3.1 Cho phép sửa đổi LNA (Nucleotide khóa) có khơng khơng có khơng có khơng khơng khơng khơng có Lỗi có có có có Lỗi khơng Lỗi có khơng có khơng khơng có có có khơng khơng khơng nucleotide khác Tính tốn nhằm tối ưu hóa nhiệt độ anneal sử dụng Kiểm tra đầu 3’ kết thúc mồi giao tự tạo dimer Kiểm tra mồi nội giao tự tạo dimer Tìm kiếm khuôn mẫu sử dụng BLAST Kiếm tra khuôn mẫu IDT SciTools: NCBI/PrimerjPCR Đặc điểm BatchPrimer3 PrimerQuest, (Primer3) OligoAnalyzer BLAST Tool &FastPCR PerlPrimer (Primer3) 3.1 Kiểm tra khuôn mẫu dựa có có khơng khơng có thư viện sẵn có Bảng 1: So sánh công cụ thiết kế Primer phân tích oligonucleotide phổ biến (http://primerdigital.com/tools/soft.html) Ghi chú: Bảng so sánh mang tính chất tương đối cơng ty cung cấp phần mềm jPCR Tool &FastPCR thống kê, khả đặc điểm mang tính chất có lợi so với cơng cụ khác Mặc dù vậy, tài liệu đáng để tham khảo ... hiệu Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 2) Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer – Blast Primer-BLAST công cụ phát triển NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR cụ... gắn đặc hiệu đủ ngắn để gắn dễ dàng vào khn nhiệt độ gắn mồi Đầu 3’ 5’ mồi: Cần thiết kế cho đầu 3’ mồi xi mở rộng phía mồi ngược đầu 3’ mồi ngược mở rộng phía mồi xuôi gắn vào mạch bổ sung Nếu... đến phản ứng PCR khơng hiệu Q trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn theo bước: • Thu thập khuôn mẫu • Thiết kế đoạn mồi 1.1 Thu thập khuôn mẫu Một ưu điểm lớn sử dụng Primer-BLAST