ẢNH HƯỞNG CỦA BIỆN PHÁP XỬ LÝ KHỬ TRÙNG MẪU

Những cụm từ tìm kiếm này đã được tô sáng: môi trường nuôi cấy in vitro Page 1 --- Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau & Hoa – 1 ẢNH HƯỞNG CỦA BIỆN PHÁP XỬ LÝ KHỬ TRÙNG MẪU VÀ CÁC YẾ

Trang 1

Ðây là phiên bản html của tập tin http://iasvn.org/uploads/files/dautay_1008085239.pdf

G o o g e tự động tạo ra những phiên bản html của các tài liệu khi chúng tôi crawl web.

Để liên kết tới hoặc đánh dấu trang này, hãy sử dụng URL sau: http://www.google.com/search? q=cache:j2gTCXqhwaAJ:iasvn.org/uploads/files/dautay_1008085239.pdf+%22m

%C3%B4i+tr%C6%B0%E1%BB%9Dng+nu%C3%B4i+c%E1%BA%A5y+in+vitro

%22&hl=vi&ct=clnk&cd=4&gl=vn

Google không có một mối liên hệ nào đến các tác giả của các trang web này cũng như không chịu trách nhiệm về nội dung của chúng.

Những cụm từ tìm kiếm này đã được tô sáng: môi trường nuôi cấy in vitro

Page 1

-

Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau & Hoa –

1

ẢNH HƯỞNG CỦA BIỆN PHÁP XỬ LÝ KHỬ TRÙNG MẪU

VÀ CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TRONG NHÂN NHANH

GIỐNG DÂU TÂY IN VITRO

Phạm Xuân Tùng & Phạm Thị Lan

Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau & Hoa

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Tóm tắt

Các thí nghiệm được tiến hành để đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu của CH

và ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến việc nhân nhanh giống dâu tây in

vitro Kết quả cho thấy với chế phẩm CH 36%, dung dịch 8% có hiệu quả khử

trùng tốt nhất với mẫu là chồi đỉnh của cây con khi xử lý 15 phút (85,6% cây sống

không bị nhiễm nấm, khuẩn) Môi trường MS có bổ sung 0,4-0,6 mg/l BAP cho hệ

số nhân chồi cao nhất (51,6 lần) với chất lượng chồi khá tốt Chồi tách từ cụm nuôi

cấy trên MS+BAP vươn thân tốt nhất khi cấy chuyển hai lần cách nhau 15 ngày

trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng MS có bổ sung 0,2 mg/l

NAA và 0,2 g/l than họat tính là thích hợp cho việc tái sinh bộ rễ in vitro Phối hợp

với phun bổ sung phân NPK tím và Atonik, 10 ngày một lần, giá thể đất mùn đen

rất thích hợp cho việc cấy chuyển cây dâu tây ra vườn ươm.

Từ khóa: dâu tây, Fragaria x ananasa, môi trường Murashige-Skoog, calcium

hypochlorite, 6-benzylamino purine, naphthalene-acetic acid, indole-butyric

acid.

Summary

Experiments were conducted to investigate the effect of CH on sterilization

of apical doom and influence of other factors in the culture medium on in vitro

rapid propagation of strawberry Results indicated that 8% solution of the currently

available preparation 36% CH was highly effective in sterilization of apical dooms

from runners for 15 minutes (85.6 % live explants free from comtamination) MS

medium containing 0.4-0.6 mg/l BAP gave the highest shoot multiplication rate

(51.6x) with good shoot appearance Shoot buds excised from callus masses,

cultured in MS medium suplemented with high concentration of BAP, grew best in

height when subcultured twice after every 15 days on MS medium free of plant

growth regulators MS medium suplemented with 0.2 mg/l NAA and 0.2 g/l active

charcoal showed the best results in in vitro regeneration of root system.

Trang 2

Incombination with NPK and Atonik sprays at 10-day intervals, the black

peat-moss gave the best results in transplanting the in vitro plantlets into the nethouse

nursery.

Key words: strawberry, Fragaria x ananasa, Murashige – Skoog medium, calcium

hypochlorite, 6-benzylamino purine, naphthalene acetic acid, indole-butyric

acid.

Page 2

-

2

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Như với nhiều lọai cây trồng nhân giống vô tính khác, nuôi cấy mô là biên pháp kỹ

thuật được sử dụng rộng rãi để nhân nguồn giống sạch bệnh dâu tây (Fragaria x

ananasa) Có thể tái sinh cây in vitro từ mảnh lá (Nehra & Stushnoff, 1989; Liu &

Stanford, 1988), từ nõan chưa thụ tinh hoặc tràng hoa (Prediery và cs, 1989), từ hạt

phấn (Rosati và cs, 1975) hoặc phôi chưa trưởng thành (Wang và cs, 1984) Tuy

nhiên, phương pháp có ý nghĩa thực tiễn và phổ biến nhất là tạo mẫu sạch bệnh từ

mô phân sinh, nuôi cấy callus, tạo và nhân nhanh cụm chồi, tạo cây có rễ in vitro,

sản xuất xuất cây giống từ thân bò (runner) Chất lượng cây giống in vitro là yếu tố

có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu qủa sản xuất cây giống tiêu chuẩn cũng như khả

năng sinh trưởng và năng suất của vườn dâu (Rancillac & Nourrisseau, 1989;

Stapteton & cs, 2001).

Nuôi cấy mô là kỹ thuật được ứng dụng nhân nhanh giống dâu tây tại Đà Lạt

trong những năm gần đây Tuy nhiên, cây giống của một số cơ sở nhân giống đưa

ra sản xuất là rất khác nhau về chất lượng và sức sống Hệ số nhân luôn là vấn đề

quan trọng nhất được quan tâm, nhưng kích thước cây và quy mô bộ rễ là vấn đề có

ý nghĩa quyết định đến sức sống, khả năng phục hồi và phát triển nhanh khi cấy

chuyển ra giá thể ex vitro Báo cáo này trình bày một số kết quả nghiên cứu nhằm

xác định các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro và giá thể ex vitro

nhằm xây dựng hòan chỉnh quy trình sản xuất giống chất lượng cao phục vụ sản

xuất tại Đà lạt

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu là giống Angelique ( Mỹ Đá) nhập nội từ Israel, giống này thích

ứng khá tốt với điều kiện khí hậu Đà Lạt và có nhiều đặc điểm ưu việt như quả đẹp,

cứng và năng suất cao

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Môi trường Murashige- Skoog (MS) (1962) có bổ sung 8g/l agar, 30 g/l đường và

pH 5.8 được dùng làm môi trường nuôi cấy cơ bản cho các thí nghiệm (TN) nuôi

cấy in vitro Phương pháp bố trí cho từng thí nghiệm như mô tả dưới đây

Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ calcium hypochlorite (CH)[36 % Ca(OCl)

2

]

và thời gian xử lý khử trùng mẫu ban đầu

Các nghiệm thức gồm:

C

1.1

Trang 3

= CH 4 %, trong 10 phút

C

2.1

= CH 6%, trong 10 phút

C

1.2

= CH 4 %, trong 15 phút

C

2.2

C

3.1

C

3.2

Chồi đỉnh của tay non (runner) khoẻ mạnh được chọn làm vật liệu cho

quá trình nhập mẫu Chồi này được rửa sạch bụi đất bằng xà phòng trước khi

được xử lý trong dung dịch khử trùng CH với nồng độ và thời gian khử trùng

Page 3

-

3

theo các nghiệm thức nêu trên Trước khi tách đỉnh sinh trưởng, mẫu xử lý

được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần trong điều kiện vô trùng Mỗi

mẫu đỉnh sinh trưởng được cấy trong một ống nghiệm có chứa 8 ml môi

trường đã tiệt trùng TN được bố trí hòan tòan ngẫu nhiên với ba lần nhắc lại,

30 mẫu / một lần nhắc Chỉ tiêu theo giõi là tỉ lệ (%) mẫu sống và sạch nấm,

khuẩn 20 ngày sau khi cấy.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BAP) trong

môi trường MS đến tốc độ nhân chồi

C

0

= MS + 0,0 mg/l BAP

C

3

= MS + 0,6 mg/l BAP

C

1

= MS + 0,2 mg/l BAP

C

4

= MS + 0,8 mg/l BAP

C

2

= MS + 0,4 mg/l BAP

C

5

= MS + 1,0 mg/l BAP

Những mẫu sống, sạch và có sức sinh trưởng tốt thu được từ TN 1 được

Trang 4

chọn làm mẫu cấy để tạo chồi TN được bố trí hòan tòan ngẫu nhiên với ba lần nhắc lại, 10 bình/ lần nhắc, 3 chồi / bình tam giác 250 ml chứa 40 ml môi trường đã tiệt trùng (theo từng nghiệm thức) Các số liệu thu thập sau 50 ngày cấy gồm: hệ số nhân (số chồi/cụm chồi); trọng lượng trung bình của cụm chồi.

Thí nghiệm 3: Xác định môi trường vươn thân cho dâu tây trong nuôi cấy in vitro.

V

1.1

= MS + 0,0 mg/l BAP , cấy chuyền một lần

*

V

1.2

= MS + 0,0 mg/l BAP, cấy chuyền hai lần

**

V

2.1

= MS + 0,05 mg/l BAP, cấy chuyền một lần

V

2.2

V

3.1

= MS + 0,1 mg/l BAP, cấy chuyền một lần

V

3.2

*

Cấy chuyền một lần: nuôi 30 ngày mới chuyển sang môi trường mới;

**

Cấy chuyền hai lần: cũng nuôi 30 ngày, nhưng 15 ngày chuyển một lần

sang môi trường mới có cùng hàm lượng BAP;

Mẫu cấy là những chồi có kích thước như nhau được tách ra từ những cụm

chồi chọn từ nghiệm thức tốt nhất của TN2 TN gồm ba lần nhắc với 10 bình tam giác 250 ml / lần nhắc, 15 chồi / bình Chỉ tiêu theo giõi: chiều cao trung bình của chồi (cm) sau 30 ngày.

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của naphthalene-acetic acid (NAA) và indole-butyric acid (IBA) ở các nồng độ khác nhau đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro

R

0

= MS

R

1

= MS + 0,1 mg/l NAA

R

4

= MS + 0,1 mg/l IBA

R

2

= MS + 0,2 mg/l NAA

R

5

Trang 5

= MS + 0,2 mg/l IBA

R

3

= MS + 0,3 mg/l NAA

R

6

= MS + 0,3 mg/l IBA

Page 4

-

4

Cây đơn lẻ đồng đều được chọn từ nghiệm thức tốt nhất của TN 3 làm vật

liệu Các nghiệm thức được bố trí hòan tòan ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần

10 bình tam giác 250 ml với 20 cây/bình Môi trường cho TN ra rễ in vitro còn

được bổ sung thêm 0,2 g/l than hoạt tính Số liệu thu thập sau 15 ngày cấy: số rễ

trung bình / cây, chiều dài rễ trung bình / cây (cm)

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số loại giá thể và phân bón đến tỷ

lệ sống và sức sinh trưởng của cây in vitro khi ra vườn ươm

TN được bố trí để khảo sát một số loại giá thể và phân bón khác nhau nhằm

xác định được lọai giá thể và phân bón phù hợp cho cây dâu tây in vitro khi cấy

chuyển ex vitro Tất cả các loại giá thể được xử lý vô trùng bằng dung dịch

formalin theo phương pháp thông thường

Các lọai phân bón hóa học được bổ sung tùy từng nghiệm thức và được bón

dưới dạng phun sương Hàm lượng và số lần bón là như nhau cho các nghiệm thức:

8 g/l, 3lần/tháng Thành phần các lọai phân bón sử dụng như sau:

+ Atonik 1.8 DD, gồm 3 đồng phân:

Sodium -5- nitroguaire olate 0,3%

Sodium - o- nitrophen olate 0,6%

Sodium - p- nitrophen olate 0,9%

+ NPK tím: 15% N, 5% P

2

O

5

, 20% K

2

O; 0,5% Bo, 0,02% Fe, 0,02% Zn

+ Urea: 46 % N

Cây in vitro có bộ rễ 10 ngày tuổi được chuyển ra vườn ươm (để nguyên

trong bình) để thích ứng (acclimatization) trong một tuần Sau đó, cây được lấy ra

khỏi bình, rửa sạch môi trường bám trên rễ và cấy vào khay xốp 96 bầu (đường

kính bầu 3 cm).

Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên trong nhà lưới với 3 lần nhắc lại,

100 cây / lần nhắc Trong năm ngày đầu, cây được che 60 % nắng trực tiếp bằng

lưới đen thoáng từ 9 h -16 h Các kỹ thuật chăm sóc khác được áp dụng theo quy

trình chung của nhà mạ cấp một của Trung tâm nghiên cứu Khoai tây, Rau & Hoa

G

1

= đất mùn đen + NPK tím

G

Trang 6

= đất fine đỏ + NPK tím

G

2

= đất mùn đen + urea

G

6

= đất fine đỏ + urea

G

3

= đất mùn đen

G

7

= đất fine đỏ

G

4

= đất mùn đen + NPK tím + Atonik

Chỉ tiêu theo giõi: tỉ lệ cây sống (%); chiều cao trung bình/ cây sau 30

ngày.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thí nghiệm 1: Hiệu quả tiệt trùng của các nồng độ và thời gian xử lý CH

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của CH ở các nồng độ và thời gian khác nhau

đến tỷ lệ sống và sạch nấm khuẩn ở giai đoạn tái sinh cây in vitro, cho thấy nồng độ

8% CH và thời gian 15 phút là thích hợp nhất (Bảng 1) Nghiệm thức này cho tỷ lệ

Page 5

-

5

sống, sạch bệnh (nấm, khuẩn) là cao nhất (85,6%) khác biệt rất có ý nghĩa so với

các nghiệm thức khác Kết quả này cũng tương thích với kết quả của

Sánchez-Cuevas & Salaverría (2004) khi sử dụng sodium hypochlorite và phù hợp với các

quan sát trước đây của các tác giả

Bảng 1 Tỷ lệ (%) mẫu sống, sạch ở các nồng độ CH và thời gian xử lý khác nhau

Nghiệm thức

10 phút

15 phút

Trung bình theo C

C

1

= 4% CH

12,2 f

25,6 e

18,9 c

C

2

= 6% CH

48,9 d

66,7 c

57,8 b

C

Trang 7

3

= 8% CH

75,6 b

85,6 a

80,7 a

Trung bình theo T

45,6 b

59,3 a

-

CV% = 4,27

Chú thích: - C = nồng độ; T = Thời gian

- Các nghiệm thức đơn lẻ (in nghiêng) có cùng chữ cái không khác

biệt có ý nghĩa với P = 1%;

- Các trung bình theo C và T có cùng chữ cái không khác biệt có ý

nghĩa với P = 1%;

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ 6-benzylaminopurine (BAP) trong môi

trường MS đến tốc độ nhân chồi (hệ số nhân)

Theo Bhatt & Dhar (2000), với môi trường MS, BAP có hiệu quả tốt nhất

kích thích phát sinh chồi in vitro đối với dâu tây, so với kinetin và 2-ip BAP (1-4

mg/l) cho tốc độ số lượng chồi cao hơn đáng kể so với các lọai cytokinin sử dụng

trong thí nghiệm của họ Nghiên cứu của Stapteton và cộng sự (2001) cũng cho

thấy, hàm lượng cytokinin quá cao trong môi trường nuôi cây in vitro (MS) có ảnh

hưởng xấu đối với sự ra quả và khả năng chống chịu trên đồng ruộng của cây dâu

tây Trong môi trường in vitro, hàm lượng cytokinin cao quá sẽ làm giảm số lượng

chồi / cụm và chất lượng chồi, trong nhiều trường hợp dẫn đến hiện tượng thủy tinh

hóa (vitrification) của cụm chồi (Wang và cs, 1984)

Trong thí nghiệm này, môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l BAP cho hệ số

nhân thấp, nhưng với 0,8 mg/l BAP thì xuất hiện hiện tượng thủy tinh hóa làm cho

hệ số nhân giảm (Bảng 2) Kết quả này phù hợp với kết luận của các tác giả vừa

nêu trên Nghiệm thức 0,6 mg/l BAP cho hệ số nhân cao nhất (51,6 lần), chồi hơi

nhỏ nhưng thành thục và đều, mặc dù có khối lượng / cụm (3,1g) nhỏ hơn so với

nồng độ 0,4 mg/l BAP Kết quả cho thấy các nghiệm thức 0,4 và 0,6 mg/l BAP có

hiệu quả gia tăng hệ số nhân chồi và với chất lượng chồi khá tốt.

Bảng 2 Hệ số nhân và trọng lượng trung bình của cụm chồi sau 30 ngày cấy

Page 6

-

6

Nghiệm thức

Hệ số nhân

(số chồi/cụm)

Trọng lượng cụm chồi

(g)

C

1

MS + 0,0 mg/l BAP

1,4 e

0,32 e

Trang 8

2

MS + 0,2 mg/l BAP

35,7 cd

1,83 d

C

3

MS + 0,4 mg/l BAP

44,2 b

3,60 a

C

4

MS + 0,6 mg/l BAP

51,6 a

3,10 b

C

5

MS + 0,8 mg/l BAP

36,9 c

2,40 c

C

6

MS + 1,0 mg/l BAP

31,0 d

2,30 cd

CV%

5,4 3

3,06

Prob.

**

Chú thích: - Trong cùng cột, các giá trị trung bình có cùng chữ cái khác biệt

không có ý nghĩa;

-

**

P=0,01

Thí nghiệm 3 M ôitrường vươn thân thích hợp cho cây giống dâu tây nuôicấy in vitro

Mohamed và cs (1991) phát hiện rằng ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh

trưởng trong môi trường nuôi cấy có thể kéo dài đến bốn tháng sau khi cây đã được trồng ra đồng ruộng Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có nhiều BAP (Thí

nghiệm 2), chắc chắn ảnh hưởng ức chế vươn thân và xu hướng tiếp tục phát sinh chồi còn kéo dài sau khi tách chuyển cây sang môi trường tái sinh cây

Nghiệm thức MS + 0,0 mg/l BAP + cấy chuyền 2 lần cho cây đồng đều, thân

mập, cứng cát, sức sinh trưởng mạnh, chiều cao cây cao nhất (3,4cm), cao hơn có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 3) Kết quả thu được cho thấy cấy

chuyền hai lần trên môi trường không bổ sung BAP có tác dụng rõ làm giảm dần

dư lượng BAP trong mô cụm chồi, tích lũy trong qúa trình nhân chồi giai đọan

trước Vì vậy, chồi không tiếp tục phát sinh, mà cây phát triển chiều cao Kết quả này cho phép xác định được môi trường in vitro phù hợp cho cây dâu tây sinh

trưởng

Trang 9

Bảng 3 Chiều cao trung bình của cây 30 ngày sau cấy.

Nghiệm thức

Chiều cao trung bình

/cây (cm)

V1

MS + 0,0 mg/l BAP + cấy chuyền 1 lần

2,7 b

V2

3,4 a

V3

2,0 cd

V4

2,5 bc

V5

1,9 d

V6

MS + 0,1mg/l BAP + cấy chuyền 2 lần

2,0 cd

CV (%)

Prob

3,21

**

Chú thích: - Như bảng 2

Page 7

-

7

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng độ khác nhau đến sự ra rễ

của cây dâu tây in vitro.

Sự phát triển sung mãn của hệ rễ cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện

thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà lưới và trên đồng

ruộng Trong nuôi cấy in vitro, sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn

chế khả năng ra rễ Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc

không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Wang và cs,

1984) Khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình rễ của

Fragaria x ananasa, Bhatt & Dhar (2000) kết luận: cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng

NAA với liều lượng thấp (0,1 mg/l).

Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm

than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy Than hoạt tính tạo thuận lợi cho sự phát

triển của rễ nhờ khả năng hấp thụ các chất thải có tính ức chế của bản thân cây hoặc

mô nuôi cấy, đồng thời giảm cường độ ánh sánh vùng rễ phát triển (Druart & Wulf,

1993) Nồng độ than họat tính thích hợp cho dâu tây đã được Tùng và cs (2004) xác

định là 0,2 g/l và được sử dụng trong thí nghiệm này.

Trang 10

Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,2

g/l than họat tính cho bộ rễ của cây dâu tây in vitro khá đẹp với số rễ / cây cao nhất

(14,3) và chiều dài rễ vừa phải (1,2 cm) (Bảng 4) Nghiệm thức có 0,3 mg/l IBA

cho kết quả tuơng đương với số rễ là 12,9 rễ/cây và chiều dài là 1,42 cm/rễ Cerovic

và Ruzic (1989) thông báo rằng môi trường ra rễ in vitro tốt nhất là 1/2MS bổ sung

1 g/l than họat tính và 1 mg/l IBA Tuy nhiên, kết quả này thu được trên những

giống dâu tây khác

Bảng 4 Số rễ và chiều dài trung bình rễ (cm)/ cây sau 15 ngày nuôi cấy

Nghiệm thức

Số rễ trung bình

/ cây

Chiều dài trung bình rễ

(cm)

R1 MS + 0,0 auxin

7,7 d

0,43 e

R2 MS + 0,1 mg/l NAA

9,3 cd

0,93 c

14,3 a

1,20 b

10,3 c

0,90 cd

R5 MS + 0,1 mg/l IBA

10,3 c

0,78 d

12,5 b

1,25 b

12,9 ab

1,42 a

CV%

6,16

5,24

Prob

**

Chú thích: như Bảng 2

Thí nghiệm 5: Hiệu quả của một số loại giá thể và phân bón đến tỷ lệ sống và sức

sinh trưởng của cây in vitro khi ra vườn ươm

Trong các nghiệm thức thí nghiệm, giá thể đất mùn đen có bổ sung thêm

phân tím và Atonik cho tỷ lệ sống cũng như sức sinh trưởng của cây cao nhất

(Bảng 5 & Hình 1) Kết quả này đã được áp dụng thử nghiệm tại nhà mạ Trung tâm

Page 8

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	159 KB