Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng giống lúa phục vụ chọn tạo giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM *** NGUYỄN THÚY ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2019 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆ *** P VIỆT NAM NGUYỄN THÚY ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Khuất Hữu Trung TS Hoàng Hoa Long Hà Nội, 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn tận tình Thầy hƣớng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu thuộc Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nơng nghiệp Tồn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chƣa đƣợc sử dụng để công bố công trình nghiên cứu để nhận học vị Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thúy Điệp ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc luận án này, tơi nhận đƣợc hƣớng dẫn, quan tâm tận tình giúp đỡ thầy cô, bạn bè đồng nghiệp Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung TS Hoàng Hoa Long trực tiếp hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu thuộc Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nơng nghiệp nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thời gian cho tơi hồn thành luận án Đồng thời, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, đồng nghiệp bạn bè quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần cho thời gian làm luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thúy Điệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH xi Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu .3 Những đóng góp đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh bạc lúa 1.1.1 Lịch sử phát bệnh 1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lúa 1.1.3 Các chủng sinh lý giới Việt Nam 1.2 Tổng quan gen kháng chất gen kháng bệnh bạc 10 1.3 Chỉ thị phân tử vai trò thị phân tử chọn tạo giống trồng .18 1.3.1 Vai trò thị phân tử chọn tạo giống trồng 18 1.3.2 Các thị phân tử DNA dùng phổ biến lai tạo chọn giống 19 1.3.3 Phƣơng pháp chọn lọc nhờ hỗ trợ thị phân tử chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection - MAS) 22 1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc 26 1.4.1 Sàng lọc nguồn gen kháng bệnh bạc 26 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc giới 26 1.4.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc Việt Nam 29 1.5 Tổng quan gen chất lƣợng thị liên kết với gen chất lƣợng .33 1.6 Khuynh hƣớng nghiên cứu quy tụ nhiều gen vào giống lúa 39 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 iv 2.1 Vật liệu 41 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.2 Các loại hóa chất 43 2.1.3 Máy móc thiết bị sử dụng 44 2.2 Nội dung nghiên cứu 44 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 2.3.1 Phƣơng pháp xác định gen ứng viên liên quan kháng bệnh bạc 45 2.3.2 Phƣơng pháp thiết kế thị SSLP 46 2.3.4 Phƣơng pháp PCR 47 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá tính kháng/nhiễm bạc lây nhiễm nhân tạo 49 2.3.6.Thí nghiệm đồng ruộng 51 2.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 53 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Xác định gen kháng bệnh bạc thiết kế mồi nhận diện gen ứng viên kháng bệnh bạc 54 3.1.1 Xác định thiết kế mồi nhận diện gen ứng viên kháng bệnh bạc có giống lúa địa Việt Nam 54 3.1.1.1 Xác định thiết kế mồi nhận diện gen ứng viên xa5 54 3.1.1.2 Xác định thiết kế mồi nhận diện gen ứng viên xa13 60 3.1.2 Xác định gen kháng bệnh bạc có nguồn vật liệu thu thập nhờ sử dụng thị liên kết 64 3.1.2.1 Kiểm tra gen ứng viên xa5 xa13 dòng/giống thu thập nhờ sử dụng cặp mồi thiết kế 64 3.1.2.2 Kiểm tra gen/gen ứng viên Xa4, Xa7 Xa21 dòng/giống bố mẹ 65 3.2 Đánh giá khả kháng/nhiễm bệnh bạc nguồn vật liệu .69 3.3 Tạo nguồn vật liệu mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 72 3.3.1 Xác định lai hệ BC1F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 73 v 3.3.2 Xác định lai hệ BC2F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 78 3.3.3 Xác định lai hệ BC3F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 82 3.3.4 Xác định cá thể BC3F2 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc gen chất lƣợng (Waxy, BADH2) 86 3.4.1 Đánh giá số đặc điểm nơng sinh học khả kháng bệnh bạc (lây nhiễm nhân tạo) dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc có di truyền giống An dân 11 99 3.4.2 Đánh giá số đặc điểm nơng sinh học khả kháng bệnh bạc (lây nhiễm nhân tạo) dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc có di truyền giống DT39 104 3.4.3 Đánh giá số đặc điểm nơng sinh học khả kháng bệnh bạc (lây nhiễm nhân tạo) dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc có di truyền giống Thủ Đô 111 3.4.4 Đánh giá số đặc điểm nông sinh học khả kháng bệnh bạc (lây nhiễm nhân tạo) dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh bạc có di truyền giống Bắc thơm số 115 3.4.5 Chọn tạo dòng/giống lúa triển vọng 120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 Kết luận 128 Đề nghị 128 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI KHUẨN 149 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIỂM TRA GEN/GEN ỨNG VIÊN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ 150 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU IRRISTAT .164 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AC AFLP BADH2 BC CAPs CTAB Cs CSDL dCAPs DNA ddNTPs EDTA EtBr InDels IRRI MABC MAS NCBI A A P B d B C P C B - - D P D D T E A E I I I M b M N B vii NILs NST PCR PSA Near-isog SDS SNPs Sodium D Single nu polymorp Single Se Polymorp Simple se SSLP SSR STMS STS TAE TE RFLP Xoo - Polymera Potato sem medium Sequence microsate Sequence Tris-Aceti Tris-EDTA Restrictio Polymorp Xanthomo Oryzae viii DANH MỤC BẢNG TT bảng 1.1 1.2 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 Tên bảng Tổng hợp gen kháng đƣợc xác định c Các giống lúa mang gen kháng bệnh bạc đƣ hỗ trợ thị phân tử (MAS) thƣơng Danh sách 36 giống lúa địa giải trình tự Nguồn gốc số dòng/giống lúa ƣu tú sử cứu Danh sách trình tự mồi sử dụng nghi Thang điểm đánh giá cấp bệnh bạc theo phƣơ 2014 Thống kê số lƣợng tỉ lệ nucleotit vùng C 3.7 3.8 Sequence) gen ứng viên xa5 số giốn tƣơng đồng với gen tham chiếu xa5 công b Thống kê số lƣợng tỉ lệ (%) axit amin vùng viên xa5 số giống lúa có trình tự tƣơng chiếu xa5 cơng bố Thống kê số lƣợng nucleotit vùng CDS Sequence) gen ứng viên xa13 số giố tƣơng đồng với gen tham chiếu xa13 công Thống kê số lƣợng tỉ lệ (%) axit amin vùng viên xa13 số giống lúa có trình tự tƣơng chiếu xa13 cơng bố Bảng tổng hợp dòng/giống mang gen ứng Đánh giá khả kháng/nhiễm dòng/ cứu lây nhiễm nhân tạo (vụ Xuân 2014- T Danh sách tổ hợp lai thiết kế Thống kê kết xác định gen/gen ứng viê 3.9 chọn lọc cá thể BC1F1, tạo BC2F1 (v Tựu, Hà Nội) Thống kê kết xác định gen/gen ứng viê 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 152 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5, Xa7, xa13 cá thể BC1F1 tổ hợp lai An Dân 11*2/Hom râu B7.15-B7.24: Con lai BC1F1; B/U30: giống Hom râu, M/M45: giống An dân 11, (-): giống IR24 (đối chứng âm),(+): giống IRBB5, IRBB7 IRBB13 (đối chứng dương); O'RangeRuler 20bp DNA Ladder 100bp DNA Ladder 153 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4, Xa7, Xa21 cá thể BC1F1 tổ hợp lai Thủ Đô 1*2/IRBB62 T4.1-T4.24: cá thể BC1F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder, M100: 100bp DNA Ladder ; B: giống IRBB62; M: giống Thủ Đô 1; (-): giống IR24 (đối chứng âm) 154 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4, xa5 cá thể BC2F1 tổ hợp lai Thủ đô 1*3/Chấn thơm R5.1-R5.44: cá thể BC2F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder, B: giống Chấn thơm, M: giống Thủ đô 1; (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB5, IRBB4 (đối chứng dương) Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4+Xa7 cá thể BC2F1 tổ hợp lai DT39*3/Chấn thơm B1.25-B1.38: cá thể BC2F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder; B: giống Chấn thơm, M: giống DT39; (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB4, IRBB7 (đối chứng dương) 155 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5, Xa7, xa13 cá thể BC2F1 tổ hợp lai An Dân 11*3/Hom râu B7.1-B7.45: cá thể BC2F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladde; B: giống Hom râu, M: giống An dân 11, (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB5, IRBB7, IRBB13 (đối chứng dương) 156 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4, Xa7, Xa21 cá thể BC2F1 tổ hợp lai Bắc thơm số 7*3/IRBB62 B6.1-B6.24: cá thể BC2F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder; M100: 100bp DNA Ladder; B: giống IRBB62; M: giống Bắc thơm số 7; (-): giống IR24 (đối chứng âm) 157 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen/ gen ứng viên Xa4, xa5 cá thể BC3F1 tổ hợp lai Thủ đô 1*4/Chấn thơm R5.1-R1.24: cá thể BC3F1; M20: marker 50 bp, B: giống Chấn thơm, M: giống Thủ đô 1, (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB5 (đối chứng dương xa5) giống IRBB4 (đối chứng dương Xa4) Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4+xa5 cá thể BC3F1 tổ hợp lai DT39*4/Chấn thơm B1.1-B1.24: cá thể BC3F1; M20: marker 20 bp, B: giống Chấn thơm, M: giống DT39, (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB5 (đối chứng dương xa5) giống IRBB4 (đối chứng dương Xa4) 158 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4+Xa7 cá thể BC3F1 tổ hợp lai DT39*4/Chấn thơm B1.25-B1.38: Các lai BC3F1; M20: marker 20 bp, B: giống Chấn thơm, M: giống DT39, (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB4 (đối chứng dương Xa4) giống IRBB7 (đối chứng dương Xa7) 159 97300bpbp 179 bp Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4, Xa7, Xa21 cá thể BC3F1 tổ hợp lai Thủ Đô 1*4/IRBB62 T4.1-T4.24: cá thể BC3F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder, M100: 100bp DNA Ladder ; B: giống IRBB62; M: giống Thủ Đô 1; (-): giống IR24 (đối chứng âm) 160 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4, Xa7, Xa21 cá thể BC3F1 tổ hợp lai Bắc thơm số 7*4/IRBB62 B6.1-B6.24: cá thể BC3F1; M20: O'RangeRuler 20bp DNA Ladder; M100: 100bp DNA Ladder ; B: giống IRBB62; M: giống Bắc thơm số 7; (-): giống IR24 (đối chứng âm 161 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4+xa5 cá thể BC3F2 tổ hợp lai DT39/Chấn thơm B1.1-B1.22, B1.63-B1.82: cá thể BC3F2; M20: marker 20 bp, B: giống Chấn thơm, M: giống DT39, (-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB5 (đối chứng dương xa5) giống IRBB4 (đối chứng dương Xa4) 162 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4+Xa7 cá thể BC3F2 tổ hợp lai DT39/Chấn thơm B1.1-B1.22, B1.63-B1.82: cá thể BC3F2; M20: marker 20 bp, B: giống Chấn thơm, M: giống DT39,(-): giống IR24 (đối chứng âm), (+): giống IRBB4 (đối chứng dương Xa4) giống IRBB7 (đối chứng dương Xa7) 163 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5, Xa7, xa13 cá thể BC3F2 tổ hợp lai An Dân 11/Hom râu B7.1-B7.50: cá thể BC3F2; M20: marker 50 bp, B: giống Hom râu, M: giống An dân 11, (-): giống IR24 (đối chứng âm),(+): giống IRBB5, IRBB7, IRBB13 (đối chứng dương) 164 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU IRRISTAT Dòng AD2 EANS FOR EFFECT CT$ - CT$ An dân 11 AD2/1 AD2/2 AD2/3 SE(N= 5%LSD 3) 6DF CT$ An dân 11 AD2/1 AD2/2 AD2/3 SE(N= 5%LSD 3) 6DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Dòng DT39 MEANS FOR EFFECT CT$ - CT$ DT39 DT39/1 DT39/2 DT39/3 DT39/4 DT39/5 DT39/6 NOS SE(N= 5%LSD 3) 12DF CT$ DT39 DT39/1 DT39/2 DT39/3 DT39/4 DT39/5 DT39/6 SE(N= 5%LSD 3) 12DF 165 - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DT39 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Dòng BT6 MEANS FOR EFFECT CT$ - CT$ BT BT6-1 BT6-2 BT6-3 SE(N= 5%LSD 3) 6DF CT$ BT BT6-1 BT6-2 BT6-3 SE(N= 5%LSD 3) 6DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 166 Dòng TĐ4 TĐ13 MEANS FOR EFFECT CT$ - CT$ Th? dô (Ð/ TÐ4-1 TÐ4-2 TÐ4-3 TÐ13/1 SE(N= 5%LSD 3) 8DF CT$ Th? dô (Ð/ TÐ4-1 TÐ4-2 TÐ4-3 TÐ13/1 SE(N= 5%LSD 3) 8DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - ... thực nghiên cứu đề tài Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc vào số dòng/ giống lúa phục vụ chọn tạo giống nhằm sử dụng thị phân tử kết hợp với lai trở lại để nhanh chóng đƣa gen/ gen ứng viên kháng. .. thị phân tử nhằm tích hợp nhiều gen kháng vào dòng/ giống lúa ƣu tú, phục vụ lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc cơng tác nghiên cứu tính kháng; - Tạo 10 nguồn vật liệu mang 2-3 gen/ gen ứng viên (Xa4+xa5/... gen/ gen viên kháng bệnh bạc (Xa4, xa5, Xa7, xa13 Xa21) vào số dòng/ giống lúa ƣu tú, tạo đƣợc nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc phục vụ công tác chọn tạo giống lúa; Tạo dòng triển vọng