NGhiên cứu về sâm Ngọc linh và các chất có trong sâm

MỞ ĐẦU *** - Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời. Trong số đó, sâm Ngọc Linh là một loài cây dược liệu đang được quan tâm và nghiên cứu bởi vì tính thần dược của nó. Sâm Ngọc Linh được nghiên cứu từ năm 1973 cho đến nay. Đặc biệt là những nghiên cứu liên quan đến Saponin và tính dược lý của sâm Ngọc Linh. Theo truyền thống, sâm Ngọc Linh là một trong những cây thuốc có nhiều công dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. - Ginsenosides (saponin) được đánh giá nhưng một thành phần quan trọng trong rễ nhân sâm. Ngoài ra, nhân sâm còn chứa rất nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo và vitamin (Lee và ctv, 1995). Vì vậy mà ngày nay, những ứng dụng của công nghệ chiết xuất dược liệu cung rất được quan tâm. Bên cạnh đó, ứng dụng của ngành công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh cũng được quan tâm không kém. Trong tiểu luận này, chúng tôi muốn đề cập đến việc làm sao để thu được một lượng saponin cao. Đó là việc sử dụng dung môi CO2¬ siêu tới hạn trong việc chiết xuất saponin, và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ bất định sâm Ngọc Linh để tạo một số lượng lớn hoạt chất dược liệu phục vụ cho sức khỏe cộng đồng.

MỤC LỤC *** MỞ ĐẦU………………………………………………………………………2 TỔNG QUAN…………………………………………………………………3 1. Phân loại:……………………………………………………………… 3 2. Đặc điểm hình thái:…………………………………………………… 3 3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh:…………… .4 4. Đặc điểm thích nghi:…………………………………………………….5 5. Giá trị dược liệu và công dụng:…………………………………………6 5.1. Giá trị dược liệu:……………………………………………………6 5.2.Công dụng:………………………………………………………… 8 6. Giá trị kinh tế:………………………………………………………… .9 7. Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:………… 10 8. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh:…….17 9. Giới thiệu một số phương pháp tách chiết Saponin:………………….19 KẾT LUẬN…………………………………………………………………….22 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 23 MỞ ĐẦU 1 *** - Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời. Trong số đó, sâm Ngọc Linh là một loài cây dược liệu đang được quan tâm và nghiên cứu bởi vì tính thần dược của nó. Sâm Ngọc Linh được nghiên cứu từ năm 1973 cho đến nay. Đặc biệt là những nghiên cứu liên quan đến Saponin và tính dược lý của sâm Ngọc Linh. Theo truyền thống, sâm Ngọc Linh là một trong những cây thuốc có nhiều công dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. - Ginsenosides (saponin) được đánh giá nhưng một thành phần quan trọng trong rễ nhân sâm. Ngoài ra, nhân sâm còn chứa rất nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo và vitamin (Lee và ctv, 1995). Vì vậy mà ngày nay, những ứng dụng của công nghệ chiết xuất dược liệu cung rất được quan tâm. Bên cạnh đó, ứng dụng của ngành công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh cũng được quan tâm không kém. Trong tiểu luận này, chúng tôi muốn đề cập đến việc làm sao để thu được một lượng saponin cao. Đó là việc sử dụng dung môi CO 2 siêu tới hạn trong việc chiết xuất saponin, và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ bất định sâm Ngọc Linh để tạo một số lượng lớn hoạt chất dược liệu phục vụ cho sức khỏe cộng đồng. TỔNG QUAN 2 *** 1. Phân loại: Tên khoa học: Panax Vietnamensis Tên hai phần: Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv (1985) Tên gọi khác: sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm) củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu Giới: Plantae Bộ: Apiales Họ: họ Cam tùng (Araliaceae) Phân họ: Aralioideae Chi: Panax Nhánh: Panax Loài: P. vietnamensis 2. Đặc điểm hình thái: - Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4-8mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ có đường kính 1-2cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3cm, mang nhiều r ễ nhánh và c ủ . Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7cm, tuy sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá. Cuống lá kép dài 6-12mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía 3 dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8cm-1cm và rộng khoảng 0,5cm-0,6cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. 3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm ngọc linh: - Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến 100cm, thoạt nhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhưng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo và các đốt như đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại. - Sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. - Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm. 4. Đặc điểm thích nghi: 4 - Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh. - Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.700-2.000m dưới tán rừng già. - Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này. - Sâm ngọc linh thường mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Chúng sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc dày thành những đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên những mảnh đất nhiều mùn. 5. Giá trị dược liệu và công dụng: 5.1. Giá trị dược liệu: - Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấy thành phần saponin triterpen của tam thất, nhân sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau. - Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin pammaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới. 5 - Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax. Ngoài ra trong sâm Ngọc Linh còn có 14 axít béo, 16 axít amin (trong đó có 8 axít amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng, vi lượng. - Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin trong đó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%. - Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. - Từ rễ và thân rễ Sâm Việt Nam thiên nhiên, hơn 50 hợp chất saponin đã được chiết xuất và xác định, trong đó có 24 saponin có cấu trúc mới. - Saponin có cấu trúc đã biết: gồm chủ yếu các saponin nhóm damaran: ginsenosid-Rb 1 , -Rb 2 , -Rb 3 , -Rc, -Rd, pseudo- ginsenosid-RC 1 , gypenosid-IX, gypenosid-XVII, quinquenosid-R1, noto- ginsenosid-Fa và majorosid-F 1 (nhóm proto-panaxadiol); ginsenosid-Re, 20- gluco-ginsenosid-Rf, ginsenosid-Rg 1 , ginsenosid-Rh 1 và 20(R)-ginsenoside- Rh 1 , pseudo-ginsenosid-RS 1 (=mono-acetyl ginsenosid-Re), notoginsenosid- R1, notogin-senosid-R6 (nhóm protopanaxatriol); pseudoginse-nosid-RT 4 , 24(S)-pseudo-ginsenosid-F 11 , majonosid -R1 và majonosid-R2 (nhóm ocotillol). - Sâm Việt Nam chứa rất ít saponin thuộc nhóm olean gồm ginsenosid-Ro (= Chikusetsu-saponin-V) và hemslosid-Ma3. - Các saponin có cấu trúc mới: được đặt tên là vina-ginsenosid-R1 --> R24. Công thức và thu suất các hợp chất mới này được trình bày trong hình 1. 6 - Sâm Việt Nam chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít saponin nhóm olean. Thành phần saponin của Sâm Việt Nam rất giống với thành phần của các loài sâm trồng đã nêu (Bảng 1). Bảng 1. Hàm lượng saponin (tính theo thu suất %) của Sâm Việt Nam và các loài Panax trồng trọt. (ppd: protopanaxadiol; ppt: protopanaxatriol). Loại aglycon P. ginseng P. notoginseng P. quinquefolium P. vietnamensis 20(S)-ppd 2.9 2.1 2.7 3.1 20(S)-ppt 0.6 2.4 1.2 2.0 Ocotillol ---- ---- 0.04 5.6 Oleanolic acid 0.02 ---- 0.07 0.09 Thu suất toàn phần (%) 3.5 4.5 4.0 10.8 5.2.Công dụng: - Trong dân gian sâm ngọc linh được dùng như một loại thuốc trong những bài thuốc cổ truyền cầm máu, lành vết thương, làm thuốc bổ, sốt rét, đau bụng, phù thũng. - Một số nghiên cứu gần đây cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. 7 - Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp. - Theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh có những tính năng tuyệt hảo như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường; kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới. - Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường. - Về mặt dược lý, Sâm Việt Nam chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (25) (thu suất khoảng 5% và chiếm phân nửa lượng saponin toàn phần).Streptococci bệnh lý và có tác dụng tốt với chứng viêm họng (sore-throat). Gần đây, các thử nghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2, saponin chủ yếu của Sâm Việt Nam, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tiến chống ung thư (anti- cancer promoting agent) quan trọng. - Cấu trúc của các saponin mới trong sâm Việt Nam còn giúp giải thích quá trình sinh tổng hợp các triterpen dammaran trong thực vật. 6. Giá trị kinh tế: - Hiện nay, giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh rất cao. Bình quân 150 cây sâm Ngọc Linh 6 năm tuổi sẽ cho sản lượng 1kg củ tươi với giá hơn 15 triệu đồng. Ngoài việc phát triển cây sâm Ngọc Linh như là loại cây có giá trị kinh tế cao thì việc di thực cây sâm Ngọc Linh về Tây Giang còn có ý nghĩa bảo tồn một loại dược liệu quý hiếm trên địa bàn tỉnh. Phó Giám đốc Sở Y 8 tế Nguyễn Như Chính cho biết: Cây sâm Ngọc Linh là loại dược liệu quý đặc hữu ở vùng núi Ngọc Linh. Giá trị dược liệu của nó không thua kém sâm Triều Tiên, sâm Mỹ hay sâm Siberi . 7. Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:  Dựa trên tính chất tạo bọt: Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tư saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin streroid và triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 2-3 giọt dung dịch chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống trong 15 giây. Để yên, nếu cột bọt trong cả hai ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào tỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là số ml nước để hòa tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định). Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao16cm và đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên trong 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Nếu cột bọt trong ống thấp dưới 100. Nếu ống có cột bọt cao 1cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau: ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là: 9 (10*1)/4=250 - Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1,2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam.  Dựa trên tính chất phá huyết: đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin cũng có tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho răngf tính phá huyết có liên quan đến sự tao phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hầu cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỉ lệ thuận với nhau nên người ta cho răng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dung tốt, có thể dung máy của súc vật có sừng khác, hoặc dung máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm. - Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên saponin và toàn đối với một thứ máu đã chọn (tiến hành trong điều qui định). Cách tiến hành: * Pha dung dịch đệm: o Dung dịch mono kali phosphat 9,07% 28ml o Dung dịch dinatri phosphate 11.87% 162ml o NaCl tinh khiết 1.8g * Pha dung treo máu: o Để làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình một lít có miệng rộng, dung đũa quấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh và lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua rạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dung được vài ngày. Từ 10 . chloroform), thuốc thử salkowski (dung dịch acid phosphoric 50% trong nước vanillin sulfuric (vanillin 1% trong cồn tuyệt đối 100ml + acid sulfuric 2ml). - Saponin. cứu nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh. Trong những năm gần đây, đã có nhiều thành công trông việc nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh trong phòng thí nghiệm. - Từ