Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây mần tưới (eupatorium fortunei turcz ) lên sinh trưởng của vi khuẩn lam độc microcystis aeruginosa kutzing trong các thủy vực nước ngọt tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ********************** PHẠM THANH NGA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT Chuyên ngành: Kỹ thuật mơi trường Mã số: 9.52.03.20 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội - 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI Học viện khoa học cơng nghệ Hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn GS.TS Đặng Đình Kim Hướng dẫn TS Lê Thị Phương Quỳnh Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở Viện Công nghệ Mơi trường vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ô nhiễm nguồn nước mặt đặc biệt nghiêm trọng nhiều nơi giới người dân khơng có nước để sử dụng cho ăn uống sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong bệnh tật gia tăng sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu Nhiều nguyên nhân khác dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt xả trực tiếp nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý lạm dụng mức phân bón hóa học thuốc bảo vệ thực vật sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng gia tăng dân số giới thập kỉ gần Hậu dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu nitơ photpho) thủy vực gây nên tượng phú dưỡng mà kéo theo “tảo nở hoa” “nở hoa nước” Sự nở hoa nước chất phát triển ạt Vi khuẩn lam (VKL) vi tảo, có khả sản sinh độc tố thủy vực, kéo theo nhiễm độc chết thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã người Sự nở hoa nước thường gây tác động xấu lên môi trường làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt độc tố microcystin VKL tiết Kết điều tra thủy vực nước cho thấy loài VKL độc gây tượng nở hoa nước Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) gây dị ứng da Điều nghiêm trọng tần suất xuất loài VKL độc ngày tăng liên quan đến sức khỏe người động vật nuôi, động vật hoang dã sử dụng nguồn nước có VKL độc Do ngăn ngừa giảm thiểu phát triển bùng nổ VKL độc vấn đề quan trọng cần phải quan tâm Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây VKL độc nghiên cứu áp dụng từ phương pháp học đơn giản hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến phương pháp lý - hóa dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, sử dụng hợp chất hóa học diệt tảo, hợp chất có tính oxi hóa cao, kim loại nano kim loại Những phương pháp bên cạnh ưu điểm dễ thấy hiệu tác động nhanh, rõ rệt thời gian ngắn tồn hạn chế tốn kinh phí triển khai gây ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động khơng chọn lọc lên lồi sinh vật gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau thời gian quan sát thấy tượng nhờn thuốc chúng bị hạn chế triển khai quy mô thực tế Do phương pháp sinh học, đặc biệt dùng cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tính hiệu thân thiện với môi trường Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz, thuộc họ Cúc (Asteraceae) loài cỏ lâu năm, sử dụng dân gian loại thuốc chữa bệnh chứng minh hoạt tính kháng khuẩn nhiều nghiên cứu khác Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt cộng tiến hành khảo sát so sánh hoạt tính diệt VKL độc M aeruginosa nhiều loại cao chiết từ loài thực vật khác Việt Nam cho thấy cao chiết Mần tưới có hiệu để kiểm sốt bùng nổ Vi khuẩn lam độc Kết luận khẳng định công bố Phạm Thanh Nga năm Tuy nhiên nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc cao chiết Mần tưới Từ lý đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế cao chiết Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kützing thủy vực nước ngọt” lựa chọn để thực Luận án có tính chất kế thừa kết nghiên cứu trước, nhiên giải nhiều vấn đề tồn Mục tiêu luận n Tạo cao chiết thực vật ức chế hiệu sinh trưởng Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Nhiệm vụ luận n - Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, chất phân lập từ Mần tưới Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng M aeruginosa đánh giá an toàn sinh thái - Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế cao chiết phân đoạn etyl axetat cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng M aeruginosa đánh giá an toàn sinh thái - Nghiên cứu phân lập đánh giá hoạt tính sinh học 07 hợp chất hóa học phân lập từ Mần tưới - Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam mẫu nước hồ tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án - Ơ nhiễm mơi trường nước, đặc biệt tượng phú dưỡng kéo theo bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin nhận nhiều quan tâm, nghiên cứu thời gian gần Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống áp dụng trước Kết luận án cung cấp sở khoa học, chứng minh tính khả thi áp dụng cao chiết thực vật hoạt chất ức chế diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc Đóng góp luận án - Phân lập 02 chất (7,8,9 - trihydroxythymol 8,10-didehydro-7,9-trihydroxythymol) đánh giá tác động 02 chất lên M aeruginosa dải nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50 µg/mL với hiệu ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 - Bước đầu ghi nhận khả ức chế sinh trưởng M aeruginosa ≥ 90% nồng độ 500 µg/mL quy mơ phịng thí nghiệm hiệu 60 % quy mơ ngồi trời với mẫu nước hồ tự nhiên Độc tính cao chiết tổng etanol Mần tưới Daphnia magna Lemna minor ghi nhận thấp so với M aeruginosa Bố cục luận án Ngoài phần đầu kết luận, luận án gồm chương, danh mục tài liệu tham khảo phần phụ lục Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu Trình bày tượng phú dưỡng bùng phát sinh khối vi khuẩn lam độc thủy vực nước Các phương pháp dược áp dụng để kiểm soát “tảo nở hoa” Chương Vật liệu Phương pháp nghiên cứu Trình bày đối tượng nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu mô tả thực nghiệm Chương Kết thảo luận CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Công thức cấu tạo chất phân lập từ Mần tưới Eupatorium fortunei Tại Việt Nam, Mần tưới nhiều loài thực vật khác khảo sát ảnh hưởng ức chế lên sinh trưởng M aeruginosa C vulgaris [2, 3] Kết thực nghiệm cho thấy ưu điểm bật cao chiết tổng Mần tưới so với loài thực vật khác khả ức chế chọn lọc lên VKL độc M aeruginosa tảo lục C vulgaris Hiệu suất tổng hơp cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng nước Mần tưới tương ứng trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Hiệu suất tạo cao chiết tổng dung môi khác Dung Môi Hiệu suất tạo cao chiết tổng từ Mần tưới (g cao chiết/100g mẫu thực vật khô) Etanol 9,17 Metanol 12,75 W (Nước) 7,75 Bảng 3.2 Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng etanol Mần tưới Cao chiết phân đoạn Hiệu suât (%) từ cao chiết tổng etanol Mần tưới Cao chiết phân đoạn n-hexan 18,97 Cao chiết phân đoạn etyl axetate 16,10 Cao chiết phân đoạn nước (W) 60,27 Hình 3.1 Quy trình phân lập hợp chất từ từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới Bảng 3.3 Hiệu suất phân lập chất từ Mần tưới STT Tỉ lệ mg chất sạch/100 g cao chiết Hợp chất phân đoạn etyl axetat Mần tưới EfD5.1 71,69 EfD14.1 20,80 EfD1.8 13,34 EfD10.1 4,56 EfD10.3 3,91 EfD4.7 2,61 EfD4.8 1,56 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR hai chất EfD4.7 EfD4.8: STT EfD4.7 δH (m, J in Hz) EfD4.8 δC δH (m, J in Hz) δC 140.1 - 143.6 6.79 (1H, d, 2.0) 116.3 6.82 (1H, d, 2.0) 115.1 - 156.8 - 155.8 - 133.5 - 127.8 7.20 (1H, d, 7.5) 129.5 7.12 (1H, d, 7.5) 131.1 6.81 (1H, dd, 7.5, 2.0) 120.5 6.80 (1H, dd, 7.5, 2.0) 119.0 4.52 (2H, s) 64.9 4.55 (2H, s) 64.8 - 76.9 - 149.3 3.76 (1H, d, 11.0) 3.65 (1H, d, 11.0) 72.4 4.39 (2H, s) 65.8 10 1.58 (3H, s) 26.1 5.41 (1H, d, 2.0), 5.20 (1H, d, 2.0) 114.8 chất Chất rắn màu trắng; []D24 = +0,2 (c 0.1, MeOH) HR-ESI-MS (positive): m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết 221,0790 cho Hình 3.2 Hợp chất 7,8,9trihydroxythymol (EfD4.7) công thức C10H14NaO4) Trên phổ H NMR hợp chất EfD4.7 xuất tín hiệu đặc trưng vòng thơm dạng ABX [δH 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,20 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), and 6,81 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, H-6)], nhóm methyl bậc δH 1,58 (3H, s, H-10) Ngồi cịn có tín hiệu proton vùng trường trung bình δ H 4,57; 3,74 3,65 13 Phân tích liệu phổ C NMR kết hợp với phổ HSQC nhận thấy có xuất tín hiệu cộng hưởng 10 cacbon, bao gồm nhóm methyl (δC 26,1, C-10), nhóm oxymethylene δC 64,9 (C-7) 72,4 (C-9), cacbon bậc liên kết với oxy (δC 76,9, C-8) vòng thơm ABX [δC 140,1 (C-1); 116,3 (C-2); 156,8 (C-3); 133,5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,7 (C-6)] Các liệu gợi ý hợp chất EfD4.7 có dạng khung thymol phổ biến chi Eupatorium Thực tế số liệu 1H 13C-NMR EfD4.7 tương đồng với số liệu công bố hợp chất 8,9-dihydroxythymol, ngoại trừ xuất nhóm hydroxymethyl thay nhóm methyl C-7 Phân tích phổ hai chiều HMBC tương tác từ H-7 (δH 4,52) đến C-1, C-2 C-6, từ H-9 (δH 3,76 3,65) đến C-4, C-8 C-10, từ H-10 (δH 1,58) đến C-4, C-8 C-9 Như kết luận hợp chất EfD4.7 7,8,9-trihydroxythymol, hợp chất lần công bố Chất rắn màu trắng HR-ESI-MS (positive): m/z181.0864 [M + H] + (tính tốn lý thuyết phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS 181,0865 cho công thức C10H13 O2).1 H NMR (500 MHz, CD 3OD) 13 C NMR (125 MHz, CD3 OD) [Bảng 3.4] Hợp chất EfD 4.8 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ H 13 C-NMR EfD4.8 Hình 3.3 Hợp chất 8,10- tương đồng với phổ EfD4.7 ngoại trừ xuất didehydro-7,9- nhóm methylene ngoại vịng (δ C/δH 114,8/5,41 and dihydroxythymol(EfD4.8) 5,20) thay nhóm methyl C-10 chất EfD4.7 Điều khẳng định dựa vào số liệu phổ khối lượng phân giải cao Công thức phân tử C10H13 O2 EfD4.8 xác định dựa pic ion phân tử m/z Các tương tác HMBC khẳng định cấu trúc hợp chất EfD4.8 Hình 3.4 HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.6 HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.5 HMBC of EfD4.7 Hình 3.7 HMBC of EfD4.7 Cấu trúc 07 hợp chất phân lập từ mẫu Mần tưới Hợp chất 7,8,92 Hợp chất 8,10-didehydrotrihydroxythymol (EfD4.7) 7,9-dihydroxythymol (EfD4.8) 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1): 4-(2hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1): o-Caumaric acid (EfD1.8) Kaempferol (EfD10.3): 10-Acetoxy-8,9dihydroxythymol (EfD14.1) 0.50 Control - M.a E- Eth-200 E- Me-200 E-W-200 CuSO4-1 0.40 0.30 A Mật độ quang, (λ= 680 nm) Mật độ quang, (λ= 680 nm) 3.2 Kết đánh giá khả ức chế sinh trưởng diệt VKL độc, vi tảo cao chiết chất phân lập 3.2.1 Đánh giá khả ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 cao chiết tổng Mần tưới 0.20 0.10 0.00 0.50 B Control- M.a E- Eth-500 E- Me-500 E-W-500 CuSO4-5 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 T0 T3 T6 Thời gian (ngày) T10 T0 T3 Thời gian (ngày) T6 T10 Hình 3.8 Ảnh hưởng cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng M aeruginosa tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm) Sự ức chế sinh trưởng chủng M.aeruginosa quan sát rõ ảnh hưởng cao chiết etanol Mần tưới nồng độ 500 µg/mL với hiệu suất chế (IE) tính theo mật độ quang 91,50 % cao so với cao chiết methanol (IE 78,50) cao chiết nước (IE 61,72 %) (p