Mục đích cơ bản của luận án này là ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào một số dòng/giống lúa ưu tú, tạo được các nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa; Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng được nhu cầu của sản xuất.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-*** -
NGUYỄN THÚY ĐIỆP
NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ CHỌN TẠO
Trang 2Công trình hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Khuất Hữu Trung
2 TS Hoàng Hoa Long
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Trang 3
MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh bạc lá gây ra bởi Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) là một
trong những bệnh nghiêm trọng nhất ở lúa, gây thiệt hại đến năng suất của nhiều giống lúa trên khắp thế giới Bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa Mức độ nhiễm bệnh cũng như những ảnh hưởng về năng suất tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây, độ mẫm cảm với mầm bệnh và các yếu tố môi trường Bệnh bạc lá lúa được ghi nhận đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 và cho đến nay bệnh đã thành dịch hại ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là các nước trồng lúa
ở Châu Á Bệnh bạc lá lúa có nguy cơ gây hại cả ở vụ xuân và vụ mùa Hiện nay, việc sử dụng các chất hóa học để kiểm soát bệnh bạc lá vẫn chưa
có hiệu quả, gây ô nhiễm môi trường, sức khỏe con người và chất lượng nông sản (Khuất Hữu Trung và cs, 2015) Người ta nhận thấy rằng việc tăng cường tính kháng di truyền là phương pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh bạc lá lúa Do đó, việc phát triển các dòng/giống lúa mang gen kháng bệnh thông qua các ứng dụng chọn giống phân tử kết hợp với phương pháp chọn giống truyền thống hiện đang là một trong những chiến lược quan trọng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa
Ngày nay, nhờ công cụ giải mã hệ gen thế hệ mới, việc giải mã một
hệ gen hoàn chỉnh chỉ trong vài ngày cho phép xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen để khai thác một cách hiệu quả các nguồn gen, đặc biệt các nguồn gen lúa hoang dại và lúa bản địa Với sự phát triển mạnh mẽ của tin sinh học, việc phân tích hệ gen, sàng lọc, phát hiện các gen/QTL kháng ngày càng nhiều và nhanh chóng Tính đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra được 43 gen kháng bệnh bạc lá ở cây lúa trồng và lúa hoang dại, trong đó có 27 gen
trội và 16 gen lặn (Yogesh et al, 2017; Suk, 2018) Trong số 43 gen đã
được tìm thấy thì có 15 gen đã được phân lập, lập bản đồ vật lý và 6 gen
kháng đã được tách dòng, nhân bản và giải trình tự (Basabdatta et al., 2014; Mueen et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al., 2017; Suk,
2018) Các gen kháng này hoạt động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn
gen chính để cải tiến di truyền ở các giống lúa kháng với Xanthomonas
Mức độ biểu hiện tính kháng của các gen rất khác nhau và biểu hiện ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây lúa, những gen chính kháng theo cơ chế hoàn toàn, những gen phụ kháng theo từng phần và được kiểm soát bởi QTL/gen (Khuất Hữu Trung và cs, 2015)
Tuy nhiên, với sự phát triển của các chủng Xanthomonas mới và sự
biến đổi đa dạng quần thể bệnh đã làm phá vỡ tính kháng của nhiều giống
lúa (Yogesh et al, 2017) Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, khuynh
hướng quy tụ nhiều gen vào một giống đã được áp dụng và mang lại hiệu quả đáng kể Mặt khác, mỗi gen chính thường chỉ kháng được với một
Trang 4chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được dòng lúa kháng được nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại, cải thiện tính kháng ngang
đa gen với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp chọn lọc các cá thể mang các tính trạng mong muốn với độ tin cậy cao, có thể chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầu của cá thể, phân biệt được kiểu gen dị hợp tử, chọn lọc được các alen lặn và giúp quy tụ được nhiều gen vào cùng một giống, giúp đẩy nhanh sự phát triển các dòng trong chương trình chọn tạo giống
(Guvvala et al, 2013; Pradhan et al, 2015)
Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu
đề tài “Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống” nhằm sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lai
trở lại để nhanh chóng đưa các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá vào các giống lúa ưu tú, phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất
2 Mục tiêu nghiên cứu
- Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các
gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào
một số dòng/giống lúa ưu tú, tạo được các nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa;
- Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng được nhu cầu của sản xuất
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học:
- Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin về phân tích hệ gen lúa bản địa và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá;
- Kết quả của đề tài góp phần quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu là các dòng/giống mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá phục
vụ cho công tác nghiên cứu tính kháng và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
* Ý nghĩa thực tiễn:
- Tạo được 2-3 nguồn vật liệu có khả năng bệnh kháng bệnh bạc lá
có nền di truyền là các giống lúa ưu tú;
Trang 5- Tạo ra được 1-2 dòng triển vọng trong khảo nghiệm có năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá, có khả năng phát triển trong sản xuất
4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu
- Các dòng/giống lúa ưu tú đang được trồng phổ biến ở phía Bắc Việt Nam, các giống lúa bản địa, các dòng NIL mang gen kháng bạc lá nhập nội từ IRRI;
- Cơ sở dữ liệu genome của 36 giống lúa bản địa của Việt Nam và các chỉ thị phân tử có liên quan ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống
* Phạm vi nghiên cứu
đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định được các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá, từ đó thiết kế chỉ thị chức năng để nhận biết các gen mục tiêu, phục vụ cho nghiên cứu tính kháng và công tác chọn tạo giống lúa;
- Đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại
để tích hợp nhiều gen kháng bệnh bạc lá vào cùng một giống lúa, nhằm tạo
ra nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 đến năm 2017
5 Những đóng góp mới của đề tài
- Lần đầu tiên ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định được các gen
ứng viên xa5 và xa13, từ đó thiết kế các chỉ thị chức năng và ứng dụng chỉ
thị phân tử nhằm tích hợp nhiều gen kháng vào các dòng/giống lúa ưu tú, phục vụ lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá và công tác nghiên cứu tính kháng;
-Tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2-3 gen/gen ứng viên
(Xa4+xa5/Xa4+Xa7/xa5+Xa7/ xa5+xa13/ xa5+Xa7+xa13 - có nguồn gốc
từ dòng NIL của IRRI) hoặc 2-3 gen ứng viên (Xa4+Xa7/ Xa4+Xa21/Xa7+Xa21/Xa4+Xa7+Xa21 - có nguồn gốc từ các giống lúa bản
địa) có khả năng kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá;
- Tạo ra 01 dòng triển vọng (KTDT18) có năng suất, chất lượng,
mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5 (có nguồn gốc từ giống lúa bản địa), có khả
năng kháng bệnh bạc lá, để phát triển phục vụ cho sản xuất
6 Cấu trúc của luận án
Luận án được trình bày gồm 147 trang (không kể phụ lục), 40 bảng
và 37 hình Luân án gồm 3 chương: Mở đầu gồm 4 trang; Chương 1 - Tổng quan tài liệu 37 trang; Chương 2- Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 12 trang; Chương 3- Kết quả và thảo luận 74 trang; Kết luận và đề nghị 2
Trang 6trang Luận án sử dụng 154 tài liệu tham khảo, trong đó gồm 29 tài liệu tiếng Việt, 114 tài liệu tiếng Anh và 11 trang web (20 trang)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa
bị nhiễm bệnh và trong đất, nhưng chúng chưa được chứng minh là nguồn quan trọng trong việc lây nhiễm mầm bệnh Ở những vùng nhiệt đới, vi khuẩn cũng có thể tồn tại trong nước tưới (Trích theo Pranamika Sharma
và cộng sự, 2017)
1.1.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseudomonadaceae, bộ Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria) Trong hệ thống phân loại, Xanthomonas bao gồm 3 loài là X Oryzae pv oryzae, X Axonopodis pv citri, và X Campestris pv campestris Hệ gen của Xanthomonas oryzae pv oryzae (gọi tắt là Xoo) có chiều dài xấp xỉ 5
triệu bp (4.940.217 bp), trong đó thành phần G+C chiếm 63.72% và vùng
mã hoá protein chiếm tới 84.12% (Ochiai et al., 2005) Về đặc tính gây
bệnh của vi khuẩn, các nghiên cứu chỉ ra rằng có 3 nhóm gen đó là: nhóm
hrp, avr và hrpX
1.1.3 Các chủng sinh lý trên thế giới và ở Việt Nam
Chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú Tác giả Phan Hữu Tôn (2004) khi nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh
miền Bắc đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở
một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương Trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định (Phan Hữu Tôn, 2004) Tác giả Lưu Văn Quyết (1999) đã xác định có 7 nhóm nòi dựa trên phản ứng của các isolate được thu thập với bộ giống chuẩn nòi quốc tế bao gồm nhóm I đến nhóm VII Bùi Trọng Thủy và Phan Hữu Tôn (2003) cũng
đã phân lập 64 isolate thành 10 chủng khác nhau Tác giả Bùi Trọng Thủy
và cộng sự đã xác định được 12 nhóm nòi vi khuẩn X.oryzae có mặt ở miền
Bắc Việt Nam đồng thời xây dựng được bảng chuẩn thể hiện phổ phản ứng kháng, nhiễm của 12 dòng đẳng gen với 12 nòi đó (Bùi Trọng Thủy và cs, 2007) Tiếp đến, một số nhà khoa học đã phân lập được 41 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và phân vào 6 nhóm
Trang 7nòi; qua lây nhiễm nhân tạo đã xác định được gen xa5 kháng hiệu quả với nòi B, C, E và F, gen xa13 kháng hiệu quả với nòi A, gen Xa21 kháng hiệu quả với nòi A, C, D và F (Dinh D.H et al, 2008) Tác giả Nguyễn Văn Viết
và cs đã xác định được 13 nhóm chủng sinh lý của vi khuẩn gây bạc lá hiện diện ở các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam (Nguyễn Văn Viết và cs.,
2008) Sau đó, khoảng 84 chủng Xoo đã được chọn lọc, phân lập ở các tỉnh miền bắc và được phân loại vào 4 nhóm nòi G1, G2, G3 và G4 (Furuya et al., 2012) Năm 2016, Lưu Văn Quyết và cộng sự đã xác định được các
isolate này thuộc 3 nhóm nòi, đó là: nhóm nòi I (Nam Định), nhóm nòi II (Bắc Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hải Dương, Nghệ An) và nhóm nòi III (Hải Dương, Thanh Hóa) Trong đó nhóm II có độc tính mạnh và phổ xuất hiện rộng hơn nhóm I và III (Lưu Văn Quyết và cs, 2016) Năm 2018, một nhóm nghiên cứu đã tiến hành lây nhiễm 37 giống lúa bản địa của Việt Nam với 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá thu thập ở các tỉnh phía bắc,
đã xác định được các giống có gen Xa4 kháng với 6/10 chủng lây nhiễm, các giống có gen xa5 kháng với 9/10 chủng lây nhiễm và các giống có gen Xa7 kháng với 8/10 chủng lây nhiễm, các giống này có phản ứng kháng
tương tự như các dòng IRBB4, IRBB5 và IRBB7 tương ứng của IRRI
lặn Các gen kháng được xác định nằm rải rác trên các NST khác nhau (trừ
NST số 9 và 10) Một số gen chưa xác định được vị trí, đó là: xa15, Xa16, Xa17, Xa18, xa19, xa20, xa26(t), xa28(t), Xa34(t), Xa36(t), Xa38 và Xa41(t) 15 gen đã được phân lập và lập bản đồ vật lý Các gen kháng này
hoạt động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn gen chính để cải tiến di
truyền ở các giống lúa kháng với Xanthomonas (Basabdatta et al., 2014) 6 gen kháng đã được tách dòng, nhân bản và giải trình tự (Mueen et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al., 2017; Suk, 2018)
Gen trội Xa4 được sử dụng rộng rãi trong chương trình chọn giống lúa kháng bạc lá ở Châu Á, Xa4 lại hiệu quả với những giống lúa thơm Gen xa5 là gen lặn mà có khả năng kháng đặc hiệu với nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá, kháng ở tất cả các giai đoạn Ở alen kháng xa5 có
sự thay thế 2 bp ở exon thứ 2 dẫn đến sự thay đổi trình tự axít amin từ valine thành glutamiate ở vị trí 39, vì vậy gây rối loạn chức năng của các
yếu tố phiên mã và tăng cường tính kháng với Xanthomonas ở tất cả các giống có gen xa5 ở trạng thái đồng hợp (Iyer và McCouch, 2004) Xa7 là
Trang 8gen kháng đồng trội, kháng trực tiếp với các chủng Xoo và kết hợp cùng với gen xa5 tăng hiệu lực, kháng cao với chủng Z-173 ở Trung Quốc (Wang et al 2005), gen kháng ở giai đoạn ra trỗ Gen Xa7 kháng hiệu quả
với nhiều giống lúa nhưng lại không hiệu quả với những giống lúa thơm
Gen xa13 là gen lặn hoàn toàn, chỉ kháng ở trạng thái đồng hợp Gen xa13 tương tác mạnh với các gen kháng khác như xa5, Xa4 và Xa21 (Chu et al., 2004) Gen Xa21 có phổ kháng rộng và đã được sử dụng nhiều nhất trong chương trình nhân giống lúa, Xa21 tăng cường tính kháng từ giai đoạn mạ đến giai đoạn trưởng thành Xa21 là kiểu gen chứa các thụ thể kinase lặp lại giàu leucine và có phổ kháng rộng, kháng được nhiều chủng Xoo so với các gen kháng khác Các gen Xa4 và xa5, xa13 và Xa23 kháng ở mọi giai đoạn phát triển của cây lúa (Yogesh et al., 2017)
Bản chất của gen kháng, sự tương tác giữa gen kháng và cây lúa, các nhân tố ảnh hưởng đến chức năng của gen kháng và cơ chế điều hòa của gen kháng là cơ sở rất quan trọng để xác định việc quy tụ nhóm gen kháng tương tác hiệu quả và bền vững Việc phân loại gen kháng phổ rộng - hẹp, phân loại kháng theo các giai đoạn phát triển của cây lúa và bản chất gen - protein và cơ chế kháng cùng với việc phân loại nền di truyền của giống cho/nhận là vô cùng quan trọng để định hướng, chọn lọc dòng cho gen, dòng nhận gen với nền di truyền phù hợp tạo các dòng đẳng gen ưu tú và từ
đó tích hợp lại để tạo giống siêu kháng bệnh bạc lá
1.3 Chỉ thị phân tử và vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng
1.3.1 Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng
Chỉ thị phân tử hay chỉ thị di truyền là các dấu hiệu hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể dựa trên sự khác biệt về trình tự gene của mỗi sinh vật Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát Trong những năm gần đây, với sự gia tăng về dữ liệu trình
tự hệ gen, các đa hình đơn nucleotit (SNP) và sự đa dạng trong cấu trúc hệ gen đã được dùng để phát triển những chỉ thị có độ tin cậy cao Sự phát triển của những chỉ thị với mật độ dày đặc cũng như việc xác định trình tự nucleotit của cả hệ gen của nhiều cây có quan hệ họ hàng gần gũi cho phép
so sánh những chỉ thị, so sánh hệ gen, và sự phân bố của những chỉ thị này trong khắp hệ gen (Ranade và Yadav 2014)
1.32 Các chỉ thị phân tử DNA dùng phổ biến trong lai tạo và chọn giống
Hiện nay với sự phát triển của sinh học hiện đại đã có rất nhiều chỉ thị phân tử được nghiên cứu và sử dụng là công cụ đắc lực cho phân tích di
truyền và cải tiến cây trồng, đó là chỉ thị SSR (trình tự lặp đơn giản), SNP
(đa hình nucleotit đơn), CAPS (trình tự đa hình khuếch đại bị cắt) và
Trang 9dCAPS (derived CAPS), SSLP (kỹ thuật đa hình độ dài các chuỗi đơn
và đáng tin cậy hơn chọn lọc kiểu hình, có thể rút ngắn được thời gian, công sức so với phương pháp chọn giống truyền thống MAS cho phép chọn lọc các tính trạng phức hợp mà phương pháp chọn giống truyền thống không giải quyết được Tuy nhiên, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống bằng MAS vẫn bị hạn chế do tác động của phân
ly tái tổ hợp, chỉ thị phân tử và gen không còn liên kết với nhau trên một nhiễm sắc thể Khi đó việc chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả không chính xác Để loại bỏ tác động của hoạt động phân ly tái tổ hợp, có thể sử dụng các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trên gen kháng, khi
đó sự biểu hiện của chỉ thị có thể đảm bảo sự có mặt của gen kháng trong
cá thể Ngoài ra có thể sử dụng kết hợp 2 chỉ thị nằm ở hai phía của gen kháng trong quá trình chọn lọc Sự có mặt của hai chỉ thị này trong cùng một cá thể sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc Chính vì vậy, việc phân tích genom, xác định chính xác vị trí, trình tự gen để thiết kế các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trong hoặc ngay 2 đầu gen đích có thể loại
bỏ tác động của sự phân ly tái tổ hợp, làm tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc
cá thể mang gen kháng phục vụ công tác lai tạo giống (Miah et al., 2013)
Ở đây, chúng tôi đã lựa chọn phương thức lai chọn lọc với chỉ thị phân tử trong phép lai trở lại để ứng dụng trong lai tạo Đặc biệt, phương thức này rất có ưu thế trong việc tích hợp nhiều gen kháng vào một giống lúa do tính chính xác, nhanh chóng và độc lập đối với kiểu gen
1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá
1.4.1 Sàng lọc nguồn gen kháng bệnh bạc lá
Sàng lọc nguồn gen là một trong những khâu rất quan trọng và hữu ích trong các chương trình chọn tạo giống lúa Cho đến nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện các gen kháng về cả định lượng và định tính đã đặt nền tảng cho những nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá
1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới
Với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, nhiều giống lúa cải tiến mang nhiều gen kháng bệnh nói chung và bạc lá nói riêng đã và
Trang 10đang được chọn tạo Tính đến này, khu vực Châu Á đã có hơn 10 giống lúa kháng bệnh bạc lá đã được phát triển và thương mại hóa Các giống này
đều được chọn tạo nhờ sử hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) (Valérie et al., 2011; Ali et al., 2014; Mueen et al., 2014)
1.4.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các nhà chọn giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá ở lúa, nhưng kết quả chưa cao, các dòng/giống mang gen kháng chưa ổn định hoặc chưa kháng được phổ rộng Mười năm trở lại đây, với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, các nhà nghiên cứu của Việt Nam đã bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống và tạo ra nhiều dòng triển vọng Các dòng triển vọng hiện đang được trồng khảo nghiệm ở một số vùng thuộc đồng bằng sông Hồng để đánh giá khả năng kháng thực tế trong điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, thực tế cho thấy, việc sử dụng các dòng NILs của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) làm dòng cho QTL/gen kháng có hiệu quả chưa cao do các chủng nòi sinh thái ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú Mặt khác, hiệu lực của các gen kháng bạc lá đối với các nòi vi khuẩn bạc lá phân lập ở các vùng khác nhau là không giống nhau - một gen có thể kháng với nòi bạc lá ở vùng này nhưng lại nhiễm với nòi ở vùng khác Chính vì vậy, hiện nay việc sử dụng và khai thác nguồn gen kháng bản địa đang được chú trọng và là giải pháp hữu hiệu trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bền vững với bệnh bạc lá
1.5 Tổng quan về gen chất lượng và chỉ thị liên kết với gen chất lượng
Trong các giống lúa chất lượng, tính trạng hương thơm và hàm lượng amyloza được đánh giá là một trong những tính trạng quan trọng về
chất lượng Gen Waxy là gen mã hóa cho sự tổng hợp amyloza ở lúa Hương thơm của lúa liên quan đến gen BADH2 hay frg Đã có rất nhiều chỉ thị
được thiết kế để nhận biết 2 gen đích này, trong đó phải kể đến là chỉ thị
ESP, IFAP, INSP và M-Wx để nhận biết gen BADH2 (gen thơm fgr) và Waxy tương ứng Tại Việt Nam, những nghiên cứu về giống lúa chất lượng
chủ yếu mới dừng lại ở mức nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa Có rất ít các nghiên cứu chuyên sâu về sự di truyền liên quan đến tính trạng hương thơm cũng như các tính trạng chất lượng khác
1.6 Khuynh hướng nghiên cứu quy tụ nhiều gen vào 1 giống lúa
Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp lai trở lại qua 5 - 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến thế hệ tiếp theo Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được một dòng lúa kháng được nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại
Trang 11Mặt khác, việc tích hợp đơn gen vào một giống thường dẫn đến tính kháng
không ổn định, nhanh chóng bị mất đi trong một thời gian ngắn Vì vậy
muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa
một vài gen kháng hiệu quả cao vào genom đích Việc ứng dụng chỉ thị
phân tử trong chọn tạo giống đang ngày càng trở nên phổ biến để việc tạo
ra các giống lúa mang đồng thời nhiều gen qui định nhiều tính trạng, sẽ cải
thiện đáng kể đến hiệu quả sản xuất lúa trong nhiều năm tới
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu
- 36 giống lúa bản địa đã được giải trình tự hệ gen do Trung tâm tài
Nguyên thực vật cung cấp và cơ sở dữ liệu hệ gen của từng giống do Viện
Di truyền Nông nghiệp cung cấp
- Các dòng/giống lúa ưu tú (An dân 11, Bắc thơm số 7, Bắc thơm kháng
bạc lá, BC15, BQ, DT39, Hương cốm, Khang dân 28, NPT3, QJ4, QP5,
Thiên ưu, Thủ đô 1 và RVT) thu thập ở Trung tâm Tài nguyên Thực vật,
các Viện, Trường, các cơ sở nghiên cứu chọn tạo giống lúa:
- Các dòng cận đẳng gen và đối chứng chuẩn nhiễm (Taichung Native 1
(TN1) và IR24) của Viện Nghiên cứu lúa quốc tế: IRRI (IRBB1 (xa1),
IRBB2 (Xa1, Xa2), IRBB3 (Xa3), IRBB4 (Xa4), IRBB5 (xa5), IRBB7
(Xa7), IRBB10 (Xa10), IRBB11 (Xa11), IRBB13 (xa13), IRBB21 (Xa21),
IRBB50 (Xa4+xa5), IRBB61 (Xa4+xa5+Xa7), IRBB62 (Xa4+Xa7+Xa21)
và IRBB63 (xa5+Xa7+xa13)
- Các isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá được thu thập và phân lập ở vụ mùa
2013 tại 2 tỉnh Nam Định và Hòa Bình, do TS Hoàng Hoa Long (bộ môn
Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp) cung cấp
- Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu: 5 trình tự mồi nhận biết
gen/gen kháng bệnh bạc lá (2/5 mồi tự thiết kế) và 2 trình tự mồi nhận biết
gen chất lượng (thơm và hàm lượng amyloza)
2.1.2.Các loại hóa chất
2.1.3.Máy móc thiết bị sử dụng
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định gen kháng bạc lá, thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên
kháng bạc lá;
- Đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh bạc lá của các nguồn vật liệu;
- Tạo nguồn vật liệu mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá;
- Chọn lọc và đánh giá các vật liệu mang đa gen/gen ứng viên kháng bạc lá
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 12- Phương pháp xác định các gen ứng viên liên quan kháng bạc lá;
IRRI-2014 (đối với các dòng khảo nghiệm-trong điều kiện nhà lưới);
- Phương pháp lai trở lại và chọn lọc các dòng mang gen kháng ở các thế
hệ theo mô hình của Huang (Huang et al., 2012);
- Bố trí thí nghiệm đồng ruộng theo phương pháp của Nguyễn Thị Lan (2006);
- Các chỉ tiêu theo dõi, phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học được
áp dụng theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác
và giá trị sử dụng giống lúa (QCVN 01-55:2011/BNN&PTNT) và IRRI, 1996;
- Thí nghiệm khảo nghiệm sơ bộ thực hiện theo “Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng của giống lúa” (QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT);
- Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng các phần mềm chuyên dụng:Excel
2010, IRRISTAT v5.0; các trình tự được sắp xếp và thiết lập trình duyệt bằng phần mềm: NextGENE v.2.3.4, ClustalW2, GSNAP, MEGA v.6.0; Thiết kế mồi bằng phần mềm Vector NTI v.11, Primer 3
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định gen kháng bạc lá và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bạc lá
3.1.1 Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bạc lá
có trong các giống lúa bản địa của Việt Nam
- Kết quả tầm soát trình tự vùng CDS và thành phần axit amin của
gen ứng viên xa5 và so sánh với locus gen kháng bạc lá xa5 với mã hiệu là LOC_Os05g01710 đã thu nhận được 33 giống có số lượng nucleotit và thành phần axit amin vùng CDS đúng bằng với số lượng nucleotit của gen kháng bạc lá xa5 đã công bố (321 nucleotit và 106 axit amin) Kết quả tầm soát và so sánh trình tự locus xa5 cho thấy: tần số xuất hiện các đa hình
đơn nucleotit (SNP) và các đoạn thêm, bớt (InDels) giữa các giống khá cao Đặc biệt, có một đoạn trình tự mất đi 35 nucleotit đã được tìm thấy ở một số giống bản địa của Việt Nam không giống như gen kháng bệnh bạc
lá xa5 đã được công bố Dựa vào sự sai khác về trình tự đoạn gen kháng
Trang 13bệnh bạc lá giữa các giống lúa, cặp mồi đặt tên là xa5add35 (có trình tự: xa5add35F: tagtggcatgggaaatatgg và xa5add35R: taggagaaactagccgtcca) đã được thiết kế nhờ sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer 3.0, có thể khuếch đại đoạn gen với kích thước tính toán 179 bp ở các giống có gen ứng viên kháng giống với công bố của thế giới và 144bp ở các giống có
trình tự sai khác với đoạn trình tự gen xa5 kháng bạc lá Từ đó đã xác định được 19 giống lúa nghiên cứu xuất hiện băng kích thước 179 bp
- Kết quả tầm soát trình tự vùng CDS và thành phần axit amin của
gen ứng viên xa13 và so sánh với locus gen kháng bạc lá xa13 với mã hiệu
là LOC_Os08g42350 đã thu nhận được 8 giống có số lượng nucleotit và
axit amin vùng CDS đúng bằng với số lượng nucleotit của gen xa13 đã
công bố (924 nucleotit và 307 axit amin) Trong số 8 giống trên thì có 2 giống là Chấn thơm và Hom râu có tỷ lệ nucleotit và thành phần axit amin
giống hệt với gen kháng bạc lá xa13 (LOC Os08g42350) đã công bố Sáu
giống còn lại giống về thành phần axit amin nhưng lại có tỷ lệ T(U) và C
khác với gen tham chiếu Kết quả tầm soát và so sánh trình tự locus xa13
với gen kháng bạc lá LOC_Os08g42350 cho thấy: xuất hiện các đa hình đơn nucleotit (SNP) và các đoạn thêm, bớt (InDels) giữa các giống với gen
xa13 đã công bố và giữa các giống với nhau Dựa vào sự sai khác ở đoạn
trình tự nằm trong gen (mất 4 nucleotit) đã được tìm thấy ở một số giống
lúa bản địa của Việt Nam so với trình tự gen xa13 đã công bố, cặp mồi
chức năng đặt tên là xa13add4 (có trình tự: F- tcactcactcactcactcaa và
R-cattagcagcta gttaacttac) đã được thiết kế sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer 3,0, có thể khuếch đại đoạn gen với kích thước 97 bp (ở các giống
mang gen ứng viên xa13 giống với trình tự thế giới công bố) và băng 93bp (ở các giống mang gen ứng viên xa13 khác với trình tự gen xa13 thế giới
công bố) Từ đó đã xác định được 8 giống lúa có băng kích thước 97bp ở trạng thái đồng hợp, trong đó, 2 giống là Hom râu và Nếp bồ hóng Hải Dương xuất hiện băng kích thước 97bp, có số lượng nucleotit giống với
gen kháng bạc lá xa13 đã công bố
Như vậy, 2 cặp mồi này có thể xác định được sự đa hình của gen
ứng viên xa5 và xa13 và có thể sử dụng phục vụ công tác nghiên cứu đánh
giá khả năng kháng bạc lá của các gen ứng viên này có trong các giống lúa bản địa của Việt Nam và phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bạc lá
3.1.2 Xác định các gen kháng bạc lá có trong các nguồn vật liệu thu thập nhờ sử dụng các chỉ thị liên kết
- Sử dụng 2 cặp mồi thiết kế xa5add35 và xa13add4 kiểm tra 14 dòng/giống lúa ưu tú, kết quả xác định được 02 giống (QJ4 và BC15) có sự xuất hiện của băng kích thước 179 bp tương tự như giống IRBB5 (đối
chứng dương) và không có giống nào mang gen ứng viên xa13
Trang 14- Sử dụng các mồi MP1-2, P3 và pTA248 để xác định các gen Xa4, Xa7 và Xa21 tương ứng có trong các dòng/giống nghiên cứu Kết quả xác định được 11 dòng/giống mang gen ứng viên Xa4 (Thơm Lài, Nếp mặn,
Một bụi đỏ, Nàng Cờ đỏ 2, Chấn thơm, Nếp ông táo, OM3536, IS1.2, Bắc thơm kháng bạc lá, Thiên ưu và RVT), 12 dòng/giống mang gen ứng viên
Xa7 (Lúa ngoi, Ble te lo, Kháu mặc buộc, Chấn thơm, Coi ba đất, Ba cho
K’ te, Blào sinh sái, Khấu điển lư, Nếp mèo nương, Hom râu, QJ4 và BQ),
không có dòng/giống nào mang gen ứng viên Xa21 giống như dòng
IRBB62
- Từ kết quả nhận diện gen/gen ứng viên kháng bạc lá đã xác định được 04 giống bản địa mang 3 gen ứng viên, đó là Chấn thơm, Coi ba đất, Khấu điển lư và Hom râu
Như vậy, đã tầm soát được 2 gen ứng viên xa5 và xa13 ở một số
giống lúa bản địa của Việt Nam có trình tự và thành phần acid amin tương đồng với các gen tham chiếu đã công bố trên NCBI Từ đó, thiết kế được 2 chỉ thị chức năng (xa5add35 và xa13add4) và xác định được 4 giống đó là
Chấn thơm (Xa4, xa5 và Xa7), Hom râu, Coi ba đất và Kháu điển lư (xa5, Xa7 và xa13) mang 3 gen ứng viên, trong đó gen ứng viên xa5 và xa13
được nhận biết nhờ sử dụng chỉ thị chức năng đã thiết kế Các chỉ thị này được sử dụng để phục vụ công tác nghiên cứu đánh giá tính kháng bạc lá
của các gen ứng viên xa5, xa13 có trong các giống lúa bản địa của Việt
Nam và phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
3.2 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh bạc lá của các nguồn vật
liệu
Kết quả lây nhiễm 2 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá với 24 dòng/giống nghiên cứu cho thấy: giống Hom râu, Chấn thơm và QJ4 kháng đối với isolate AGI5.6 và kháng trung bình với isolate AGI4.1 Giống Kháu điển lư kháng trung bình với cả 2 isolate lây nhiễm Có 8 dòng/giống
ưu tú kháng trung bình với isolate AGI5.6 và nhiễm với isolate AGI4.1 (BQ, QP5, Thủ đô 1, Bắc thơm kháng bệnh bạc lá, BC15, Thiên ưu, RVT
và Hương cốm) và 5 dòng/giống ưu tú còn lại nhiễm với cả 2 isolate lây nhiễm (NPT3, Bắc thơm số 7, Khang dân 28, DT39 và An dân 11) 3 dòng IRBB5, IRBB7, IRBB62 kháng hoàn toàn với 2 isolate lây nhiễm, dòng IRBB13 kháng hoàn toàn với isolate AGI5.6 và kháng trung bình với isolate AGI4.1 Dòng IRBB4, IRBB21 kháng trung bình với cả 2 isolate lây nhiễm
Như vậy, từ kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm của các dòng/giống
lúa nghiên cứu với các isolate vi khuẩn phân lập ở 2 tỉnh phía bắc, chúng ta
có thể sử dụng các giống Hom râu, Chấn thơm, Kháu điển lư, QJ4 và các dòng NIL của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) để làm nguồn cho gen, phục vụ cho lai tạo