NGhiên cứu về sâm Ngọc linh và các chất có trong sâm

MỞ ĐẦU *** - Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời. Trong số đó, sâm Ngọc Linh là một loài cây dược liệu đang được quan tâm và nghiên cứu bởi vì tính thần dược của nó. Sâm Ngọc Linh được nghiên cứu từ năm 1973 cho đến nay. Đặc biệt là những nghiên cứu liên quan đến Saponin và tính dược lý của sâm Ngọc Linh. Theo truyền thống, sâm Ngọc Linh là một trong những cây thuốc có nhiều công dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. - Ginsenosides (saponin) được đánh giá nhưng một thành phần quan trọng trong rễ nhân sâm. Ngoài ra, nhân sâm còn chứa rất nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo và vitamin (Lee và ctv, 1995). Vì vậy mà ngày nay, những ứng dụng của công nghệ chiết xuất dược liệu cung rất được quan tâm. Bên cạnh đó, ứng dụng của ngành công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh cũng được quan tâm không kém. Trong tiểu luận này, chúng tôi muốn đề cập đến việc làm sao để thu được một lượng saponin cao. Đó là việc sử dụng dung môi CO2¬ siêu tới hạn trong việc chiết xuất saponin, và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ bất định sâm Ngọc Linh để tạo một số lượng lớn hoạt chất dược liệu phục vụ cho sức khỏe cộng đồng.

MỤC LỤC

***

MỞ ĐẦU………2

TỔNG QUAN………3

1 Phân loại:……… 3

2 Đặc điểm hình thái:……… 3

3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh:……… 4

4 Đặc điểm thích nghi:……….5

5 Giá trị dược liệu và công dụng:………6

5.1 Giá trị dược liệu:………6

5.2.Công dụng:……… 8

6 Giá trị kinh tế:……… 9

7 Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:………… 10

8 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh:…….17

9 Giới thiệu một số phương pháp tách chiết Saponin:……….19

KẾT LUẬN……….22

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 23

MỞ ĐẦU ***

- Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và truyền thống sửdụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời Trong số đó, sâm Ngọc Linh là mộtloài cây dược liệu đang được quan tâm và nghiên cứu bởi vì tính thần dượccủa nó Sâm Ngọc Linh được nghiên cứu từ năm 1973 cho đến nay Đặcbiệt là những nghiên cứu liên quan đến Saponin và tính dược lý của sâmNgọc Linh Theo truyền thống, sâm Ngọc Linh là một trong những câythuốc có nhiều công dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý và trầmcảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư,bảo vệ tế bào gan

- Ginsenosides (saponin) được đánh giá nhưng một thành phần quan trọngtrong rễ nhân sâm Ngoài ra, nhân sâm còn chứa rất nhiều thành phần khácnhư: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo và vitamin (Lee

và ctv, 1995) Vì vậy mà ngày nay, những ứng dụng của công nghệ chiếtxuất dược liệu cung rất được quan tâm Bên cạnh đó, ứng dụng của ngànhcông nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh cũng được quan tâmkhông kém Trong tiểu luận này, chúng tôi muốn đề cập đến việc làm sao đểthu được một lượng saponin cao Đó là việc sử dụng dung môi CO2 siêu tớihạn trong việc chiết xuất saponin, và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối

rễ bất định sâm Ngọc Linh để tạo một số lượng lớn hoạt chất dược liệu phục

vụ cho sức khỏe cộng đồng

TỔNG QUAN

***

1 Phân loại:

Tên khoa học: Panax Vietnamensis

Tên hai phần: Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv

(1985)

Tên gọi khác: sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm

đốt trúc, trúc tiết nhân sâm) củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu

không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới

có thêm 2 đến 3 lá Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọcvòng với 3-5 nhánh lá Cuống lá kép dài 6-12mm, mang 5 lá chét, lá chét ởchính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm Lá chét phiến hìnhbầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt Cây 4-5năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoadài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tánchính Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa

5, màu vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy Quả mọc tập trung ở trungtâm của tán lá, dài độ 0,8cm-1cm và rộng khoảng 0,5cm-0,6cm, sau haitháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngảmàu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả Mỗi quả chứa mộthạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30quả

3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm ngọc linh:

- Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến 100cm, thoạtnhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhưng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo vàcác đốt như đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại

- Sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng kháchậm Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủđông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa Từtháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả Tháng 7 bắt đầu có quả chín vàkéo dài đến tháng 9 Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng,

để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng

12

- Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thểnhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có mộtsẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo làtrên 5 năm tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ củasâm

4 Đặc điểm thích nghi:

- Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với

lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừngnguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh

- Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao

độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao nhất ởkhoảng từ 1.700-2.000m dưới tán rừng già

- Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc

Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núiNgọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở LạcDương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này

- Sâm ngọc linh thường mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt

độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C Chúng sinh trưởng ở độcao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc dày thành những đám dưới tánrừng dọc theo các suối ẩm trên những mảnh đất nhiều mùn

5 Giá trị dược liệu và công dụng:

5.1 Giá trị dược liệu:

- Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấythành phần saponin triterpen của tam thất, nhân sâm và sâm Ngọc Linh có 9hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khácnhau

- Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từsâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học chothấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ,sâm Nhật) và 24 saponin pammaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại cácloại sâm khác trên thế giới

- Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là mộttrong những cây sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất(khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác củachi Panax Ngoài ra trong sâm Ngọc Linh còn có 14 axít béo, 16 axít amin(trong đó có 8 axít amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng, vilượng

- Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học,thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52saponin trong đó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâmNhật Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin pammaran, trong đó có

8 saponin có cấu trúc mới Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 axítamin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%

- Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng

lá và rễ con

- Từ rễ và thân rễ Sâm Việt Nam thiên nhiên, hơn 50 hợp chất saponin đãđược chiết xuất và xác định, trong đó có 24 saponin có cấu trúc mới.

- Saponin có cấu trúc đã biết: gồm chủ yếu cácsaponin nhóm damaran: ginsenosid-Rb1, -Rb2, -Rb3 , -Rc, -Rd, pseudo-ginsenosid-RC1, gypenosid-IX, gypenosid-XVII, quinquenosid-R1, noto-ginsenosid-Fa và majorosid-F1 (nhóm proto-panaxadiol); ginsenosid-Re, 20-gluco-ginsenosid-Rf, ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rh1 và 20(R)-ginsenoside-

Rh1, pseudo-ginsenosid-RS1 (=mono-acetyl ginsenosid-Re), R1, notogin-senosid-R6 (nhóm protopanaxatriol); pseudoginse-nosid-RT4,

notoginsenosid-24(S)-pseudo-ginsenosid-F11, majonosid -R1 và majonosid-R2 (nhómocotillol)

- Sâm Việt Nam chứa rất ít saponin thuộc nhóm olean gồm ginsenosid-Ro (=Chikusetsu-saponin-V) và hemslosid-Ma3

- Các saponin có cấu trúc mới: được đặt tên là vina-ginsenosid-R1 > R24.Công thức và thu suất các hợp chất mới này được trình bày trong hình 1

- Sâm Việt Nam chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ítsaponin nhóm olean Thành phần saponin của Sâm Việt Nam rất giống vớithành phần của các loài sâm trồng đã nêu (Bảng 1)

Bảng 1 Hàm lượng saponin (tính theo thu suất %) của Sâm Việt Nam và

các loài Panax trồng trọt (ppd: protopanaxadiol; ppt: protopanaxatriol).

- Trong dân gian sâm ngọc linh được dùng như một loại thuốc trong những

bài thuốc cổ truyền cầm máu, lành vết thương, làm thuốc bổ, sốt rét, đaubụng, phù thũng

- Một số nghiên cứu gần đây cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng chốngstress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống ôxihóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan

- Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnhnhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cảithiện, gia tăng sức đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh

và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp

- Theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh có những tính năng tuyệt hảonhư tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thểtrở lại bình thường; kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sốngcủa tế bào và tăng các tế bào mới

- Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâmTrung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu,chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểuđường

- Về mặt dược lý, Sâm Việt Nam chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc

mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (25) (thu suất

khoảng 5% và chiếm phân nửa lượng saponin toàn phần).Streptococci bệnh

lý và có tác dụng tốt với chứng viêm họng (sore-throat) Gần đây, các thửnghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2, saponin chủ yếu của Sâm ViệtNam, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tiến chống ung thư (anti-cancer promoting agent) quan trọng

- Cấu trúc của các saponin mới trong sâm Việt Nam còn giúp giải thích quátrình sinh tổng hợp các triterpen dammaran trong thực vật

6 Giá trị kinh tế:

- Hiện nay, giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh rất cao Bình quân 150 cây sâmNgọc Linh 6 năm tuổi sẽ cho sản lượng 1kg củ tươi với giá hơn 15 triệuđồng Ngoài việc phát triển cây sâm Ngọc Linh như là loại cây có giá trị

kinh tế cao thì việc di thực cây sâm Ngọc Linh về Tây Giang còn có ý nghĩabảo tồn một loại dược liệu quý hiếm trên địa bàn tỉnh Phó Giám đốc Sở Y

tế Nguyễn Như Chính cho biết: Cây sâm Ngọc Linh là loại dược liệu quýđặc hữu ở vùng núi Ngọc Linh Giá trị dược liệu của nó không thua kémsâm Triều Tiên, sâm Mỹ hay sâm Siberi

7 Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:

 Dựa trên tính chất tạo bọt: Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do

phân tư saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵnước Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ

bộ phân biệt saponin streroid và triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thựcvật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằngnhau, cho vào ống thứ nhất 5ml NaOH 0.1N (pH=13) Cho thêm vào mỗiống nghiệm 2-3 giọt dung dịch chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ốngtrong 15 giây Để yên, nếu cột bọt trong cả hai ống cao ngang nhau và bềnnhư nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid Nếuống kiềm có bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid Cóthể dựa vào tỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là

số ml nước để hòa tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cmsau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định) Cách tiến hành: cân1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình có thể tích 500ml đã chứasẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêmnước cho đúng 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao16cm và đường kính16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nướccất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắctheo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc Để yên trong 15 phút và đo

chiều cao của các cột bọt Nếu cột bọt trong ống thấp dưới 100 Nếu ống cócột bọt cao 1cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau:ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là:

(10*1)/4=250

- Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1,2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữagam

 Dựa trên tính chất phá huyết: đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin.

Tuy nhiên cũng có một vài saponin cũng có tính chất này Khả năng pháhuyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin Người ta cho răngf tính pháhuyết có liên quan đến sự tao phức với cholesterol và các ester của nó trongmàng hầu cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạophức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỉ lệ thuận với nhau nênngười ta cho răng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phầnkhác của màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết nhưng phầnđường cũng có ảnh hưởng Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tácđộng khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin Hồng cầucừu dễ bị phá huyết nên dung tốt, có thể dung máy của súc vật có sừng khác,hoặc dung máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm

- Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số pháhuyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1gnguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên saponin và toàn đối với một thứmáu đã chọn (tiến hành trong điều qui định) Cách tiến hành:

* Pha dung dịch đệm:

o Dung dịch mono kali phosphat 9,07% 28ml

o Dung dịch dinatri phosphate 11.87% 162ml

o NaCl tinh khiết 1.8g

* Pha dung treo máu:

o Để làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máusúc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình một lít có miệng rộng, dung đũaquấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh và lắc tròn khoảng 10phút, lọc qua rạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dung được vài ngày Từmáy đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm

Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thínghiệm bằng cách khác nhau như sau: Lấy 4.5ml máu thỏ trộn với 0.5mldung dịch 3.65% Natri citrate rồi thêm 200ml dung dịch đệm

* Pha dung dịch saponin:

o Bột nguyên liệu đã rây qua rây 0.5 mm, cân chính xác 0.5-1g, cho vào bình,

thêm dung dịch đệm (50-100ml) rồi đặt lên nồi cách thủy (95-980C) trong 30phút Lọc rồi pha đến thể tích chính xác

* Thử sơ bộ:

Pha các hỗn hợp theo bảng dưới đây:

- Lắc nhẹ ngay hỗn hợp ( tránh tạo bọt ) Sau 30 phút, lắc lại rồi để yên trong6h ở nhiệt độ phòng Quan sát các ống và xác định ống ( hoặc các ống ) cóhiện tượng phá huyết hoàn toàn, nghĩa là ống đỏ đều và trong, không cóhồng cầu lắng đọng

- Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung đệm đểpha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả 3 ống II, III, IV thì pha loãng dịch chiết dượcliệu gấp 5(1+4), nếu cả 4 ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiếtdược liệu gấp 10 lần (1+9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu Nếu trườnghợp ngược lại, nghĩa là 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toànthì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đăc hơn.

- Thí nghiệm quyết định: Lấy 2 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống phá huyết),đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: dung dịch chiếtnguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0.05ml, ống thứ hai 10ml,dung dịch đệm theo thứ tự giảm dần: ống thứ nhất 0.95ml, ống thứ hai0.90ml, dung treo nữa Sau 24 giờ thì đọc kết quả: tìm ống đầu tiên có hiệntượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó.Chính độ pha loãng của ống này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu Có thểđọc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau khi đã

để yên 2 giờ

 Dựa trên độ độc đối với cá: Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin nên

người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon) Đểđánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá Chỉ số

cá cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá,

…

 Khả năng tạo phức với Cholesterol: Những Saponin triterpenoid tạo phức

kém hơn loại steroid Trong loại steroid thì digitonin kết hợp với cholesterolgần như hoàn toàn do đó digitonin được dùng làm thuốc thử để định lượngcholesterol trong hóa sinh

 Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hoàn tan các saponin và cho

màu thay đổi từ và, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (phản ứng Salkowski)