Luan van cong nghe sinh hoc nghien cuu thanh phan hoa hoc va hoat chat sinh hoc cua la trau khong mien Trung

luận văn tổng quan về cây họ hồ tiêu, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt chất sinh học của lá trầu không, ứng dụng của lá trầu không. Quy trình thực nghiệm sản xuất lá trầu không trong quy mô phòng thí nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Ths Phạm Thế Chớnh đó tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học trường ĐHKH

đã trực tiếp truyền thụ cho chúng em những kiến thức nền tảng hết sức quan trọng trong thời gian học tập tại trường, và đã tạo cho em những điều kiện thuận lợi để chúng em có điều kiện nghiên cứu những mảng kiến thức bổ ích và quý báu

Em xin cảm ơn những người bạn, những anh chị đã cho những ý kiến đóng góp quan trọng trong quá trình tìm hiểu vấn đề

Mặc dự đó cố gắng nhưng trong bài không tránh khỏi những sai sót và khiếm khuyết, em rất mong được sự đóng góp của thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Thỏi Nguyờn, ngày 18 tháng 4 năm 2011

Sinh viên

Hoàng Thị Thanh

MỤC LỤC

2.4 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.) 19

MỞ ĐẦU

Trầu không là cây vườn quen thuộc gắn liền với văn hóa Việt Nam từ ngàn xưa, đã đi vào nhiều câu chuyện và dân ca khắp mọi miền của đất nước Người ta sử dụng lá trầu không để ăn và làm thuốc trong y học dân tộc Tập tục

ăn trầu là một nét văn hóa đặc trưng của lễ tết Việt Nam cũng như nhiều dân tộc phương đông khác như Srilanka, Ấn Độ, Malaysia _ lá trầu được xem là biểu tượng của lòng tôn kính, sự may mắn và hòa hợp Trong y học dân gian, người ta dựng lỏ trầu không giã nhỏ, cho thêm nước sôi vào dùng để rửa những vết loét, mẩn ngứa Nước pha lá trầu không chữa bệnh viêm kết mạc…

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không đã được nghiên cứu tại một số quốc gia trên thế thế giới, và đã phân lập được một số hợp chất quý,

có vai trò sinh học quan trọng Theo “Nghiờn cứu thành phần hóa học và hoạt

chất sinh học của lá trầu miền Bắc” của ThS Phạm Thế Chớnh đó phân lập

được egeunol là thành phần chính trong tinh dầu miền Bắc Thành phần hóa học chủ yếu của trầu không philippine là chavibetol và chavibetol axetat Trầu không

Ấn Độ thì eugenol và hydroxychavicol là thành phần chính

Ở Việt Nam chưa có nhiều số liệu công bố về các thành phần hóa học của trầu không, hơn nữa những bài thuốc trong dân gian sử dụng lá trầu không để chữa bệnh chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm về thành phần hóa học nào tạo nên hoạt tính đó, vì vậy cần phải nghiên cứu kỹ thành phần hóa học của lá trầu Đó là

lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết kém

phân cực của lá trầu khụng”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VỀ THỰC VẬT HỌ HỒ TIÊU (PIPERACEAE)

Piperaceae được biết đến là họ hồ tiêu, hiện được xếp là một họ rộng của các thực vật có hoa Nhóm này bao gồm khoảng 3610 loài thuộc 5 chi chính:

Piper, Piperomia, Zippellia, Manekia, Verhuellia Phần lớn những cây hồ tiêu có

thể tìm thấy trong 2 chi chính là: Piper (2000 loài) và Peperomia (1600 loài)

Các thành viên của Piperaceae là những cây nhỏ, những bụi cây, hoặc các loại

thảo mộc [21] Thân: cỏ hay dây leo nhờ dễ bám; Lá: đơn, nguyên, mọc cỏch, cú

hay không có lá kèm Phiến lá hình tim hay hình trứng, gân lá hình chân vịt hay

lông chim; Cụm hoa: giộ không phân nhánh mọc ở nách lá hay đối diện với lá

Mỗi hoa mọc ở nách một lá bắc, xếp theo đường xoắn ốc và thường áp sát vào

trục hoa; Hoa: trần, lưỡng tính, cũng có thể là đơn tính, mẫu 3 với 2 vòng nhị;

Bộ nhị: 6 nhị đớnh trờn 2 vòng, nhưng số nhị thường giảm do trong vòng có thể

mất đi hoàn toàn hoặc một phần; Bộ nhụy: thông thường là 3 noãn, nhưng cũng

có thể là 4 hoặc 5 noãn, hợp thành một bầu ô; Qủa: mọng, chứa một hạt, hạt có

nội nhũ và ngoại nhũ [4]

Cỏc cây tiêu biểu trong họ:

+ Rau càng cua: Piperomia Pellucida dùng làm rau ăn.

+ Trầu: Piper Betel L thõn, lá, quả chữa nhức mỏi, đau dạ dày, ăn không

tiêu

+ Lá lốt: Piper lolot C.DC toàn cây chữa phong hàn, rối loạn tiêu hóa + Tiêu dài: Piper Longum L quả trị đau bụng, tiêu chảy, nước rễ sắc chữa

bệnh viêm phế quản, ho, cảm lạnh

+ Tiêu: Piper Nigrum L dùng làm gia vị [4]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ CHI HỒ TIÊU

Chi hồ tiêu (piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1200 loài, phân bố chủ yếu

ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới điển hình Trong vùng Đông Nam Á có khoảng 400 loài Ở nước ta, theo Phạm Hoàng Hộ (1991) chi hồ tiêu có khoảng

40 loài, thường là những cõy thõn bụi, thân thảo và cây dây leo Lá mọc so le, nguyên hay chẻ ba Cụm hoa bụng tỏn, hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, không có bao hoa, xếp thành bông dày đặc và dài, hoa có hai nhị đớnh trờn trục hoặc ở gốc bầu Quả mọng dời không có cuống hoặc có cuống, chỉ có một hạt có phôi nhũ to [2]

1.3 KHÁI QUÁT VỀ CÂY TRẦU KHÔNG

Trầu không có tên khoa học là Piper betle L thuộc họ hồ tiêu

(pipieraceae) Ngoài ra ở những vùng khác nhau lại có tên khác nhau như: trầu lẹt (Huế), trầu cay, trầu lương, hruố eehang (Buụn Mờ Thuột), mụ-lu

(Campuchia), piper betle, vine piper (Anh), bétel (Pháp)…

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Trầu không là loại cây lâu năm, là loại dây leo bám, cành hình trụ nhẵn có khía dọc, bén rễ ở những mấu, lá mọc so le, hình tim tròn, gốc đôi khi hơi lệch, đầu nhọn dài khoảng 10 đến 13cm, rộng 4,5 đến 9cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm búng, gõn nổi rất rõ ở mặt dưới Cuống lá có bẹ kéo dài, cụm hoa mọc buông thõng ở kẽ lá thành bông ngắn Lá bắc tròn hoặc hình trái xoan, hoa đực dài có cuống, có lông, hoa cái dài khoảng 5cm, cuống phủ lông dày, bầu có lông

ở đỉnh, quả mọng và tròn Toàn thân có tinh dầu thơm, cay [1,6]

Hình 1: Hình ảnh cây trầu không Piper betle L.

1.3.2 Nguồn gốc và phân bố

Trầu không có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng từ

2500 năm trước, sau đó lan sang Madagasca và Đông Phi Ở Trung Quốc, trầu không cũng được ghi chép từ đời nhà Tần 618-907 sau công nguyên Đầu thế kỷ

XV cây bắt đầu được đưa sang Châu Âu Ngày nay trầu không được trồng phổ biến ở khắp các nước nhiệt đới vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanka, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, philippine, Việt Nam, Trung Quốc…

Ở Việt Nam, trầu không cũng được nhắc đến trong truyện cổ tích “Trầu- Cau” từ thời vua Hùng, cách đây 2000 năm Hiện nay trầu không được trồng khắp nơi (trừ vùng cao núi lạnh, trên 1500 m) Việc trồng trầu không ở Việt Nam cũng như các nước Châu Á thường gắn liền với tục ăn trầu của người dân [1]

1.3.3 Thành phần hóa học của trầu không

Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [25]:

Axit nicotinic 0,63-0,89 mg/100g Iot 3,4 μg/100g

Vitamin C 0,005-0,01% Tinh dầu 0,08-0,2%

Vitamin A 1,9-2,9mg/100g Năng lượng 44 kcal/100g

Theo nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy, trong thành phần hóa học của trầu không có chứa một số hợp chất tecpenoit

Qua khảo sát thành phần hóa học tinh dầu trầu ở 3 vùng miền của Việt Nam cho thấy thành phần thay đổi theo cỏc vựng miền địa lý: tinh dầu trầu miền Bắc có hàm lượng các hợp chất tecpen thấp, còn tinh dầu trầu miền Nam trong thành phần chính chỉ có một xiclic monotecpenoit là (R)-(-)-p-ment-1-en-4-ol (terpinen-4-ol), với hàm lượng 19,28% Trong khi đó tinh dầu trầu miền Trung

hàm lượng secquitecpenoit chiếm tới 25,6% bao gồm: δ-cadinen (1) , γ-cadinen

(2), α-cadinol (3) và monotecpenoit là terpinen-4-ol (4) [8, 9]

1.3.3.2 Các hợp chất phenolic (polyphenol)

Phenylpropenoit (C6-C3) là những hợp chất có một nhân benzen liên kết với gốc allyl, và nhân benzen liên kết với ít nhất một nhóm hydroxy ở dạng tự do hoặc liên kết với một nhóm chức khác như ete, este

Trong nhiều tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của trầu không

piper betle cho thấy thành phần chính là eugenol và các dẫn xuất của nó Như

trong công trình nghiên cứu của Lê Thanh, Nguyễn Xuân Dũng và Piet A Leclercq đã nghiên cứu và xác định được thành phần chính của tinh dầu trầu

trồng ở Huế là eugenol (10) [9] Phạm Thế Chính cũng đã phân lập được eugenol

là thành phần chính lớn nhất trong tinh dầu trầu miền Bắc [3] Như vậy tinh dầu trầu không còn là nguồn nguyên liệu để sản xuất eugenol, một đơn hương quớ, là nguyên liệu đầu cho tổng hợp các đơn hương và định hương khác phục vụ cho công nghiệp hương liệu

Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không Philippine do AgnesM.Rimando và các cộng sự nghiên cứu đã phân lập được các thành phần chính trong tinh dầu trầu và các chất hòa tan trong ete Thành phần

chính của tinh dầu trầu là: chavibetol (5) , metyl chavibetol (6), allylpyrocatechol

(7), safrole (8), chavibetol acetate (9), eugenol (10), allylpyrocatechol điaxetat (11) và một số chất khác với hàm lượng nhỏ Thành phần chính của các chất hòa

tan trong ete là allylpyrocatechol (2.38%) Như vậy thành phần chính của tinh

dầu trầu là các hợp chất phenol và tecpen, tỷ lệ của chúng khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của lá trầu Chavibetol được coi là thành phần đặc trưng của trầu Philippine, tuy nhiên tinh dầu trầu Ấn Độ thì eugenol lại là thành phần chính (30-90%) [11]

Nghiên cứu của Pitchaon Maisuthisakul, Ph.D về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic từ lá trầu cho thấy thành phần các chất chứa trong lá trầu có tác dụng này là chavicol, chavibetol, chavibetol axetat và eugenol [27]

O O

Theo nghiên cứu của M.Nagabhushan và các cộng sự cũng đã nghiờn cứu

và phân lập được eugenol - thành phần chính của tinh dầu trầu [23]

Cũng theo nghiên cứu khác của S Bhattacharya cựng các cộng sự đã phân lập được allylpyrocatechol từ dịch chiết etanol của lá trầu không tại Ấn Độ và ứng dụng nó để chống lại bệnh viêm loét dạ dày, bằng cách thử nghiệm trên chuột [29]

Tại Ấn Độ, K.Ghosh và T.K.Bhattacharya cũng đã nghiên cứu thành phần

hóa học của trầu không Piper betel Linn, phân lập được một số hợp chất chính

trong đó có hợp chất phenolic là 4-allyl resorcinol (12) Hợp chất này thu được

từ cặn chiết etylaxetat của rễ cây trầu [17]

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic trong trầu không, Amonkar cựng cỏc cộng sự đã phân lập được

chavicol (13) là thành phần chính trong tinh dầu trầu Nú cũn được coi như là

Zing H.W cựng cỏc cộng sự đã phân lập được piperol A (14), piperol B

(15), piperbetol (16), metylpiperbetol (17) từ lá trầu không Piper betle L có khả

năng ức chế sự quần tụ huyết tố hình dĩa của thỏ, được gây kích thích bằng nhân

tố hoạt hóa huyết tố hình dĩa (PAF) trong sự phụ thuộc vào nồng độ Hơn nữa, piperbetol, metylpiperbetol, piperolA, và piperol B không làm ảnh hưởng đến thành phần cAMP trong các thành phần còn lại của huyết tố hình dĩa [34]

H 3 CO

H3CO

HO

OCH3O

H H

H3CO

HO

AcO

OCH 3 O

1.3.3.3 Các hợp chất ankaloit

Ankaloit là một nhóm hợp chất thiên nhiên mà hầu hết là các dị vòng chứa nitơ, có tính bazơ, có trong một số sinh vật nhất định Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã phân lập và xác định được một số ankaloit từ cây trầu không

K.Ghosh và T.K.Bhattacharya nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ

cây trầu không piper betle Linn và phân lập được Aristololactam (18) từ phân

đoạn benzen _ ete dầu [17]

Ngoài ra, năm 2009, C.M.Lim, G.C.L.Ee cựng cỏc cộng sự khỏc đó phân

lập được 6 alkaloit từ trầu không ở Malaysia: Pellitorine (19),

(E)-1-[3’,4’-(methylenedioxy) cinnamoyl]-piperidine (20), Cepharadione A (21), tetradecadienoic acid isobutyl amide (22), Piperine (23), piperolactam D (24)

2,4-[16]

O HO

MeO

NH

1

3 4 5

7 8

9

2

6 10

(18)

O

NH

1 2 3

4 5

H H H H H

(23) (24)

1.3.3.4 Steroit và axit béo từ trầu không

Theo nghiên cứu về thành phần hóa học của của thân cây trầu piper betle

do Yan Yin, Xiang Zhong Huang và các cộng sự nghiên cứu, sử dụng các kỹ thuật sắc ký đã phân lập và tinh chế được 9 hợp chất Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa trên cơ sở phân tích quang phổ Kết quả đã phân lập được

9 hợp chất từ các phân đoạn ete dầu hỏa và phân đoạn etylaxetat của dịch chiết axeton 70% Trong 9 hợp chất đú cú cỏc hợp chất steroit là: 6β-

hydroxystigmast-4-en-3-on (25), β-sitosterol (26), stigmasterol (27) Đây là lần

đầu tiên phân lập được steroit từ cây xanh [33]

Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của K.Ghosh và T.K.Bhattacharya về thành phần hóa học của rễ cây trầu không Ấn Độ, đã phân lập được hợp chất steroit là

1.4 GIÁ TRỊ TRUYỀN THỐNG VĂN HÓA, CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TRẦU KHÔNG PIPER BETLE L.

1.4.1 Tục nhai trầu- một nét đẹp văn hóa

Ngày xưa người Việt thường có thói quen ăn trầu và đã trở thành phong tục Tục ăn trầu tương truyền có từ thời vua Hùng và gắn liền với chuyện cổ tích

“trầu cau” Miếng trầu gồm có 4 nguyên liệu: cau có vị ngọt, lá trầu không có vị cay, rễ chay có vị đắng, và vôi tôi có vị nồng, đôi khi người ta cho thêm cả sợi thuốc lá Ăn trầu thể hiện nếp sinh hoạt mang đậm tính dân tộc độc đáo của người Việt Nam, ăn trầu làm thơm miệng, chắc răng, hạ khí, tiêu cơm

“Miếng trầu là đầu câu chuyện”- là thay cho lời mở đầu nồng nàn để mọi câu chuyện trở lên gần gũi và thân thiết hơn

1.4.2 Công dụng của trầu không trong y học cổ truyền

Trầu không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh : phế tỳ,

vị, có tác dụng trừ phong thṍp, chụ́ng lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiờu viờm, sát trùng

Y học dân gian nhiều nước có kinh nghiệm dùng nước sắc lá trầu để rửa vết thương và những chỗ lở loét ngoài da Y học Ayurveda sử dụng lá trầu làm thuốc kích dục Tại Malaysia, lá trầu được dùng chữa đau đầu, viêm khớp Ở Thái Lan, trầu chữa đau răng Ở Indonesia, dõn gian dùng trầu làm thuốc kháng sinh, kháng khuẩn, diệt nấm Lá trầu có thể được dùng để xông hơi, hít qua mũi

để trị nhức đầu, làm thông mũi hoặc sát trùng đường hô hấp Ngoài ra, tinh dầu trầu cũng được dùng trong công nghệ sản xuất dược phẩm, nước hoa, làm sạch miệng hoặc chất tẩy mùi [6]

Ở Ấn Độ, lá và tinh dầu trầu không được dùng điều trị các bợ̀nh xuṍt tiờ́t, bệnh phổi và làm thuốc đắp, thuốc súc miệng hoặc thuốc ngửi trong bệnh bạch hầu Lá trầu không có trong thành phần chế phẩm thuốc cổ truyền Ấn Độ phối hợp với một số dược liệu khác trị hen phế quản

Ở Việt Nam trầu không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sõu kiờ́n đụ́t, viờm quanh răng, viêm tai, viêm họng Ngày dùng 8 – 16g, dưới dạng thuốc sắc Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa

Lá trầu không và gừng sống ép lấy nước chữa ho, kho thở, đầy bụng Nước ép lá trầu không nhỏ vào tai chữa đau tai Súc miệng hàng ngày với nước có dịch ép lá trầu không phòng được viêm họng, có tác dụng hổ trợ các thuốc chữa bệnh bạch hầu Lá trầu không và lá ráy, giã nhỏ, hơ nóng, đắp chữa sưng tấy Trầu không (3 – 5 lá), hạt cau (1 hạt) phơi khô, tán bột rắc làm thuốc cầm máu Lá trầu không (2 – 4 g), nhai nuốt nước chữa đau bụng lạnh dạ, tiêu chảy, nôn mửa, không tiêu [6]

1.4.3 Hoạt tính sinh học của trầu không

Trong trầu không có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Như trong nghiên cứu của T.Nalina và Z.H.A.Rahim đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia

lên vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans

ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với

nồng độ ức chế thấp nhất 1:5000 [25]

Trầu không có tác dụng kháng Entamoeba histolytica phân lập từ bệnh phẩm Tinh dầu diệt động vật nguyên sinh Paramaecium caudatum với độ pha

loãng đến 1:10.000 Trầu không có tác dụng diệt nấm mạnh đối với 24 chủng

Trichophyton rubrum, 3 chủng T mentagrophytes, 3 chủng T tosurans, 1 chủng

T verrucosum, 4 chủng Microsporum canis, 2 chủng M gypseum và 2 chủng Epidermophyton floccosum [1].

Trầu không có tác dụng chống co thắt trờn mụ cơ trơn, ức chế sự tăng quá mức của nhu đụ̣ng ruụ̣t, gõy trung tiện, có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương ở động vật có vú Liều chết có tác dụng gây mê sâu và gây chết sau vài giờ Trầu không đã được đánh giá về tác dụng làm giảm trạng thái căng thẳng về thần kinh ở người và có tác dụng tốt trên bệnh nhân hen phế quản Piperbetol, methylpiperbetol, piperol A và piperol B, phân lập từ trầu không, ức chế đặc hiệu sự kết tập tiểu cầu thỏ gây bởi yếu tố hoạt hoá tiểu cầu một cách phụ thuộc vào nồng độ Liều ức chế IC50 của các chṍt trờn và ginkgolid B vào khoảng 18,2; 10,6; 114,2; 11,8 và 4,8 àmol/lít, tương ứng Hoạt lực ức chế của ginkgolid B bằng khoảng 2,8; 1,2; 22,8 và 1,4 lần lớn hơn của piperbetol, methylpiperbetol, piperol A và piperol B Các kết quả nghiên cứu cho thấy piperbetol, methylpiperbetol, piperol A và piperol B là những chất đối kháng với cụ thể của

yếu tố hoạt hoá tiểu cầu in vitro [34].

Cao cụ̀n cuụ́ng lá trầu không cho chuột cống trắng cái uống 4 liều khác nhau (250 – 1000 mg/kg/ngày), trong những ngày 1 – 10 sau khi giao hợp, có tác dụng chống làm tổ phụ thuộc vào liều Với liờ̀u uụ́ng 1g/kg, tỷ lệ ức chế làm tổ 90% Tác dụng chống làm tổ do hoạt tính kháng steroid của cao trầu không Đồng thời trọng lượng tử cung giảm, và cùng với tác dụng chống làm tổ, có thể trầu không tác động đến sự tiết hoặc việc sử dụng progesteron Cao cụ̀n cuụ́ng lá trầu không được cho chuột cống trắng đực uống với liều 800 – 1500 mg/kg, và cho chuột nhắt trắng đực uống với liều 50 – 100 mg/kg trong 60 ngày liên tục để nghiên cứu về tác dụng trên khả năng sinh sản và những thông số về hormon nam tính khác trên các cơ quan sinh sản nam Những kết quả nghiên cứu gợi ý về tác dụng ức chế sự sinh tinh trùng hoặc kháng androgen của trầu không ở chuột [29]

Trong thử nghiệm về tác dụng gõy biờ́n trạng gen gián phân, sự trao đổi

chéo, và đột biến ngược trên những chủng lưỡng bội của Saccharomyces

cerevisiae cho thấy cao nước lá trầu không không gây sự đột biến ở men khi

không có sự hoạt hoá chuyển hoá, không làm tăng tõ̀n suṍt những thờ̉ biờ́n trạng, thể tái hợp và thể đột biến ngược, khụng gõy chờ́t tế bào và không ức chế sự phân chia tế bào Việc đánh giá hàm lượng DNA ở nhân các tế bào tuyến ở dạ

dày chuột nhắt trắng in situ bằng phương đo quan tế bào cho thấy sự biến đổi có

ý nghĩa của hàm lượng trung bình DNA sau thời gian dài (6 – 10 tháng) nhai lá trầu không với hạt cau và vôi tôi

Cao nước lá trầu không chế thành thuốc mỡ có tác dụng làm vết thương ở thỏ chóng lành do thúc đẩy nhanh sự co và sự biờ̉u mụ hoá vết thương, ít ảnh hưởng đến sự tạo mô hạt Mỡ trầu không chứa 1% cao trầu không đã được áp dụng cho 18 bệnh nhân bỏng vôi từ độ hai tới độ ba Kết quả 7 bệnh nhân bỏng 6 – 18% khỏi sau 10 – 15 ngày, 7 bệnh nhân bỏng 40% khỏi sau 25 – 38 ngày, 4 bệnh nhân bỏng 25 – 46% khỏi sau 54 – 124 ngày Mỡ trầu không 1% có tác dụng tốt trị bỏng độ hai nông và sâu, và có tác dụng hạn chế đối với bỏng độ ba Dùng uống, trầu không làm giảm sốt ở một số bệnh nhân bỏng [1]

Thuốc đắp khụng gõy xót và phản ứng phụ khác Tinh dầu trầu không có tác dụng kích ứng trên da và niêm mạc, và gây phản ứng viêm khi tiêm dưới da hoặc bắp thịt Lá trầu không có tác dụng chống oxy hoá; đun nóng với dầu, mỡ,

bơ, ngăn chặn được sự ôi khét Tác dụng này do phenol, đặc biệt là hydroxychavicol có trong trầu không Ảnh hưởng vờ̀ mụ bợ̀nh học của việc nhai lá trầu không, hạt cau, với thuốc lá đã được nghiên cứu trên chuột nhắt trắng với

mô hình niêm mạc tuyến dạ dày: cho chuụ̣t uụ́ng liên tục trong 5 tháng cao chiết từ thuốc lá với lá trầu không, hạt cau và vôi với liều thường dùng của người nghiện nhai trầu, nhận thấy có hiện tượng dị sản ruột rõ rệt ở tất cả chuột Tác dụng này chủ yếu do thuốc lá; trầu không và vôi có tác dụng bảo vệ làm giảm hiện tượng dị sản và loạn sản do thuốc lá Các kết quả thí nghiệm làm sáng tỏ nguyên nhân của hiện tượng người nhai trầu thường xuyờn với thuốc lá khối lượng lớn dễ mắc bệnh ung thư [1]

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 MẪU THỰC VẬT

Nguyên liệu thực vật là lá trầu thu hoạch vào tháng 2 năm 2009 tại Hải Dương Tên khoa học được giám định tại Phòng thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 5 kg nguyên liệu tươi được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô ở điều kiện thường sau đó sấy ở nhiệt độ 40-450C đến khụ giũn rồi nghiền nhỏ thu được 1kg bột mịn khụ, dựng để nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không

Dung môi n-hexan kỹ thuật được rửa bằng axớt H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng nước cất đến pH = 7, làm khô bằng Na2SO4 khan và cất lấy ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 67- 680C

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được chạy trên những bản nhụm trỏng sẵn sili cagel 60F254 độ dầy 0,2 mm của hãng Merck

Các sắc kí đồ lớp mỏng được nhận bằng thuốc thử vanilin/H2SO4đ 1% (dùng để nhận biết cỏc nhúm chất như steroit, tecpenoit, các chất màu, chất sỏp…) được điều chế như sau: cho 0,2g vanilin vào 10 ml H2SO4 đặc 98% khuấy đến cho tan hết, thu được dung dịch thuốc thử Thuốc thử FeCl3 5% trong etanol (dùng để nhận biết các hợp chất phenolic)

Chất hấp phụ dùng trong quá trình sắc kí cột là silicagel cỡ hạt 0,063 mm của hãng Merck

2.3 NHIỆM VỤ, PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nhiệm vụ của đề tài

-Khảo sát SKLM để tìm được hệ dung môi tối ưu cho sắc ký cột

- Phõn lập các chất từ cặn chiết M

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Dựng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để phân tích, phân lập và nhận biết các chất

Kết hợp các phương pháp phổ để xác định công thức cấu tạo các hợp chất phân lập được: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC)

2.3.3 Thiết bị nghiên cứu

- Dung môi được loại trờn mỏy cất quay chân không RV-10 control D của Đức

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trờn mỏy Impac 410-Nicolet FT-IR

- Phổ khối lượng LC-MS (70eV) được ghi trờn mỏy

LC-MS-OBBITRAP-XL hãng Thermo SCIENTIFIC-USA

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, 13

C-NMR-DEP-135, 13C-NMR-DEP-90, HSQC, HMBC, được ghi trờn mỏy Brucker

Advance-500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz

2.4 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.)

Ngâm 1000g bột củ bột lá trầu khô trong 2 l metanol trong ba ngày ở nhiệt

độ phòng Lọc Butsne lấy dịch và ngõm thờm 2 lần nữa Gộp dịch lọc, loại bớt metanol dưới áp suất giảm đến còn 600 ml Thêm nước để nồng độ metanol là 60% Chiết 5 lần bằng n-hexan, mỗi lần 100 ml thu được cặn n-hexan (cặn H) Thêm nước vào dịch bị chiết đến 50% metanol, chiết 5 lần bằng diclometan, mỗi lần 100 ml, thu được cặn diclometan (cặn M) Pha loãng dịch đến nồng độ

cặn etyl axetat (cặn E) và dịch metanol-nước (cặn W) Làm khô các dịch chiết bằng Na2SO4 khan, rồi loại dung môi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng H, M, E, W trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hiệu suất của các cặn chiết thu được từ lá trầu so với trọng lượng

khô

Cặn chiết n-hexan

(H)

Diclometan (M)

Etylaxetat (E)

Cặn nước (W)

2.5 KHẢO SÁT CÁC CẶN CHIẾT LÁ TRẦU BẰNG SKLM

2.5.1 Các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Kỹ thuật đưa chất lên bản mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn chiết nghiên cứu

hòa tan bằng dung môi thích hợp (sử dụng dung môi dễ bay hơi để hòa tan chất) sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quá đặc Sau đó dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên bản mỏng sao cho vết chất phải tròn, gọn, cỏch mộp trờn của bản mỏng 0,5 cm; cỏch chõn bản mỏng 0,7 cm; vệt chất nọ cách vệt chất kia 0,5 cm Phải làm khô vệt chất trước khi chấm thêm chất mới lên bản mỏng, nhưng không đưa quá nhiều chất lên bản mỏng Triển khai với hệ dung môi khi vệt chất đã hoàn toàn khô

Tiến hành SKLM: Pha hệ dung môi với tỉ lệ thích hợp cho vào bình sắc kớ cú

nỳt nhỏm và lắc kĩ Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi Lượng dung môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất

Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một góc 150 Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai Khi tiền tuyến dung môi cỏch mộp trờn 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra Làm khô bản mỏng, sau đó hiện sắc phổ dưới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện vanilin/H2SO4đ 1% và FeCl3

• Sắc ký lớp mỏng cặn chiết M

Tiến hành sắc ký lớp mỏng cặn chiết M, tìm được hệ dung môi tối ưu là diclometan 100%, phát hiện vệt chất bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và bằng FeCl3 5% Kết quả thu được trong bảng 3.2 chương 3 - kết quả và thảo luận

• Sắc ký lớp mỏng cặn chiết E

Sắc ký lớp mỏng cặn chiết E với hệ dung môi triển khai là n-hexan: etyl axetat 1:1 v/v, phát hiện vệt chất trên lớp bản mỏng bằng thuốc hiện vanilin/H2SO4 1%, và bằng FeCl35% Kết quả thu được trong bảng 3.3 chương 3

- kết quả và thảo luận

2.6 NGHIấN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CẶN CHIẾT M

• Chuẩn bị cột sắc ký

Cột sắc ký được dựng cú khúa kớn ở dưới, chiều dài 120cm, đường kính 3cm Rửa sạch cột bằng hỗn hợp axit sunfocromic, rửa lại bằng nước cất rồi tráng bằng cồn, làm khô cột Khóa cột phải được tra mỡ silicon để đảm bảo xoay chuyển dễ dàng

• Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt

Cân 150g silica gel (cỡ hạt 0,040-0,063mm của hãng Merck) hòa với 200

ml n-hexan trong cốc thủy tinh dung tích 500ml Khuấy đều đến khi trong cốc không còn bọt khí Mở khóa cột và đổ nhanh hỗn hợp sili cagel trong dung môi n-hexan lên cột Dùng quả bóp cao su gõ nhẹ lên cột nhiều lần cho các hạt sili

• Tiến hành sắc ký cột

Mở khóa dưới cho dung môi n-hexan ra khỏi cột cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel 2 mm Cho toàn bộ mẫu đã chuẩn bị ở trên lên đầu cột Bề mặt của lớp sili cagel tẩm mẫu ở phía trên và lớp sili cagel nhồi cột phía dưới phải đảm bảo tạo thành một mặt phẳng ngang so với cột để trong quá trình rửa giải chất xuống đều, cho hiệu quả phân tách cao Rắc một lớp mỏng silica gel lên trên, rồi phủ một lớp bông thủy tinh để trỏnh cỏc khuếch tán ngược

Tiến hành rửa giải bằng dung môi diclometan Tốc độ rửa giải là 25 giọt/ phút Kết quả thu được 150 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 4 ml

Các phân đoạn thu được đem tiến hành khảo sát lớp mỏng bằng dung môi diclometan, gom các phân đoạn có sắc phổ giống nhau thành nhóm và đánh số thứ tự cỏc nhúm T0 cho đến T6

Nhóm T3 hiện 2 vệt màu vàng và màu hồng khi khảo sát SKLM với dung môi diclometan, do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành sắc ký cột lần 2 để tách 2 chất này Sử dụng cột sắc ký có chiều dài 80cm, đường kính 1,5cm, với dung môi rửa giải là diclometan Thu được 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 4ml Gom những phân đoạn có sắc phổ giống nhau, thu được 3 nhóm:

+ T 1 là chất lỏng màu vàng sáng, khối lượng 1,30g.

IR (Film): νmax cm-1 3571 (OH); 2941, 1131 (OCH3); 2849 (CH2); 1638,

1594, 1443 (C=C thơm); 3083 (CH thơm); 760 (CH thơm) (xem phụ lục1)

1H-NMR (DMSO, δ, ppm): 3,25 (2H, d, 2H- 1’); 3,72(3H, d); 5,02(2H, m, 2H- 3’); 5,89 (1H, q, 1H-2’); 6,55 (1H, dd, J= 8; 1,8 Hz, 1H-5); 6,63 (1H, d, J=1,8 Hz, 1H-3); 6,81 (1H, d, J=8 Hz,1H-6); 8,8 (1H, s, 1H-OH-1) (xem phụ lục 3.1, 3.2)

13C- NMR (DMSO, δ, ppm): 145,99 (C-1); 146,48 (C-2); 115,83 (C-3); 132,3 (C-4); 118,83 (C-5); 112,37 (C-6); 38,89 (C-1’); 138,05 (C-2’); 115,21 (C- 3’); 55,68 (OCH3) (xem phụ lục 4)

+ CM 2 :là chất lỏng màu vàng nhạt, khối lượng 0,38g

1H-NMR (DMSO, δ, ppm): 6.95 (1H, d, J= 8,5 Hz, 1H- 2); 6,96-6,6 (1H, ddd, 1H- 3); 6,96- 6,6 (1H, ddd, 1H- 5); 6,95 (1H, d, J= 8,5 Hz, 1H-6); 2,23 (2H,

d, J= 7 Hz, 2H- 1’); 5,92- 5,87 (1H, m, 2H- 2’); 5,04- 4,97 (2H, m, 2H-3’); 9,18 (1H, s, 1H- OH) (xem phụ lục 6.1, 6.2)

13C- NMR (DMSO, δ, ppm): 155,52 (C-1); 129,27 (C-2); 115,13 (C-3); 129,69 (C -6); 115,13 (C-5); 129,69 (C-6); 38,68 (C-1’); 138,32 (C-2’); 115,13 (C-3’) (xem phụ lục 7.1, 7.2)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.)