Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT ĐỒ ÁN v MỤC LỤC vi DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ xi MỞ ĐẦU 12 1. Lí do chọn đề tài 12 2. Nhiệm vụ nghiên cứu 13 3. Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu 13 4.Ý nghĩa khoa học của đề tài 14 PHẦN I 15 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1. Giới thiệu về cellulose 15 1.2. Giới thiệu về enzyme cellulase 17 1.2.1. Cấu trúc của cellulase 17 1.2.2. Nguồn gốc của enzyme cellulase 18 1.2.3. Cơ chất của enzyme cellulase 19 1.2.4. Phân loại enzyme cellulase 19 1.2.5. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 19 1.2.6. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose) 22 1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase 23 1.2.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 23 1.2.7.2. Ảnh hưởng của pH 23 1.2.7.3. Ảnh hưởng của ion kim loại 24 1.2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 24 1.2.7..5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất S 24 1.3. Tổng quan về mối 27 1.3.1. Tìm hiểu về loài mối 27 1.3.2. Loại hình không sinh sản: 29 1.3.3. Thời kỳ bay giao hoan phân đàn: 29 1.3.4. Tổ mối 30 1.3.5. Thức ăn của mối 30 1.3.6. VSV sinh tổng hợp cellulase trong ruột mối 31 1.4. Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase 32 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 33 1.5. Ứng dụng của nhóm cellulase 34 1.5.1. Sơ lược về ứng dụng của cellulase 34 1.5.2. Các ứng dụng của nhóm enzyme cellulase 35 1.5.3.Trong công nghiệp giấy 35 1.5.4. Trong công nghiệp dệt 36 1.5.5. Trong xử lý môi trường 37 1.5.6. Trong sản xuất thức ăn gia súc 37 1.5.7. Trong kỹ thuật di truyền 38 1.5.8. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 38 1.5.9. Trong sản xuất cồn 40 1.5.10. Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa 41 1.5.11. Trong sản xuất nhiên liệu sinh học 41 1.5.12. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 42 1.5.13. Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen 42 1.5.14. Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 42 1.5.15. Trong sản xuất agaragar 42 PHẦN II 44 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Vật liệu 44 2.2. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 44 2.2.1. Môi trường hoạt hóa D2 44 2.2.2. Môi trường giữ giống D5 44 2.2.3 Môi trường thử hoạt tính M2 45 2.2.4. Môi trường sinh tổng hợp D8 45 2.2.5 Môi trường BHM 46 2.3 Hóa chất và dụng cụ 46 2.3.1. Hóa chất 46 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 47 2.4. Phương pháp nghiên cứu 48 2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 49 2.4.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 49 2.4.3 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 49 2.4.4 Làm sạch 50 2.4.5 Xác định hoạt tính của enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ và thử lugol trên môi trường M2 51 2.4.6 . Xác định lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase bằng phương pháp đo độ đục 52 2.4.7 Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa thích hợp 53 2.4.8. Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 53 2.4.9. Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 trong môi trường D8 theo thời gian. 54 2.4.10. Nghiên cứu các yếu tối ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 55 2.4.10.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 55 2.4.10.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ 56 2.4.10.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 56 2.4.10.4 Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp 57 PHẦN III 58 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1. Tuyển chọn vi khuẩn sinh cellulase trên tập hợp chủng F 58 3.1.1. Tuyển chọn chủng 58 3.1.2 Nghiên cứu tuyển chọn các chủng có hoạt tính mạnh 59 3.2. Nghiên cứu làm sạch và đặc điểm chủa chủng F2.2 62 3.3. Nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp cho enzyme cellulase 63 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa enzyme cellulase 63 3.3.2. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng F 2.2 trên các môi trường nuôi cấy 64 3.4. Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp cellulase của chủng F2.2 trên môi trường D8 65 3.4.1. Xây dựng đường chuẩn giữa độ đục và mật độ tế bào theo thời gian 65 Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn chủng F2.2 65 3.4.2. Nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn sinh cellulase theo thời gian 66 3.4.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 67 3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng F 2.2 67 3.4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phát triển của chủng F2.2 69 3.4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới sự phát triển của chủng F2.2 70 3.4.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon và Nito đến sự phát triển của chủng F2.2 71 Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon lên hoạt tính của cellulase chủng F2.2 72 PHẦN IV 76 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập- Tự do- Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Lớp : MSSV : Ngành : Nguyễn Thị Ân 51K2- Hóa Thực Phẩm 1052043910 Công nghệ thực phẩm Tên đề tài : Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển vi khuẩn sinh enzyme cellulase ruột mối Nội dung nghiên cứu đồ án tốt nghiệp: - Nghiên cứu lựa chọn chủng F có hoạt độ enzyme cellulase - Nghiên cứu lựa chủng F2.2 ruột mối có hoạt tính cao - Nghiên cứu lựa chọn mơi trường hoạt hóa ni cấy phù hợp cho chủng F2.2 - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp celluase chủng F2.2 ruột mối: • Nghiên cứu thời gian tốt cho trình phát triển sinh tổng hợp cellulase chủng F2.2 • Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến phát triển chủng F2.2 • Nghiên cứu ảnh hưởng thay đổi nhiệt độ đến phát triển chủng F 2.2 • Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất đến phát triển chủng F 2.2 • Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng hữu khác đến phát triển chủng F2.2 Giáo viên hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2014 Ngày hoàn thành đồ án tháng năm 2014 : Ngày Ngày tháng năm 2015 Giáo viên hướng dẫn ( Ký, ghi rõ họ tên) Chủ nhiệm môn (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2015 Người duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập- Tự do- Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân Khóa : 51K- Hóa thực phẩm MSSV : 1052043910 Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt : Nội dung nghiên cứu thiết kế: Nhận xét cán hướng dẫn: Ngày ii tháng năm 2015 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập- Tự do- Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân Khóa : 51K- Hóa thực phẩm MSSV : 1052043910 Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt : 1.Nội dung nghiên cứu thiết kế: 2.Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng 01 năm 2015 iii Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đào Thị Thanh Xuân,giảng viên khoa Hóa học, trường Đại học Vinh tận tình, tâm huyết hướng dẫn em suốt trình nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy giáo, giáo, tồn cán kỹ thuật viên phòng thí nghiệm khoa Hóa học tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất bạn nhóm đồ án, bạn sinh viên khóa 51K Cơng nghệ thực phẩm nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân tồn thể bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành đồ án tốt nghiệp Vinh, ngày tháng 01 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Ân iv TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển sinh tổng hợp enzyme cellulase vi khuẩn ruột mối Nội dung nghiên cứu: - Tuyển chọn chủng vi khuẩn ruột mối có hoạt tính cao để tiến hành nghiên cứu - Nghiên cứu lựa chọn mơi trường hoạt hóa thích hợp - Nghiên cứu lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp - Nghiên cứu thời gian nuôi cấy chủng cho hoạt tính cao - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển, sinh tổng hợp cellulase chủng F2.2 Kết thu được: • Những chủng vi khuẩn ruột mối cho hoạt tính cao là: F 2.2, F4.3, F1.1.1 Tôi sử dụng chủng F2.2 để thực hiên nghiên cứu • Nghiên cứu thời gian nuôi cấy vi khuẩn ruột mối chủng F 2.2 cho hoạt tính cao Thời điểm sau ngày ni cấy chủng F 2.2 cho hoạt tính cao • Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ chủng F 2.2 tách từ vi khuẩn ruột mối : - Môi trường hoạt hóa tối ưu: D8 - Mơi trường ni cấy thích hợp : D8 - Thời gian nuôi cấy cho phát triển tối đa hoạt tính cao: 24h - Nhiệt độ tối ưu : 350 C - pH tối ưu : pH - Nồng độ chất tối ưu môi trường dinh dưỡng : CMC 1% v - Nguồn dinh dưỡng Carbon tốt nhất: Tinh bột - Nguồn dinh dưỡng Nito tốt : Cao thịt bò MỤC LỤC Trang Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân i Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm i MSSV : 1052043910 i Ngành : Công nghệ thực phẩm i Nội dung nghiên cứu thiết kế: ii Nhận xét cán hướng dẫn: ii Tiến hành thí nghiệm 53 Vi khuẩn sinh trưởng phát triển qua giai đoạn: 66 - Giai đoạn tiềm phát 66 - Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển) 66 - Giai đoạn cân 66 - Giai đoạn suy vong 66 Tuyển chọn chủng VSV phát triển mạnh sinh enzyme cellulase có hoạt tính cao để bảo quản sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng 76 Nghiên cứu để thu nhận, tinh sử dụng enzyme cellulase vào mục đích ứng dụng vĩ mô hầu hết ngành công nghiệp: công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống 76 Nguyễn Đức lượng số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia TP.HCM 77 Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn khai thác trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 77 Nghiêm Ngọc Minh cộng (2006), Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 77 Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo- β-1,4-glucanase, NXB Đại hõ Thái nguyên 78 10 Vũ Văn Tuyển (1991) Kết bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cà phê- tạp chí khoa học kĩ thuật số 16 1-33tr .78 22 Bhatta D R 1994 Isolation and Characterization of the thermophilic bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation) Tribhuvan University, Nepal 79 vi 23 Richmond P.A., [1991] Occurrence and functions native cellulose In: Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of cellulose Dekker, New York, 5-23 79 24 Bhat M.K [2000] Cellulases and related enzymes in biotechnology Biotechnol Adv.,18: 355-383 79 25 Maki ML, Broere M,Leung KT and Qin W[2011] Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol 2(2): 146–154 79 26 Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012] Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity Turkish Journal of Biochemistry 79 27 Sadhu S, Maiti T K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A Review British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258 79 vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân i Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm i MSSV : 1052043910 i Ngành : Công nghệ thực phẩm i Nội dung nghiên cứu thiết kế: ii Nhận xét cán hướng dẫn: ii Tiến hành thí nghiệm 53 Vi khuẩn sinh trưởng phát triển qua giai đoạn: 66 - Giai đoạn tiềm phát 66 - Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển) 66 - Giai đoạn cân 66 - Giai đoạn suy vong 66 Tuyển chọn chủng VSV phát triển mạnh sinh enzyme cellulase có hoạt tính cao để bảo quản sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng 76 Nghiên cứu để thu nhận, tinh sử dụng enzyme cellulase vào mục đích ứng dụng vĩ mơ hầu hết ngành công nghiệp: công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống 76 Nguyễn Đức lượng số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia TP.HCM 77 Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn khai thác trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 77 Nghiêm Ngọc Minh cộng (2006), Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 77 Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo- β-1,4-glucanase, NXB Đại hõ Thái nguyên 78 10 Vũ Văn Tuyển (1991) Kết bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cà phê- tạp chí khoa học kĩ thuật số 16 1-33tr .78 22 Bhatta D R 1994 Isolation and Characterization of the thermophilic bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation) Tribhuvan University, Nepal 79 23 Richmond P.A., [1991] Occurrence and functions native cellulose In: Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of cellulose Dekker, New York, 5-23 79 24 Bhat M.K [2000] Cellulases and related enzymes in biotechnology Biotechnol Adv.,18: 355-383 79 viii 25 Maki ML, Broere M,Leung KT and Qin W[2011] Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol 2(2): 146–154 79 26 Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012] Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity Turkish Journal of Biochemistry 79 27 Sadhu S, Maiti T K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A Review British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258 79 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân i Lớp : 51K2- Hóa Thực Phẩm i MSSV : 1052043910 i Ngành : Công nghệ thực phẩm i Nội dung nghiên cứu thiết kế: ii Nhận xét cán hướng dẫn: ii Tiến hành thí nghiệm 53 Vi khuẩn sinh trưởng phát triển qua giai đoạn: 66 - Giai đoạn tiềm phát 66 - Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển) 66 - Giai đoạn cân 66 - Giai đoạn suy vong 66 Tuyển chọn chủng VSV phát triển mạnh sinh enzyme cellulase có hoạt tính cao để bảo quản sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng 76 Nghiên cứu để thu nhận, tinh sử dụng enzyme cellulase vào mục đích ứng dụng vĩ mơ hầu hết ngành công nghiệp: công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống 76 Nguyễn Đức lượng số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia TP.HCM 77 Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn khai thác trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 77 Nghiêm Ngọc Minh cộng (2006), Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 77 Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo- β-1,4-glucanase, NXB Đại hõ Thái nguyên 78 10 Vũ Văn Tuyển (1991) Kết bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cà phê- tạp chí khoa học kĩ thuật số 16 1-33tr .78 22 Bhatta D R 1994 Isolation and Characterization of the thermophilic bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation) Tribhuvan University, Nepal 79 23 Richmond P.A., [1991] Occurrence and functions native cellulose In: Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of cellulose Dekker, New York, 5-23 79 24 Bhat M.K [2000] Cellulases and related enzymes in biotechnology Biotechnol Adv.,18: 355-383 79 x D6 BHM chủng F2.2 phát triển mức tương đối Với môi trường ni cấy D8 chủng F2.2 phát triển tốt nhất, có khả sinh cellulase cao cho hoạt lực mạnh Vì vây mơi trường D8 lựa chọn làm môi trường nhân giống cho chủng phất triển môi trường sinh tổng hợp cellulase chủng F2.2 3.4 Nghiên cứu khả phát triển sinh tổng hợp cellulase chủng F 2.2 môi trường D8 Quá trình phát triển sinh tổng hợp cellulase chủng F 2.2 diễn theo hai giao đoạn sau: Giai đoạn phát triển: Đây trình tế bào VSV sử dụng chất dinh dưỡng sẵn có môi trường nuôi cấy để sinh trưởng, nhằm đạt đến số lượng tế bào cực đại Giai đoạn sinh tổng hợp: Quá trình tế bào VSV tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao Tiến hành nghiên cứu cố định yếu tố tối ưu đạt 3.4.1 Xây dựng đường chuẩn độ đục mật độ tế bào theo thời gian Chủng F2.2 lấy từ ống nghiệm giữ giống đem cấy chủng vào môi trường lỏng D8 Thực đồng thời :Đo độ đục chang đĩa xác định mật độ tế bào có dịch nuôi cấy theo thời gian Kết qủa thu biểu bảng sau: Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên phát triển vi khuẩn chủng F2.2 Thời 12 16 20 24 28 32 25 40 93 133 242 295 329 384 422 gian (h) Độ đục (FAU) Mật độ 18.106 29.106 70.106 95.106 174.106 212.106 236.106 275.106 303.106 tế bào/ml 65 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên phát triển tế bào chủng F2.2 3.4.2 Nghiên cứu phát triển vi khuẩn sinh cellulase theo thời gian Tiến hành nuôi cấy chủng F 2.2 môi trường D8 tuyển chọn ni lắc khơng khoảng thời gian ngày Cứ đo độ đục dông hồ lần chang đĩa D5 để điếm số lượng tế bào phát triển thời gian Quá trình chang đĩa để đếm khuẩn lạc dịch ni cấy đem pha lỗng nhằm đếm số khuẩn lạc phát triển đĩa peptri Vi khuẩn sinh trưởng phát triển qua giai đoạn: - Giai đoạn tiềm phát - Giai đoạn logarit (giai đoạn phát triển) - Giai đoạn cân - Giai đoạn suy vong Kết thu thẻ qua bảng sau Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên phát triển tế bào chủng F2.2 Thời gian (h) Độ đục 25 40 (FAU) 12 16 93 133 242 20 24 28 32 36 40 44 48 52 29 32 38 42 48 48 49 50 500 2 66 Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian lên phát triển chủng F2.2 Nhận xét Từ kết biểu dồ đạt nhận thấy có giai đoạn phát triển VSV Trong pha phát triển thời gian nhân giống chủng phát triển mạnh rõ rệt 24h Sau đó, q trình phát triển giảm chuyển sang giao đoạn cân suy vòn.Tức sau thời gian ni cấy ngày, số lượng tế bào phát triển lớn nhất, cellulase sinh nhiều cho hoạt độ tối đa 3.4.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả phát triển sinh tổng hợp chủng F2.2 3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng F 2.2 Mỗi loại enzyme cellulase thu từ chủng khác có khoảng pH tối thích khác mà khoảng pH hoạt tính chúng lớn nhất, tưc chủng phát triển hoạt động mạnh Ngồi khoảng pH enzyme bị kìm hãm hoạt động khơng hoạt động bị tiêu diệt Để khảo sát nghiên cứu ảnh hưởng độ pH lên hoạt tính cellulase tơi tiến hành nuôi cấy chủng F 2.2 giá trị pH khác từ 4-8 24 sau đo độ đục tức lượng sinh khối phát triển tế bào hay lượng cellulase sản sinh kết bảng 3.5 67 Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase chủng F2.2 pH môi trường Độ đục (FAU) 14 60 336 598 425 Hoạt tính cellulase 11 43 241 428 304 D-d (mm) Mật độ tế bào x 106 /ml Hình 3.7 Ảnh của pH đến hoạt tính enzyme cellulase chủng F2.2 Nhận xét Kết bảng 3.5 hình 3.4 cho thấy khả phát triển sinh tổng hợp cellulase chủng F 2.2 mạnh khoảng 6-8 mạnh pH trung tính Các mơi trường có tính axit bazo khơng thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng F 2.2 kìm hãm khả sinh cellulase có hoạt độ cao Chủng VSV F2.2 thích hợp phát triển mơi trường có độ pH trung tính 68 3.4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phát triển chủng F2.2 Nhiệt độ thông số quan trọng ảnh hưởng đến phát triển, sinh trưởng tế bào VSV hoạt tính enzyme Để đánh giá mức độ ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh cellulase chủng F 2.2, bố trí ni chủng mơi trường lỏng ni cấy cố định độ pH tối ưu pH 7và nuôi 24 h giá trị nhiệt độ khác 350 C, 400C, 450C Thu kết bảng sau Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme cellulase chủng F2.2 Nhiệt độ 30 35 40 45 50 Độ đục (FAU) 298 468 280 112 46 Mật độ tế bào 214 336 199 81 34 106/ ml Hoạt tính cellulase 13 20 12 D-d (mm) Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 Nhận xét Dựa vào kết thu ta thấy rằng: 69 Ở nhiệt độ cao kìm hãm phát triển, nhân giống sinh tổng hợp chủng F 2.2 gây chết tế bào.Thông thường với vản chất enzyme cellulase hoạt tính nhiệt độ 450 C Khả phát triển của chủng F 2.2 nhiệt độ thấp cao 35 0C khả phát triển chúng bị kìm hãm Vậy nhiệt độ tối ưu cho phát triển sản sinh cellulase chủng F2.2 35 0C 3.4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất tới phát triển chủng F2.2 Thay đổi nồng độ chất môi trường nuôi cấy tức tác động đến khả sinh trưởng phát triển cellulase Tiến hành với nồng độ chất khác 0.1%; 0.5%; 1%; 1.5% nuôi 24h ph 7, nhiệt độ 350 C cố định ta kết sau Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ co chất lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 Nồng độ chất (%) 0.1 0.5 1.5 Độ đục (FAU) Mật độ tế bào 106/ ml Hoạt tính cellulase 127 92 189 136 12 264 189 16 192 138 13 D-d (mm) Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 70 Hình 3.10 Thử hoạt tính mơi trường M2 Nhận xét: Dựa vào kết thu ta thấy nồng độ chất 1% chủng F 2.2 phát triển mạnh Nguyên nhân lượng tế bào nuôi cấy ban đầu cần nồng độ chất lớn để đủ cho trình phân giải giai đoạn phát triển sản sinh cellulase Cũng nồng độ chất bé thiếu nồng độ chất lớn gây ức chế.Vậy nồng độ chất phù hợp CMC 1% 3.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng Carbon Nito đến phát triển chủng F2.2 Mỗi chủng VSV phù hợp với nguồn nguồn dinh dưỡng khác Từ nguồn dinh dưỡng có tác động lớn đến phát triển chúng ảnh hưởng đến khả sinh cellulase hoạt tính cellulase Tiến hành thay đổi nguồn đinhưỡng C N môi trường nuôi cấy sau cố định giá trị tối ưu phù hợp khác nghiên cứu lựa chọn.Nguồn dinh dưỡng C môi trường nuôi cấy ban đầu glucose thay fructose, saccarose tinh bột Nguồn dinh dưỡng N cao thịt bò ban đầu thay cao thịt gói, pepton Gelatin Kết thu sau 71 Nguồn dinh dưỡng Carbon Sau 24h nuôi cấy, thực đo độ đục vòng thủy phân ta thu kết bảng sau: Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng Carbon lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 Nguồn Carbon Tinh bột Fructose Saccarose Glucose Độ đục (FAU) 317 158 183 169 Mật độ tế bào x 106/ml 227 114 132 122 Hoạt tính cellulase D-d (mm) Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn dinh dưng Carbon lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 72 Hình 3.12 Thử hoạt tính nguồn dinh dưỡng Carbon M2 Nguồn dinh dưỡng Nitơ Thưc hiên ni cấy 24h Sau đó, đo độ đục tế bào vòng thủy phân M2 ta thu kết bảng sau: Bảng 3.11 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng Nito lên hoạt tính cellulase chủng F 2.2 Nguồn Nito Pepton Cao thịt gói Gelatin Cao thịt bò Độ đục (FAU) 106 130 40 252 Mật độ tế bào x 106/ml 77 94 29 181 Hoạt tính cellulase D-d (mm) 73 Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng Nito lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 Hình 3.14 Thử hoạt tính nguồn dinh dưỡng Nito M2 Nhận xét: 74 Theo kết bảng biểu đồ ta thấy - Nguồn dinh đưỡng Carbon tinh bột, saccarose, fructose, glucose cung cấp chất cần thiết sự phát triển tế bào chủng F 2.2 sinh tổng hợp enzyme cellulase Tuy nhiên tinh bột nguồn dinh dưỡng Carbon tối ưu cho phát triển chúng - Trong tất cá nguồn dinh dưỡng Nito gelatin khơng thích hợp kìm hãm phát triển chủng F 2.2 Đối với chủng F2.2 gelatin nguồn dinh dưỡng khơng nito thích hợp Cao thịt bò nguồn dinh dưỡng tốt cho phát triển sản sinh cellulase cho hoạt độ cao Vì vậy, nguồn dinh dưỡng thích hợp cho phát triển tối đa chủng F 2.2 trình sinh tổng hợp enzyme cellulase là: - Nguồn Nito: Cao thịt bò - Nguồn Carbon: Tinh bột 75 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đưa số kết luận sau : - Đã phân lập 14 chủng F ruột mối, có số chủng mạnh có hoạt tính cellulase số chủng khơng có hoạt tính Tơi chọn chủng F 2.2 có hoạt tính cellulase cao để nghiên cứu - Đã chọn môi trường nuôi cấy hoạt hóa phù hợp cho chủng F 2.2 môi trường D8 - Nghiên cứu xác định chủng F 2.2 sinh trưởng phát triển, sinh enzyme cellulase tốt : * Thời gian nuôi cấy: 24h * Độ pH tối ưu: pH * Nhiệt độ ni cấy thích hợp: 35 C * Nồng độ chất: CMC 1% * Nguồn dinh dưỡng Carbon: Tinh bột * Nguồn dinh dưỡng Nito: Cao thịt bò Hướng nghiên cứu đề tài Tuyển chọn chủng VSV phát triển mạnh sinh enzyme cellulase có hoạt tính cao để bảo quản sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng Nghiên cứu để thu nhận, tinh sử dụng enzyme cellulase vào mục đích ứng dụng vĩ mơ hầu hết ngành công nghiệp: công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt may, ngành công nghiệp đồ uống Khảo sát ứng dụng enzyme cellulase thô chủng F 2.2 phân hủy rác thải từ ngành công nhiệp giấy, gỗ, rơm rạ Nghiên cứu tạo nguồn lượng sinh học sạch, an toàn, an toàn kinh tế 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Đặng Minh Hằng (1999), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật đẻ xử lý rác”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 333-339 2.Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), “Sử dụng VSV có hoạt độ phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp”, Báo cáo Khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 546-551 3.Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), “Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng Penicilium SP DTQ-HK1” Tạp trí cơng nghệ sinh học 5(3), tr 355-362 Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), “Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng VSV ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải” Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 790-797 5.Trương Nam Hải cộng (2011-2012) : “sàng lọc enzyme tham gia vào trình phân giải cellulose, hemicellulose kỹ thuậy metagenomics” Nguyễn Đức lượng số tác giả (2004), công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia TP.HCM Nguyễn Thanh Ngọc, Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn khai thác trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối Nghiêm Ngọc Minh cộng (2006), Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 77 Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4-glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo- β-1,4-glucanase, NXB Đại hõ Thái nguyên 10 Vũ Văn Tuyển (1991) Kết bước đầu nghiên cứu xử lí mối hại cà phê- tạp chí khoa học kĩ thuật số 16 1-33tr TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11.Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002), “Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild – type strai” Turk J Biol 26, p 209-213 12.Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999) “Endoglucanase 28 (Cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase” Eur J Biochem 259, p 88-95 13.Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, Mattiasson B (2000), “Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains” Journal of Biotechnology, Vol 83, p 177-187 14 Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999) “Endoglucanase 28 (Cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase” Eur J Biochem 259, p 88-95 15 Ogawa K, Toyama D, Fujii N (1991), “Microcrystalline cellulosehydrolyzing cellulase from Trichoderma reseii CDU-II” Journal of General and Applied Microbiology, Vol.37, p 249-259 16.Lori MR and Gleen HC (1989), “Cellulases of bacterial origin” Enzyme and Microbial Technology, Vol 11: 626-644 17 Susumu I, Shitsuw S, Katsuya O, Shuji K, Kikuhiko O, Shigeo I, Akira T, Yu-Ichi O and Tomokazu S (1989), “Alkaline cellulase for laundry detergents: production by Bacillus sp KSM-635 and enzymatic properties” Agricultural and Biological Chemistry, Vol 53, p 1275-1281 18 William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial biotechnology” Elsevier Science Publishing CO, INC, p 1-70 78 enzymes and 19 König, H (2006) Bacillus species in the intestine of termites and other soil invertebrates J Appl Microbiol 101, 620–627 20 Subodh K.Upadhyaya et al Isolation and characterization of cellulolytic bacteria from gut of Termite Rentech Symposium Compendium, Volume 1, t3- 2013 21 Wood, T.G., and Johnson, R.A (1985) The biology, physiology, and ecology of termite In Economic Impact and Control of Social Insects, (NY: Greenwood Publishing Group, Incorporated), pp 1–68 22 Bhatta D R 1994 Isolation and Characterization of the thermophilic bacteria from the hot spring of Nepal (dissertation) Tribhuvan University, Nepal 23 Richmond P.A., [1991] Occurrence and functions native cellulose In: Haigler, CH, Weimer, JP (Eds.) Biosynthesis and Biodegradation of Dekker, New York, 5-23 24 Bhat M.K [2000] Cellulases and related enzymes in biotechnology Biotechnol Adv.,18: 355-383 25 Maki ML, Broere M,Leung KT and cellulose Qin W[2011] Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers.Int J BiochemMol Biol 2(2): 146–154 26 Muhammad I, Safdar A, Quratulain S, Muhammad N, [2012] Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity Turkish Journal of Biochemistry 27 Sadhu S, Maiti T K., [2013] Cellulase production by Bacteria: A Review British Microbiology Research Journal 3(3): 235-258 79 ... ÁN Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển sinh tổng hợp enzyme cellulase vi khuẩn ruột mối Nội dung nghiên cứu: - Tuyển chọn chủng vi khuẩn ruột mối có hoạt tính cao để tiến hành nghiên. .. Xuất phát từ lý tình hình nghiên cứu Vi t nam lợi tích to lớn, thiết thực ,tơi tiến hành thực đề tài: " Nghiên 12 cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả phát triển sinh tổng hợp enzyme cellulase VSV ttrong... VSV ttrong ruột mối" Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đồ án tơi có nhiệm vụ: - Tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme cellulase Vật