TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘIBỘ MÔN DƯỢC LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG AN THẦN CỦA CAO ĐẶC DƯỠNG TÂM AN THẦN TRÊN THỰC NGHIỆM Trường Đại học Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: Tháng 9-12/2015 C
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BỘ MÔN DƯỢC LÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG AN THẦN CỦA CAO ĐẶC
DƯỠNG TÂM AN THẦN TRÊN THỰC NGHIỆM
Trường Đại học Y Hà Nội
Thời gian nghiên cứu: Tháng 9-12/2015
Cán bộ tham gia nghiên cứu:
BSCK II Nguyễn Văn Tâm PGS.TS.Nguyễn Trần Thị Giáng Hương TS.Phạm Thị Vân Anh
TS.Trần Thanh Tùng
BS Nguyễn Chí Dũng BS.Phùng Văn Long ThS.Nguyễn Thanh Loan BS.Đinh Thị Tuyết Lan KTV Nguyễn Thành Long KTV Đàm Đình Tranh
Trang 21 NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Cao lỏng Dưỡng tâm an thần túi 170mL
1,7kg cao đặc tương đương 7500 mL cao lỏng
Liều trên người: 2 túi cao lỏng/ngày x 170mL/túi = 340 mL cao lỏng/ngày (77,07 gam cao đặc/ngày) ≈ 1,54 gam cao đặc/kg/ngày Cao lỏng Dưỡng tâm an thần được sản xuất tại bệnh viện Y dược học cổ truyền Thanh Hóa, đạt tiêu chuẩn
cơ sở
1.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng chủngSwiss, trọng lượng 22 - 25g, do Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương cung cấp
Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn chuẩn, nước uống, độ ẩm, độ thông khí và ánh sáng thích hợp trong 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu
1.1.3 Hóa chất,dụng cụ trang thiết bịnghiên cứu
1.1.3.1 Thuốc - hóa chất
- Diazepam viên nén 5mg, tên biệt dược Seduxen (của công ty Gedeon Richter)
- Nước muối 0,9% chai 500ml (của công ty B.Braun, Việt Nam)
1.1.3.2 Dụng cụ và trang thiết bị
- Trục quay Rotarod 7650, máy đo sức bám 7106, máy đo hoạt động ký Activity cage - Hãng Ugo-Basile – Italy
- Mô hình dấu cộng nâng cao theo cấu trúc và kích thước theo hướng dẫn [1]
- Găng tay, cốc nghiệm thủy tinh, kim đầu tù chuyên dụng dành cho chuột nhắt uống thuốc, bơm kim tiêm dùng 1 lần
- Bông, cồn 70% để vệ sinh máy móc sau mỗi lần đo
1.1.3.3 Dụng cụ và trang thiết bị
- Mô hình dấu cộng nâng cao
- Camera
- Đồng hồ bấm giây
1.2 Phương pháp nghiên cứu
Trang 3Mô hình dấu cộng nâng cao được thực hiện theo phương pháp của G Olayiwola và cộng sự (2013) [1]
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích đánh giá tác dụng giải lo âu của thuốctrên chuột nhắt dựa trên tâm lý căng thẳng sợ hãi của chuột khi ở khu vực hở, trên cao
Mô hình gồm có các nhánh mở và nhánh đóng được đặt trên cao Hành vi lo
sợ được đặc trưng bởi thời gian ở nhánh đóng và số lần chuột vào nhánh đóng Tăng thời gian và số lần ở nhánh mở hay giảm thời gian và số lần ở nhánh đóng thể hiện tác dụng an thần của thuốc
Cấu tạo mô hình: Mô hình chữ thập nâng cao (elevated plus maze) cho
chuột nhắt bao gồm hai nhánh mở (30x5cm) vuông góc với hai nhánh đóng (30x5x15cm), được nối với nhau bằng một vùng trung tâm (5x5cm), mô hình được nâng cao 60 cm so với mặt đất Ngoài rìa của nhánh mở có một gờ nhô cao 0,4cm
để chuột không bị rơi khỏi mô hình Cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng bóng đèn 60W
Hình 1 Mô hình dấu cộng nâng cao [1].
Tiến hành nghiên cứu:
Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 15 con
Trang 4 Lô 1 (n =10): (chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g
Lô 2 (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg
Lô 3 (n = 10): (DTAT liều tương đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12):uống
Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg
Lô 4 (n = 10): (DTAT liều gấp 3 lâm sàng): uống Dưỡng tâm an thần liều
39,9 ml/kg
- Chuột được uống nước và thuốc thử tương ứng trong 7 ngày liên tiếp
- Trước thử nghiệm chính thức chuột sẽ được khám phá và làm quen với chiều cao của mô hình vào ngày 6 trong 5 phút.Thử nghiệm chính thức được tiến hành vào ngày 7
- Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 60 phút trước khi tiến hành thử nghiệm
- Sau khi uống thuốc 1h, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm của mô hình hướng đầu vào nhánh mở, theo dõi trong 5 phút
- Chuột được tính vào các nhánh khi cả 4 chân chuột đặt vào nhánh đó
- Sau mỗi thử nghiệm, mô hình được lau bằng cồn ethanol 70%
- Các thử nghiệm đều được ghi hình bằng 1 camera
Chỉ số đánh giá:
- Số lần chuột vào nhánh mở, số lần chuột vào nhánh đóng, thời gian chuột ở nhánh mở, thời gian chuột ở nhánh đóng
- Tỷ lệ né tránh nhánh mở = (% số lần chuột ở nhánh đóng + % thời gian chuột ở nhánh đóng) x100%/2
Sơ đồ nghiên cứu tác dụng an thần trên mô hình dấu cộng nâng cao
1.2.2 Mô hình trục quay Rotarod:
Nghiên cứu đánh giá tác dụng an thần được tiến hành trên trục quay Rotarod, dựa theo mô hình của tác giả Shiotsuki H và cộng sự [4]
Ngày
Đánh giá
Chu t độ ược u ng nố ước và thu c tố ương ng ứ
ng ứ
Làm quen
6
Trang 5Hình 2 Trục quay Rotarod
Tiến hành nghiên cứu:
Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
Lô 1 (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g
Lô 2 (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg
Lô 3 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg (DTAT liều tương
đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12).
Lô 4 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg.(DTAT liều gấp 3
lâm sàng).
- Chuột được uống nước và thuốc thử tương ứng trong 7 ngày liên tiếp
- Số liệu được lấy vào các thời điểm trước khi dùng thuốc; ngày thứ 7 sau khi uống thuốc 1h và sau uống thuốc 3h
- Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước khi tiến hành thử nghiệm
- Sau khi uống thuốc 1h và 3h, chuột được theo dõi thời gian bám của chuột trên trục quay
Chỉ số đánh giá:
- Thời gian chuột trên trục quay tại thời điểm bắt đầu nghiên cứu, ngày thứ 7 sau uống thuốc 1h và 3h
Th i đi m ờ ể
Ngày 7
Chuột được uống nước và thuốc tương ứng ứng
Ngày 7
Sau 1h
Ngày 1
Trang 6Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám của chuột trên trục quay Rotarod
1.2.3 Mô hình đo hoạt động ký
Mô hình Hoạt động ký được thực hiện theo phương pháp của Mill J và cộng
sự (2002) [3]
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích đánh giá tác dụng giải lo âu của thuốctrên chuột nhắt dựa trên hoạt động bình thường của chuột khi ở trong điều kiện tối và ít tiếng ồn
Mô hình gồm có một lồng kính hình hộp chữ nhật với kích thước 40 x 40 x
30 cm, bộ cảm biến di chuyển của chuột và thiết bị tự động ghi lại số lần các hoạt động của chuột Khi chuột trong môi trường tối và ít tiếng ồn chuột có xu hướng khám phá lồng được biểu hiện bằng các hoạt động di chuyển theo chiều ngang và hoạt động di chuyển lên cao theo chiều dọc Giảm số lần di chuyển theo chiều ngang và giảm số lần di chuyển theo chiều dọc thể hiện tác dụng an thần của thuốc
Cấu tạo máy đo Hoạt động ký: Gồm có 3 phần:
- Phần 1: Một lồng nhựa trong suốt hình hộp chữ nhật có kích thước 40x 40x
30 cm, nắp phía trên có lỗ thông khí và có thể mở ra để đưa chuột vào trong
- Phần 2: Bốn thanh cảm biến hoạt động của chuột được đặt song song ở 2 bên thành lồng Hai thanh song song phía dưới cảm biến hoạt động di chuyển theo chiều ngang của chuột, hai thanh ở phía trên cảm biến hoạt động lên xuống theo chiều dọc của chuột Cả 4 thanh này có thể di chuyển lên xuống để phù hợp với kích thước của từng loại động vật
- Phần 3: Thiết bị điện tử có màn hình hiển thị giúp tự động ghi lại và hiển thị
số lần di chuyển theo chiều ngang và số lần di chuyển theo chiều dọc của chuột
Lồng ghi được đặt trong môi trường ít ánh sáng, ít tiếng ồn và nhiệt độ phòng ổn định để giúp cho các con chuột có thể có hoạt động bình thường
Trang 7Hình 2.1 Mô hình máy đo hoạt động ký
Tiến hành nghiên cứu:
Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 15 con
Lô 1 (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g
Lô 2 (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg
Lô 3 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg (DTAT liều tương
đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12)
Lô 4 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg.(DTAT liều gấp 3
lâm sàng)
- Chuột được uống nước và thuốc thử tương ứng trong 6 ngày liên tiếp (chuột
uống thuốc khi đói).
- Số liệu được lấy vào các thời điểm trước khi uống thuốc, ngày thứ 6 sau khi uống thuốc 1h và sau uống thuốc 3h
- Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước khi tiến hành thử nghiệm
- Sau khi uống thuốc 1h và 3h, chuột được đặt nhẹ nhàng vào trong lồng hoạt động ký theo dõi trong 2 phút
- Khi chuột di chuyển thì sẽ được thiết bị điện tử ghi lại và sau khi hết 2 phút ta ghi lại số liệu ra giấy
- Sau mỗi thử nghiệm, lồng hoạt động ký được lau chùi sạch với cồn 70%
- Để đảm bảo thời gian tác dụng của thuốc, chia các lô chuột thành 2 lô nhỏ, cho uống thuốc cách nhau 1h
Chỉ số đánh giá:
- Số lần chuột di chuyển theo chiều ngang
Trang 8- Số lần chuột di chuyển theo chiều dọc.
Sơ đồ nghiên cứu tác dụng an thần trên mô hình Hoạt động ký
1.2.4 Mô hình đo sức bám.
Mô hình đo sức kéo của chuột được thực hiện theo phương pháp của Robert M.J Deacon [5]
Hình 1 Máy đo sức bám
Thời điểm
Ngày 6
Chu t độ ược u ng nố ước và thu c tố ương ng ứ
ng ứ
Ngày 6
Sau 1h
Trang 9Tiến hành nghiên cứu:
Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 15 con
Lô 1 (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g
Lô 2 (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg
Lô 3 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3 ml/kg (DTAT liều tương
đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12)
Lô 4 (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg
(DTAT liều gấp 3 lâm sàng)
- Chuột được uống nước và thuốc thử tương ứng trong 7 ngày liên tiếp.
- Số liệu được lấy vào các thời điểm ngày thứ 7 sau khi uống thuốc 1h và sau uống thuốc 3h
- Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước khi tiến hành thử nghiệm
- Sau khi uống thuốc 1h và 3h, chuột được đo sức bám trên máy
Chỉ số đánh giá:
- Sức bám thời điểm 1h và 3h
Hình 2.Sơ đồ nghiên cứu tác dụng của thuốc trên sức bám
1.3 Phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm bằng phần mềm Excel 2010
Số liệu được biểu diễn dưới dạng X±SD Kiểm định các giá trị trung bình bằng test T-Student
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05
Th i đi m ờ ể
Ngày 7
Chu t độ ược u ng nố ước và thu c tố ương ng ứ
ng ứ
Ngày 7
Sau 1h
Trang 102 KẾT QUẢ
2.1 Mô hình dấu cộng nâng cao
Bảng 1: Ảnh hưởng của cao đặc Dưỡng tâm an thần đến thời gian, số lần lưu lại nhánh mở, thời gian lưu lại nhánh đóng, và tỷ số né tránh nhánh mở
Lô
Thời gian lưu lại nhánh mở (giây)
Thời gian lưu lại nhánh đóng (giây)
Số lần vào nhánh mở
Tỷ lệ né tránh nhánh mở (%)
Lô 1 (Chứng sinh học) 53,1 ± 20,12 173,6 ± 38,75 2,3 ± 1,25 76,26 ± 8,47
Lô 2 (Diazepam liều
2,4g/kg)
115,3 ± 31,67 128,8 ± 40,25 8,7 ± 3,62 53,06 ± 11,36
p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,05 p < 0,001 p < 0,001
Lô 3 (Dưỡng tâm an
thần liều lâm sàng)
111,4 ± 42,3 106,9 ± 38,6 5,8 ± 2,49 50,97 ± 19,67
p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,01 p < 0,001 p < 0,01
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Lô 4 (Dưỡng tâm an
thần liều gấp 3 lâm
sàng)
123,4 ± 46,15 135,5 ± 36,03 4,1 ± 2,28 56,63 ± 12,17
p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,001
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p <0,01 p > 0,05
p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Kết quả bảng 1 cho thấy: Trên mô hình dấu cộng nâng cao chuột ở lô uống diazepam và các lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần cả 2 liều đều thể hiện tác dụng giải lo âu so với lô chứng sinh học một cách rõ rệt, kết quả được thể hiện: Tăng thời gian lưu lại nhánh mở, tăng số lần vào nhánh mở, giảm tỷ lệ né tránh nhánh mở, rút ngắn thời gian lưu lại nhánh đóng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với tất cả các chỉ số, các giá trị p <0,001; p<0,01 và p<0,05
Mức độ tác dụng giải lo âu của các lô dùng thuốc Dưỡng tâm an thần là tương đương nhau và tương đương với lô uống diazepam (p>0,05)
Trang 11của chuột trên trục quay Rotarod.
Lô
Thời gian bám của chuột (s) Thời điểm bắt đầu
nghiên cứu
Sau uống thuốc 1h
Sau uống thuốc 3h
Lô 1 (Chứng sinh học) 247,8 ± 70,3 251,3 ± 48,2 249,6 ± 70,8
Lô 2 (Diazepam liều 2,4g/kg) 238,0 ± 67,3 170,9 ± 50,0 219,6 ± 82,4
Lô 3 (Dưỡng tâm an thần
liều lâm sàng)
229,0 ± 95,2 178,5 ± 63,8 239,1 ± 62,6
Lô 4 (Dưỡng tâm an thần
liều gấp 3 lâm sàng)
232,9 ± 123,6 146,2 ± 94,0 244,3 ± 54,0
Nhận xét:
Kết quả bảng 1 cho thấy: Không có sự khác biệt giữa các lô về thời gian bám của chuột trên trục quay Rotarod ở thời điểm bắt đầu nghiên cứu
- Tại thời điểm 1h sau dùng thuốc, diazepam và các lô uống cao đặc Dưỡng tâm
an thần thể hiện tác dụng an thần qua việc giảm thời gian bám trên trục quay Rotarod của chuột nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p < 0,05) Tác dụng của 2 liều Dưỡng tâm an thần tương đương nhau và tương đương với diazepam (p>0,05)
- Tại thời điểm 3h, các lô uống diazepam và uống cao đặc Dưỡng tâm an thần không hiện tác dụng giảm thời gian bám của chuột nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p> 0,05)
2.3 Mô hình đo hoạt động ký
Bảng 3: Ảnh hưởng của cao đặc Dưỡng tâm an thần đến hoạt động
di chuyển theo chiều ngang của chuột
Trang 12Số lần di chuyển theo chiều ngang
Trước NC Sau uống thuốc
1h
Sau uống thuốc 3h
1 (Sinh học) 241,80 ± 40,93 247,40 ± 37,30 247,20 ± 33,99
2 (Diazepam liều 2,4g/kg) 245,20 ± 59,62 201,00 ± 47,40 196,53 ± 64,15
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
3 (Dưỡng tâm an thần liều
lâm sàng)
243,40 ± 44,72 209,10 ± 40,75 208,43 ± 40,18
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
4 (Dưỡng tâm an thần liều
gấp 3 lâm sàng)
246,40 ± 47,40 208,30 ± 41,16 202,21 ± 46,27
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Kết quả bảng 1 cho thấy: Trên mô hình Hoạt động ký, chuột ở lô uống diazepam và các lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần thể hiện tác dụng giải lo âu
so với lô chứng sinh học ở cả thời điểm 1h và 3h sau uống thuốc, kết quả được thể hiện: Giảm số lần chuột di chuyển theo chiều ngang có ý nghĩa thống kê (p<0,05).Mức độ tác dụng giải lo âu của 2 liều Dưỡng tâm an thần là tương đương nhau và tác dụng này tương đương với lô chuột uống diazepam (p> 0,05)
Bảng 4: Ảnh hưởng của cao đặc Dưỡng tâm an thần đến hoạt động di chuyển theo chiều dọc của chuột
Lô
Số lần di chuyển theo chiều dọc
Trước NC Sau uống thuốc Sau uống thuốc
Trang 132 (Diazepam liều 2,4g/kg) 18,87 ± 5,14 12,67 ± 3,81 13,53 ± 3,58
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
3 (Dưỡng tâm an thần liều lâm
sàng)
19,14 ± 4,69 16,00 ± 3,04 15,64 ± 3,61
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
4 (Dưỡng tâm an thần liều gấp
3 lâm sàng)
19,79 ± 6,99 14,93 ± 4,45 14,43 ± 4,20
p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05
p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Kết quả bảng 4 cho thấy: Trên mô hình Hoạt động ký, chuột ở lô uống diazepam và các lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần thể hiện tác dụng giải lo âu
so với lô chứng sinh học ở cả thời điểm 1h và 3h sau uống thuốc, kết quả được thể hiện: Giảm số lần chuột di chuyển theo chiều dọc có ý nghĩa thống kê (với p<0,05).Mức độ tác dụng giải lo âu của 2 liều Dưỡng tâm an thần tương đương nhau và tác dụng này tương đương với lô chuột uống diazepam (p > 0,05)
2.4 Mô hình đo sức bám:
Bảng 1: Ảnh hưởng của cao đặc Dưỡng tâm an thần đến sức bám của chuột
Sau uống thuốc 1h Sau uống thuốc 3h
Lô 1 (Chứng sinh học) 353,20 ± 60,85 352,13 ± 63,13
Lô 2 (Diazepam liều 2,4g/kg) 261,73 ± 62,64 286,20 ± 72,83
p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,05
Lô 3 (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) 226,93 ± 71,52 247,33 ± 63,06