Nghiên cứu định lượng tobramycin trong một số thuốc nhỏ mắt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ Trần Thúy Hạnh NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN TRONG MỘT SỐ THUỐC NHỎ MẮT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG - TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT Luận văn Thạc sĩ Dược học Hà nội - 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦ Trần Thúy Hạnh NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN TRONG MỘT SỐ THUỐC NHỎ MẮT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG - TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất Mã số: 60 73 15 Luận văn Thạc sĩ Dược học Người hướng dẫn: PGS TS Thái Phan Quỳnh Như Hà nội - 2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Thái Phan Quỳnh Như, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn thầy Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ mơn Phân tích Bộ mơn khác trường Đại học Dược Hà nội tạo điều kiện tốt cho thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc trung ương, Phòng Hóa lý I nơi tơi công tác quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nhiệm vụ học tập nghiên cứu thời gian vừa qua Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè ln động viên, chia sẻ, khích lệ giúp đỡ để tơi có kết ngày hôm Trần Thúy Hạnh Học viên cao học khóa 9, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất MỤC LỤC Trang NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Tobramycin 1.2 Một số phương pháp áp dụng để định lượng Tobramycin 1.2.1 Phương pháp Dược điển 1.2.2 Phương pháp Dược điển 1.3 Cơ sở lý thuyết huỳnh quang 12 1.3.1 Sự hình thành quang phổ huỳnh quang 12 1.3.2 Phép đo huỳnh quang 13 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo huỳnh quang 17 1.3.4 Ứng dụng phép đo huỳnh quang 21 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang - tạo dẫn xuất sau cột 22 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang 22 1.4.2 Tạo dẫn xuất sau cột 1.5 Phản ứng tạo dẫn xuất phát huỳnh quang Tobramycin 23 25 Phần 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 30 2.2.2 Đánh giá phương pháp 30 2.2.3 Xây dựng qui trình thử 33 2.2.4 Ứng dụng 33 2.3 Điều kiện nghiên cứu Phần 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thử 34 35 35 3.1.1 Chọn cặp bước sóng kích thích phát xạ 35 3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động 37 3.1.3 Khảo sát lựa chọn cách pha thuốc thử 39 3.1.4 Khảo sát tốc độ dòng pha động tốc độ bơm thuốc 3.2 Qui trình thử 39 40 3.2.1 Chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn 40 3.2.2 Cách tiến hành đo 41 3.2.3 Cách tính kết 41 3.3 Đánh giá phương pháp 42 3.3.1 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 42 3.3.2 Tính đặc hiệu 44 3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 46 3.3.4 Khảo sát độ lặp lại 48 3.3.5 Khảo sát độ 50 3.3.6 Kết bàn luận chung 52 3.4 Ứng dụng 53 3.4.1 Áp dụng qui trình để định lượng số thuốc nhỏ mắt 53 3.4.2 So sánh với kết định lượng phương pháp vi sinh vật 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT BP : Dược điển Anh Em : Bước sóng xạ (Emission) EP : Dược điển châu Âu Ex : Bước sóng kích thích (Excitation) HD : Hạn dùng HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao JP : Dược điển Nhật LT : Lý thuyết NSX : Ngày sản xuất RSD : Độ lệch chuẩn tương đối S : Độ lệch chuẩn SKS : Số kiểm soát TN : Thực nghiệm USP : Dược điển Mỹ UV - VIS : Quang phổ tử ngoại - khả kiến VSV : Vi sinh vật * Các đơn vị đo lường viết tắt sau: - Đơn vị đo chiều dài: Centimet : cm Milimet : mm Micromet : µm Nanomet : nm Gam : g Miligam : mg Microgam : µg Lít : L Mililit : mL Microlit : µL - Đơn vị đo khối lượng: - Đơn vị đo thể tích: DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 2.1 Các chế phẩm thuốc nhỏ mắt dùng để nghiên cứu Trang 27 Bảng 2.2 Bốn mẫu chế phẩm thuốc nhỏ mắt Tobramycin: M1, M2, M3 M4 32 Bảng 3.1 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống 42 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 46 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 49 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ phương pháp 51 Bảng 3.5 Kết định lượng Tobramycin số thuốc nhỏ mắt lưu hành thị trường 53 Bảng 3.6 So sánh kết định lượng hai phương pháp HPLC vi sinh 55 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Ký hiệu Hình 1.1 Nội dung Trang Phổ kích thích phổ xạ Vitamin B R R 16 (Dung dịch µg/ml , cực đại EX = 370 nm, cực đại EM = 425 nm) Hình 1.2 Phổ kích thích phổ xạ Histamin 16 (Dung dịch µg/ml , cực đại EX = 350 nm, cực đại EM = 440 nm) Hình 1.3 Phổ huỳnh quang Natri salicylat 17 Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo detector huỳnh quang 22 Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo máy HPLC với detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột 24 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV - VIS dung dịch Tobramycin mg/ml pha pha động 35 Hình 3.2 Phổ xạ huỳnh quang dẫn chất Tobramycin với thuốc thử o-phthalaldehyd 36 Hình 3.3 Phổ kích thích huỳnh quang dẫn chất Tobramycin với thuốc thử o-phthalaldehyd 36 Hình 3.4 Hình ảnh chồng sắc ký đồ để so sánh thời gian lưu hình dạng píc Tobramycin thay đổi nồng độ natri sulfat pha động 37 10 Hình 3.5 Sắc ký đồ Tobramycin với pha động chứa 0,015 M natri pentansulfonat 38 11 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Tobramycin 43 12 Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ lần tiêm chồng khít lên 43 13 Hình 3.8 Hình ảnh minh họa hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao, detector huỳnh quang với tạo dẫn xuất sau cột, sử dụng cho phép thử nghiệm 44 14 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch thử Tobramycin 45 15 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, khơng có Tobramycin 45 16 Hình 3.11 Tín hiệu phát dẫn xuất Tobramycin với OPA detector UV - VIS 46 17 Hình 3.12 Đường hồi qui tuyến tính Tobramycin 47 18 Hình 3.13 Hình ảnh chồng sắc ký đồ dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 47 PL - 10 Phụ lục 10 Sắc ký đồ định lượng Tobramycin mẫu M9 PL - 11 Phụ lục 11 Sắc ký đồ định lượng Tobramycin mẫu M10 PL - 12 Phụ lục 12 Sắc ký đồ định lượng Tobramycin mẫu M11 Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Chuan Unknown 20.00 ul 20.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 9:51:42 AM Tobramycin 1/2/2007 3:57:45 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.415 Auto-Scaled Chromatogram 6000.0 Fluorescence 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.415 130202011 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 6552910 Printed 4:27:04 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2 Unknown 20.00 ul 20.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/29/2006 11:21:02 AM Tobramycin 1/2/2007 3:59:49 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.463 Auto-Scaled Chromatogram 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.463 104978063 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 5541615 Printed 4:28:02 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M2 Unknown 19 20.00 ul 20.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/29/2006 1:49:47 PM Tobramycin 1/2/2007 4:01:18 PM Tobramycin 474 Ch1 Auto-Scaled Chromatogram Tobramycin - 6.370 7000.0 6000.0 Fluorescence 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.370 129788951 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 6750129 Printed 4:28:29 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2%/M3 Unknown 35 20.00 ul 20.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/29/2006 5:21:14 PM Tobramycin 1/2/2007 4:04:59 PM Tobramycin 474 Ch1 Auto-Scaled Chromatogram Tobramycin - 6.485 7000.0 6000.0 Fluorescence 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.485 143148670 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 6825557 Printed 4:28:54 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M4 Unknown 20.00 ul 8.5 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 10:32:20 AM Tobramycin 1/2/2007 4:08:35 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.400 Auto-Scaled Chromatogram 7000.0 6000.0 Fluorescence 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.400 141636305 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 7073642 Printed 4:29:16 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M5 Unknown 25 20.00 ul 10.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 1:38:47 PM Tobramycin 1/2/2007 4:10:20 PM Tobramycin 474 Ch1 Auto-Scaled Chromatogram Tobramycin - 6.516 6000.0 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.516 147822515 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 5941013 Printed 4:29:40 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Thu C2/M9 Unknown 33 20.00 ul 10.0 Minutes Hanh INFORMATION Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 3:01:06 PM Tobramycin 1/3/2007 8:45:58 AM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.604 Auto-Scaled Chromatogram 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Tobramycin 6.604 Report Method: Hanh CH9 Area Height 157761369 5514236 Printed 8:46:51 AM Amount Units 1/3/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M8 Unknown 29 20.00 ul 10.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 2:16:49 PM Tobramycin 1/2/2007 4:15:52 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.545 Auto-Scaled Chromatogram 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.545 146182110 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 5578695 Printed 4:30:58 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M6 Unknown 18 20.00 ul 10.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 12:28:14 PM Tobramycin 1/2/2007 4:14:49 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.441 Auto-Scaled Chromatogram 4000.00 3500.00 Fluorescence 3000.00 2500.00 2000.00 1500.00 1000.00 500.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.441 91908324 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 4086254 Printed 4:30:05 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M7 Unknown 28 20.00 ul 10.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 2:07:12 PM Tobramycin 1/2/2007 4:15:23 PM Tobramycin 474 Ch1 Tobramycin - 6.541 Auto-Scaled Chromatogram Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.541 122137331 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 4701730 Printed 4:30:25 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Hanh INFORMATION Thu C2/M10 Unknown 21 20.00 ul 10.0 Minutes Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 12:58:58 PM Tobramycin 1/2/2007 4:16:51 PM Tobramycin 474 Ch1 Auto-Scaled Chromatogram Tobramycin - 6.473 6000.0 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Area Tobramycin 6.473 137966380 Report Method: Hanh CH9 Height Amount Units 5885061 Printed 4:31:45 PM 1/2/2007 Page: of Hanh CH9 Reported by User: System Project Name: SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: Sample Set Name: Thu C2/M11 Unknown 34 20.00 ul 10.0 Minutes Hanh INFORMATION Acquired By: Date Acquired: Acq Method Set: Date Processed: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System 9/30/2006 3:11:44 PM Tobramycin 1/3/2007 8:45:18 AM Tobramycin 474 Ch1 Auto-Scaled Chromatogram Tobramycin - 6.609 5000.0 Fluorescence 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Peak Results Name RT Tobramycin 6.609 Report Method: Hanh CH9 Area Height 145112170 4964479 Printed 8:47:36 AM Amount Units 1/3/2007 Page: of ... hành "Nghiên cứu định lượng Tobramycin số thuốc nhỏ mắt sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang - tạo dẫn xuất sau cột" , với nội dung nghiên cứu sau: - Khảo sát để lựa chọn hệ sắc ký tối... đến tạo huỳnh quang 17 1.3.4 Ứng dụng phép đo huỳnh quang 21 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang - tạo dẫn xuất sau cột 22 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector. .. khả tạo dẫn xuất phát huỳnh quang với số thuốc thử Việc phát chất quang phổ huỳnh quang có tính đặc hiệu cao nhạy, chọn hướng nghiên cứu định lượng Tobramycin sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh