CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

Gene Technology3D structure of nucleic acids -> 2º structure of DNA... Gene Technology3D structure of nucleic acids -> 2º structure of DNA... Gene Technology3D structure of nucleic acids

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

TS Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam chuhoangha@ibt.ac.vn/chuhoangha@yahoo.com

Nội dung chương trình:

1 Giới thiệu và một số khái niệm cơ bản về công nghệ ADN tái tổ hợp

2 Các công cụ sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

- Các loại enzyme thường dùng

- Các hệ vector

- Các hệ thống biểu hiện gen

3 Các kỹ thuật sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

- Các kỹ thuật cơ bản đối với DNA và RNA

- Kỹ thuật PCR

- Kỹ thuật điện di

- Các kỹ thuật lai phân tử

- Kỹ thuật xác định trình tự gen

- Kỹ thuật lai miễn dịch

- Các kỹ thuật phân tích genom (đa hình DNA)

4 Các nghiên cứu về cấu trúc chức năng genom (-omics)

- Genomics

- Transcriptomics

- Proteomics

- Metabolomics

5 Sản xuất các chất có hoạt tính y sinh học bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

6 Công nghệ tạo sinh vật biến đổi gen

7 An toàn sinh học

Định nghĩa công nghệ sinh học

• Định nghĩa chung: “Công nghệ sinh học là quá trình sản xuất

các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật) Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ”

• Do UNESCO (1985) định nghĩa: “Công nghệ sinh học là công

nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng”

• Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: “Công nghệ sinh học

là công nghệ chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của gen đó”.

Công nghệ sinh học hiện đại

Francis H.C Crick

James D Watson

• Tìm ra cấu trúc sợi xoắn kép

AND vào những năm 1960s

Stanley N Cohen

Herbert W Boyer

• Tách dòng thành công và phát hiện ra cơ chế phiên mã của gen

• DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ 2 hoặc nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau

• Công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật thực hiện trên một gen hoặc bộ gen nhằm cải biến cấu trúc của gen bộ gen tạo ra các gen mới trong bộ gen Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm 4 bước cơ bản:

- Tách chiết DNA, RNA, phân lập gen

- Các bước tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị

vector, các thao tác cắt, ghép nối gen,…)

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng

- Sàng lọc theo dõi hoạt động và biểu hiện của gen

Công trình của Cohen, Boyer và cs 1973

DNA và gen

• Hệ gen (genome) - lưu giữ thông tin di truyền của một

cơ thể sống, mã hóa cho các protein cấu chúc, các loại enzyme … quy định các tính trạng

• Gen là một đoạn DNA

Gene Technology

DNA and RNA – nucleic acids

Gene Technology

DNA and RNA – nucleic acids

Gene Technology

DNA – nucleic acids

Gene Technology

RNA – nucleic acids

Gene Technology

DNA and RNA

Gene Technology

DNA -> double stranded (ds) RNA -> single stranded (ss)

Gene Technology

DNA

Gene Technology

Denaturation of DNA

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 2º structure of DNA

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 2º structure of DNA

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 3º structure of DNA

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 2º structure of RNA (ss DNA)

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 3º structure of RNA (ss DNA)

Gene Technology

3D structure of nucleic acids -> 3º structure of RNA

Gene Technology

DNA and RNA – nucleic acids

Thuyết trung tâm của sinh học phân tử

Gene Technology

DNA Replication

One strand template for new strand -> Replication

Gene Technology

Replication of bacterial genome -> circular chromosome

Replication is: -> bidirectional

-> semiconservative

Gene Technology

Replication

Action of Polymerases -> formation of phosphodiester bond

Gene Technology

Replication

Action of DNA polymerase : 5’ -> 3’

Gene Technology

Replication

Replication fork

Gene Technology

Replication

Elongation of Replication

Gene Technology

Replication of bacterial genome -> circular chromosome

Chromosome partitioning in bacteria

In Eukaryotes:

1 Linear chromosomes -> Telomere ends

2 No Partitioning -> Mitosis and Meiosis ->

protein spindle pulls chromosomes

Gene Technology

Prokaryotes

Eukaryotes

Gene Technology

Eukaryotes need Telomeres -> otherwise Chromosomes would shrink

Gene Technology

Gene Technology

DNA -> mRNA -> Protein

Gene Technology

Transcription – in Prokaryotes

An electron micrograph and its

interpretive drawing showing

the simultaneous transcription

and translation of an E coli

gene

Gene Technology

Transcription – in Eukaryotes

An electron micrograph and its interpretive drawing of a hybrid between the template DNA strand of the chicken ovalbumin gene and its corresponding mRNA.

Gene Technology

Transcription: 3 steps -> Initiation

-> Elongation -> Termination

Transcription -> mRNA transcript of a gene (DNA)

-> production of mRNA by using DNA as template

Gene Technology

Transcription:

Gene Technology

Action of RNA polymerase: 5’ -> 3’

Gene Technology

Transcription – Replication -> Action of Polymerases

Direction 5’ -> 3’ 5’ -> 3’

Process Replication, DNA repair Transcription

Activated precursors dATP, dCTP, dGTP, dTTP ATP, CTP, GTP, UTP

Gene Technology

What is a gene?

Gene Technology

Transcription:

Gene Technology

Transcription -> Promoter

Prokaryotic promoter

Gene Technology

Transcription -> Promoter

E coli promoters

Gene Technology

Transcription – Initiation -> Recognition of Promoter by RNA Polymerase

Gene Technology

Transcription – Initiation -> E coli RNA Polymerase

Gene Technology

Transcription:

Gene Technology

Transcription - Initiation

Gene Technology

Transcription - Initiation

Gene Technology

Transcription – Initiation -> RNA Polymerase

Gene Technology

Transcription

Gene Technology

Transcription – Eukaryotic Promoters

Gene Technology

Transcription – Eukaryotic Promoters

Gene Technology

Transcription – Eukaryotic Initiation

Gene Technology

Rho-independent terminator

Transcription – Termination

Gene Technology

Transcription – Termination

Rho-dependent terminator

Gene Technology

DNA -> mRNA -> Protein

Gene Technology

Translation

Translation in bacteria

Gene Technology

Translation

Electron micrographs of RNA and ribosomes from silk gland cells of the silkworm Bombyx mori

Translation from mRNA -> Protein

1 Triplett (codon) -> codes for 1 AA

Gene Technology

Translation -> Codons

3 reading frames per DNA strand -> 6 per double strand

Gene Technology

Translation -> Codons form “reading frames”

Gene Technology

An open reading frame -> possible gene coding for a protein

Gene Technology

Translation -> The genetic code

Gene Technology

Translation:

Gene Technology

Ribosomes

Gene Technology

Transfer RNA -> t-RNA

Gene Technology

Transfer RNA -> t-RNA

Gene Technology

Ribosome (Bacterial Ribosome)

Gene Technology

Translation Complex

Gene Technology

Translation -> Initiation (sequence on mRNA recognized by ribosome)

RBS

Gene Technology

Translation -> Initiation (sequence on mRNA recognized by ribosome)

In Prokaryotes

Gene Technology

Translation -> Initiation (Eukaryotes)

Gene Technology

Translation

Gene Technology

Gene Technology

Gene Technology

Control of Gene Expression

DNA -> mRNA -> Protein

Gene Technology

(b) Eukaryotes

One mRNA -> One ProteinOperon: One mRNA -> More Proteins

Gene Technology

Gene Expression Control

Gene Technology

Gene Expression control -> mainly regulation of transcription

Gene Technology

Gene Expression control -> mainly regulation of transcription

Gene Technology

Negative and Positive regulation of gene expression

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Lac system

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Lac system

Cis -> on the same side of -> same DNA molecule

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Promoter

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Lac repressor

Gene Technology

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Lac system -> negative regulation

Gene Technology

Bacterial gene expression control -> The Lac system -> positive regulation

Lac system -> glucose present -> weak promoter

glucose absent -> strong promoter

CAP -> catabolite activator protein

Gene Technology

Bacterial gene expression control

-> The Trp (tryptophan) system

Gene Technology

Regulation of gene expression -> Bacteriophage lambda

Gene Technology

Regulation of gene expression -> Bacteriophage lambda

Gene Technology

Regulation of gene expression -> Eukaryotic systems

Gene Technology

Regulation of gene expression -> Eukaryotic systems -> Transcription Initiation

Gene Technology

Mediator complex

Gene Technology

Gene Expression control -> mainly regulation of transcription

Transcription mainly controlled by regulatory Proteins (Repressors, Transcription factors, ) -> DNA binding proteins

Gene Technology

Regulatory Proteins have DNA binding motifs

Gene Technology

Regulatory Proteins have DNA binding motifs

Gene Technology

Domains of DNA binding proteins

Experiment that shows that

there are 2 domains necessary

for functional DNA interacting

proteins

-> DNA binding domain

-> activation domain

Gene Technology

Domains of DNA binding proteins

Gene Technology

Enhancers -> recognition sites for transcription factors

Gene Technology

Enhancers -> Complex of beta-interferon enhancer

Gene Technology

Enhancers -> act over long distances

Gene Technology

Enhancers -> Mode of action

Gene Technology

Enhancers -> mode of action

Gene Technology

Enhancers versus Insulators

Gene Technology

DNA packaging in Prokaryotic cells

Gene Technology

DNA packaging in Eukaryotic cells

Gene Technology

Gene Expression in Eukaryotes is

controlled by DNA packaging

⇒ Acetylation pattern of histones

control gene expression

⇒ Histone deacetylation -> gene off

⇒ Histone hyperacetylation -> gene on

Gene Technology

Gene Expression in Eukaryotes is controlled