Nghiên cứu chế thử glucosamin dược dụng từ sinh khối lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÔ Y TẾ TRƯỜNG AI HOC Dc H NI ô!*ằ Lấ THI NINH H NGHIÊN CỨU CHẾ THỬ GLƯCOSAMIN Dược DỤNG TỪ SINH KHỐI LÊN MEN LUẬN VĂ N THẠC s ĩ Dược HỌC Cnuvên ngành công NGhệ Dược phẩm Bào chế Mã số: 607301 Người hưỚng dẪn khoa học: GS Hà Nội- 2003 LÊ QUANG TỒN LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới GS Lê Quang Toàn- người hướng dẫn tỏi thực đề tài Tơi xin bày tó lòng biết ơn sáu sắc tới PGS-TS Từ Minh Koóng, Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà N ội, Phòng đào tạo sau đại học, thầy cỏ giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy vả tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Tôi xin chán thành cảm ơn DSCKII Trần Bình Duyên - Giám đốc Công ty Dược liệu Trung ương /, DS Lổ Viễn-Trường phòng Đảm bảo chất lượng, Ths Trần Phi Hùng - Phó trưởng phòng Đảm bảo chất lượng đồng nghiệp Công rv Dược liệu Trung ương I giúp đỡ thời gian học rập thực đề tài Lê Thị N inh Hà CÁC TỪVIẾT TẮT NSAID: Non steroidal anti inflammatory drug HPLC: High performance liquid chromatography ƯSP: The United states pharmacopeia MỤC LUC Các chữ viết tắt Trang Lời cảm ơn Đật vấn đề Chương 1: Tổng quan 1- Bênh khớp thoái hoá thuốc điều trị 2- Tác dụng glucosamin trons điều trị vièm xương khớp 16 thoái hoá khớp 3- Glucosamin 1-Hoá học ơiucosamin 25 -Cơ sờ phương pháp điều chế 27 3.3-Tóm tất chi tiêu kiểm nghiêm cua USP 26 33 Chương 2: Đối tượng- Phương pháp nghien cứu 1- Đối tượng 34 2- Phương pháp nghiên cứu 35 - Xử lý nguyên liệu 35 2.2Phan ứnơ thuỷ phàn 35 2.3- Kiểm nghiệm sản phẩm 36 Chương 3: Kết 1- Từ vỏ tôm 41 2- Từ nguyên liệu men bia 43 3- Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian phan ứns lên hiệu suất 45 4- Kết qua khảo sát ảnh hường cùa tỉ lè acid chitin lên hiệu suất 45 5- Kiếm nghiệm tiêu chát lượns cua glucosamin hydrochlorid theo USP 26 46 Chương 4: Bàn iuàn 50 Kết luận 52 Kiến nghị-Đề xuất 53 Tài liệu tham khảo 54 Phụ ỉục 61 ĐÁT VẤN ĐỀ Bệnh thoái hoá khớp tình trạng lão hố mồ sụn Mỏ sụn bị xơ cứng, mỏng đi, tính đàn hồi Từ khớp thối hố sinh enzym gây phá huỷ cấu tạo sụn Có nhiều bệnh liên quan đến khớp hai bệnh hay gặp thấp khớp viêm xương Bệnh gây viêm tiêu huỷ mơ khớp, q trình giải phóng cytokin gây viêm tiếp Vòng luẩn quẩn tiếp diễn gây đau biến dạng khớp người bình thường q trình tổng hợp thối hố cúa hệ sụn/proteogiycan diễn càn Khi bị viêm sụn cân trao đổi chất bị phá huỷ trình tons hợp proteoglvcan tiếp tục Q trình thối hố diễn nhanh q trình tống hợp Sự chênh lệch cans lớn bệnh nặng làm cho mơ bọc ngồi cốt sụn bị huỷ bệnh nhân bị viêm khớp dẫn tới hư khớp Trước thuốc thường dùng điểu trị bệnh nhóm chống viêm giảm đau steroid hoậc NSAID chữa triệu chứng có nhiều tác dụng phụ Từ thập kỷ 90 người ta phát glucosamin phục hồi sụn khớp tức chữa nsuyèn bệnh viêm, thoái hoá khớp dạng thấp Trên 300 công trinh nghiên cứu với 20 thử nghiệm mù đôi lâm sàng chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp alucosamin dạng phối hợp với dược liêu thièn nhièn Thuốc chứa glucosamin lưu hành 70 nước giới Xuấí phát từ thực tế chúng tơi tiến hành NGHIÊN c ú u CHẾ THỬGLUCOS AMIN DƯỢC DỤNG TỪPHỂ LIỀU SINH HOC : MEN BIA VÀ Vỏ TÔM -Ị ỏ TỈNH HÌNH NGHIÊN cứu Ở TRONG NƯỚC VÀ NƯỚC NGỒI VẺ GLUCOSAMIN: Trong nước ta có nhiều đơn vị nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan từ vò tơm cua chưa thấy cơng trình cơng bố sản xuất chitin chitosan từ sinh khối vi sinh Trẽn giới thấy còng bố qui trình sản xuất glucosamin từ vài loại nấm sợi ( Aspergillus Peniciỉlium), chưa thấy công bố phương pháp sản xuất từ nấm men Tuy nhiên thưc tế Việt Nam chí có cơng nshiêp lên men bia rượu có thải phế liệu sinh khối nấm men nèn chờ đợi tạo khuán tv Aspergillus niger Peniciỉlium chrvsogenum hay notatum, chúng tòi thử nghiệm thăm dò với sinh khối Saccharomvces cerevisaea Trước năm 2003 ĩhế siới chưa có dược điển nước đề tiêu chuẩn glucosamin hydrochloric! Gần dược điển Hoa Kỳ xuất tháng giêng năm 2003 ( USP 26) có tiêu chuẩn glucosamin-hydrochloric! Chúng dựa vào để xác định chất lượng sản phẩm tạo Hiện nav nguyên liệu ơiucosamin thành phẩm chứa slucosamin nhập ngàv nhiều vào Việt Nam từ Trung Quốc Mỹ, Thuv Sĩ, Tâv Ban Nha, Italia ( biệt dược điều trị viêm, thoái hoá khớp) Vói mục đích sớm có ngun liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh thối hố khỚD chúng tòi tiến hành nghiên cứu sản xuất glucosamin hvdrochlorid MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN Tạo glucosamin hvdrochlorid đạt tiêu chuẩn dược dụng đế làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị thoái hoá khớp NỘI DUNG LUẬN ÁN 1- Nghiên cứu điều chế glucosamin hydrochloric! từ phế thải sinh học: vỏ tôm nhà máy xuất thuv hải sản Hà Nội 2- Nghiên cứu kiểm nghiệm tiêu chuẩn sản phẩm glucosamin hydrochlorid tạo theo US p 26 3- Thăm dò khả năns điều chế glucosamin hvdrochloriđ từ sinh khối lên men vi sinh vật Chương 1: T ổN G QUAN BỆNH KHỚP DO THOÁI HOÁ VÀ THUỐC ĐIỂU TRI Bệnh khớp thối hố gọi hư khớp, thoái hoá khớp bệnh mạn tính khớp cột sống có đau biến dạng, khơng có biểu viêm Thương tổn thoái hoá sụn khớp ( cột sống đĩa đệm), sau thay đổi phần xương sụn màng hoạt dịch Nguvên nhân hư khớp hố già trình chịu áp lực tải, kéo dài sụn khớp Theo [1], người bị hư khỚD: Khi 45 tuổi, nam bị nhiều nữ, sau 45 tuổi ngược lại.Theo Kenneth, Brandt D (Anh), kiểm tra X quans nsười 55 tuổi Hoa Kỳ thấy 80% có dấu hiệu hư khớp người 15-24 tuổi 10% có dấu hiệu hư khớp, Pháp, theo Carter H.(1986), hư khớp chiếm 28,6% bệnh vể khớp, năm có tới 50.000 người ghép khớp háng nhàn tạo, phần lớn thoái hoá khớp, Việt Nam qua điều tra bệnh tật 10.398 người 16 tuổi ( Phạm Khuê, 1979) thấy 20% có đau khớp cột sons khơng có ngun nhân viêm, 13.392 người từ 60 tuổi trở lên thấv 12% có đau khớp 17% đau thắt lưng, thăm khám kỹ 364 người 60 tuổi thấy có 15% có biểu hư khớp X quang lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai , 10 năm (1979-1988), theo Đặng Ngọc Trúc Trần Ngọc Ân, có 7.399 bệnh nhân mắc bệnh máv vận động bệnh khớp thối hố chiếm 10,41% hư khớp cột sống chiếm 65,4% khớp chi chiếm 34,6% Các vị trí hư khớp: Cùng với gia tăng tuổi tácTcác khớp đoạn cột sống có thav đổi sinh hố cấu trúc Định vị hư khớp sau: Cột sống thắt lưng 31,12% Cột sống cổ 13,96% Nhiều đoạn cột sống 7,07% Gối 12,57% Háng 8,23% Các ngón tay 3,13% Riêng ngón tay 2,52% Nhiều khớp 1,97% Người mô tả hư khớp bệnh hư khớp Huntre J.(Anh) năm 1759 Garrod A.E.(Anh) dựa vào đặc điếm lâm sàng xét nghiệm phân biệt hai bệnh khớp mạn tính thường gặp ơng đặt tên viêm khớp dạng thấp bệnh viêm xương khớp (1907), tên gọi người Anh Hoa Kỳ dùng ngày Năm 1931 hai tác giả Pháp Coste F Forestier J.F phàn biệt hai thể hư khớp nguyên phát hư khớp thứ phát Cho đến tên gọi bệnh chưa thống nhất: hư khớp hav thoái hoá khớp (Pháp , Đức, ); viêm xương khớp (Anh, Hoa Kỳ, ); số tác giả khác quen dùns từ bênh xương khớp thoái hố Tuv tình trạng thối hố vị trí khớp cột sống, người ta thường ghép từ hư khớp với vị trí khớp thương tổn, ví dụ: hư khớp háns, hư cột sống cổ, hư đĩa đệm, hư khớp gối Sự tạo xương ( An a Phys hum 84): Trừ xương đầu, tất xương thể trải qua giai đoạn phát triển : trạns thái màng nhầy, trạng thái sụn hình thành xương Ban đầu tế bào tiến triển thành mô liên kết trạng thái màng nhầy Mô liên kết chuvển dần thành sụn cứng trước, đồns thời tiết dịch lấp đầy khoảng trống tạo thành dạng cùa xươnơ sau Sau sụn tiêu dần đươc thay xương cứng Khi thành phần xương gồm ossein muối canxi Ouá trình chuyển từ sụn thành xương trung tâm ( enchrondaỉ) thân sụn ( diaphyse) chu vi sụn ( penchondral) Từ mạt perichondral xuất tế bào tạo xương( osteoblaste), tiết xung quanh chất để hình thành nhiều lớp đồng tâm gồm ossein muối canxi ( 50 % p 36% Ca) Nhờ màng thân xương ( perioste) tạo thành Sun Chòm (Epiphyse) Thân xương (Diaphyse) Chỏm (Epiphvse) Sun Hình 1: Cấu tạo xương ôn đùi 45-Dutkiewicz Jacek, u s 5590016, America, 1997 46- Dutkiewicz Jacek, u s 5799916, America 1997 47- Fan Weivu, w o 01699 [4, America 2001 48- Fan Weiyu, u s 20025945 America, 2002 49-Han Sang Mun, w o 03013552, Korea, 2003 50-Hershberrger, u s 4990674, 1989 51-Kameyama 52-Koshova Hiroshi, JP 200007706 Japan, 2000 I.V., RU 24043214, Russia, 1999 53-Mukherjii Debi p., u s 2002555629, America, 2002 54-Nies Berthold, u s 6509039, 2003 55-Smidsrod Olav, w o 0300912, 2003 56- Pat GB 658839, Dupont Co England, 1936 57- US 2355275, Abbott Co., 1957 58-US 3062122, Johnson Co., America, 1975 59-US 4006735, Johnson Co., America, 1980 60-US 4395175, 1980 61-US 5840619, Burger John, 1998 62-US 990973, Creach Aimee Louise, 1999 60 Data File c :\HPCHEM\l\DATA\GLr JCOSA\GLUCOSOS D Sample Name: Mau thu Ĩ Mau t h u / d i n h t i n h va d i n h l u o n g G i u c o s a m i n HC1 t r o n g NL (NC-me2) 1 / / : : AM Mau t h u Duyen c : \HPCHEM\1 \M E T H O D S \G L U C O S A M M 1 / / : : 5 AM b y Duyen (modified a f t e r loading) Phuong p h a p p h an t i c h G l u c o s a m i n h y d r o c n l o r i d I n j e c t i o n Date S am pl e Name Acq O p e r a t o r Met hod L a s t changed DẨD1 c, Sig=195,8 Ref=360,100 (GLUCOSÁ\GLUCOS05.D) mAU Vial ' s ỈỘ 250 200 150 100- 50 - -m in Ar e a P e r c e n t R e p o r t Signal S o r t e d By M ultiplier D ilution 1.0000 1.0000 DAD1 c , Signai P e a k R et Ti me Type # [min] Totals VP : Sig=195,3 Ref=360,100 Wi dt h [mini Area [mAU*s] D 387 5 9 1554.07959 Ar ea Height [mAU] 270.41895 100.0000 270.41895 R e s u l t s o b ta in e d w ith enhanced i n t e g r a t o r ! *** End o f R e p o r t *** Page of Instrxoment 11/2/03 10:42:50 AM Duyen Phụ lục số ca File C:\HPCHEM\l\DATA\GLUC0SA\GLUC0SCi4.D Sample Name: Mau chuan Mau c h u a n / d i n h t i n h va d i n h l u o n g G l u c o s a m i n HC1 t r o n g ';L ;NC) ị e c t i o n Da te r o l e Name Ị O p e r a t o r :hcd 5t c h a n g e d 1 / / : : AM Mau c h u a n / Duỵen C : \HPCHEM\l\METHODS\GLUCOSAM.M 1 / / : : AM by Duyen (m odified a f t e r loading) l ong p h a p o h a n t i c h G l u c o s a m i n h y d r o c h l o r i c ! DAD1 Vi a] c, Sig=195,8 Ref=360,1Ũ0 (GLUCOSA\GLUCOS04X)) mAU cỏ oi 250 200 150 100 50 Area P e r c e n t Report S ignal S o r t e d Bv M ultiplier D ilution S ignal 1: 0000 - 1.0000 DAD1 c , P e a k R et Ti me Type # [mini S ig = ,8 Ref=360,100 Width [min] Area [mAU*s] Height [mAU] ■I ! i Totals VP : Area % 0.0872 1561.89331 1561.89331 271.21432 100.0000 271.21432 R e su lts obtain ed w ith enhanced i n t e g r a to r ! *** End Instrument 11/2/03 10:43:15 AM Duyen o f R e p o r t *** Page of Data File C:\HPCHEM\l\DATA\GLUCOSA\GLUCOSO8 D Sample Name: iMau thu Mau chu / d i n h t i n h v a d i n h l u o n g G l u c o s a m i n HC1 t r o n g ML (NC0-me2) I n j e c t i o n Da te Sa mp l e Name Acq O o e r a t o r Met hod ' L a s t changed : : : : : 1 / / : : AM Mau t h u Duyen C:\HPCHEM\l\METHODS\GLuCOSAM.M 1 / / : : AM by Duyen (m odified a f t e r loading) Ph uo nạ p h ap p h a n t i c h G i u c o s a m i n h y d r o c h l o r i c ! Via] ' DADÌ ~c, Sig-T95,8 Ref=360,100 (GLUCOSA\GLUCOS08.D) mAU m CÚ 250 - 200- 150 - Area P e r c e n t Report S o r t e d 3v M u ltiplier D ilution S i g n a l 1: DAD1 c, Peak R et Ti me Type # [min] Totals 2 VP : : : : Signal l.oooa 1.0000 S i g = i , R e f = , 00 Width [min] Area [mAU*5] -0.0880 1648.29187 1648.29187 Height [mAU] Ar e a i 282.63177 100.0000 282.63177 R e s u lts o b ta in e d w ith enhanced i n t e g r a t o r ! *** End o f R e p o r t *** Instrument 11/2/03 xl:06:44 AM Duyen Page of Data File C:\HPCHEM\l\DATA\GLUCOSA\GLUCOSO7 D Sample Name- Mau chuan/2 Mau c h u a n / d i n h t i n h va d i n h l u o n g G l u c o s a m i n HC1 t r o n g NL (NC) I n j e c t i o n Da te Sampl e Name Acq O p e r a t o r Met ho d L a s t changed : 11/2/03 10:41:00 AM : Mau c h u a n / : Duyen : C:\HPCHEM\1\METH0DS\GLUC0SAM.M : 11/2/03 : : AM by Duyen (modified a f t e r loading) Phuong pn ap p h a n t i c h G l u c o s a m i n h y d r o c h l o r i c ! ' DẢD1C, Sig=195,8 Ref=360,100 (GLUCOSA\GLUCOS07 0) Vial i mAU CN 250 200 - 150- 100 Area P e r c e n t Report S o r t e d By M ultiplier D ilution S i g n a l 1: DAD1 c, P e ak Ret Ti me Type # [min] Totals VP : Signal 1.0000 1.0000 i g = , R e f = , 00 Wi dt h [min] Area [raAU*s] 0.0873 1570.63184 57 Height [raAU] Ar ea % 8 00 00 0 272.31813 R e s u lts o b tain ed w ith enhanced i n t e g r a t o r ! *** End o f R e p o r t *** Instrioment" 11/2/03 11:06:19 AM Duyen Paae of Kết định lượng Gỉucosamin nguyen lieu (me 2) Ngày: 02/11/03 Mtb HI/nhan P1 0.0502 P2 0.0535 P3 A1 1554.1 100.3510 Ac1 1561.9 H.l.% T.b.(%) 99.83 fc Hlc 99.86 ft Pc 0.0507 A2 1648.3 99.3154 Ac2 1570.6 4000.0 3500.0 3000.0 2500.0 2000.ơ 1750.0 1500.0 — D-Glucosamin.HCL (vơ tom) 1250.0 1000.0 750.0 500.0 1/cni Phụ lục sổ 120.0 %T 100.0 80.0 60.0 40.0 ; 0 0.0 4000.0 3500.0 3000.0 2500.0 — D G lu co sa m in 1ICL(030507 149) 2000.0 175 1/cm 120.0 %T 100.0 1890 538 Ị 538 2574.8 786.9 2786.9 846.7 3097.5 294.2 I T I r I I r I Ị i I n - i i 4000.0 3500.0 3000 Ơ 2500.0 — D_G!ucosainin HCL(030507 149) — D-G lucosạm in.HCL (vo tom) 2000.0 i/cm Phu lục số ỉữM mo JOOff íOt*' tWO et'vo /cxv cm-' PhA IR c ù a C h iln ĩa n th e n c c ta i lir a k h fta h o c ([ I H Y o sh ita * S n tfated N -M y n s to y l O ú to a a n 23 a su rfac e m odifier o f L ip o so m e s- D ios, B io tec h B io c b em 1993 (7 ), 1053 - 1057 2) C ô n í c ù a V t£ n K hoa ho c ViỀt N a m ; < > C h ito sa n t m c n b í a liL Ịổ I k C Ù A C H I T U S A N A l.D K I C I I