05-NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY SÂM NGỌC LINH

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải Viện Sinh học Tây Nguyên TÓM TẮT Sâm Ngọc Linh thuốc quý Việt Nam, nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro trồng thử nghiệm giai đoạn vườn ươm trình bày Mơ sẹo cảm ứng mẫu củ sâm Ngọc Linh cắt mỏng môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 0,2 mg/l TDZ điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày Môi trường tốt cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp 0,2 mg/l TDZ Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA g/l than hoạt tính Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, mơi trường ½MS bổ sung 1,0 mg/l BA 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose, 2,0 g/l than hoạt tính đặt điều kiện ánh sáng đèn LED 70% đỏ 30% xanh tốt 1000 sâm in vitro sau tháng trồng khu vực vườn ươm cho thấy tốc độ sinh trưởng nhanh so với sâm Ngọc Linh gieo hạt với tỷ lệ sống sót 87% Từ khóa: chồi, LED, mơ sẹo, Panax vietnamensis, sâm Ngọc Linh, saponin, rễ ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Ngọc Linh loài sâm đặc hữu Việt Nam với tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv Dù biết đến từ năm 1973, qua nghiên cứu nhà khoa học nhận thấy sâm Ngọc Linh khơng có tác dụng dược lý đặc trưng chi Nhân sâm mà cịn có tác dụng điển chống stress, chống trầm cảm, tác dụng lên chống oxy hoá in vitro in vivo… Nhóm chất có tác dụng định đến tác dụng dược lý loài sâm saponin triterpenoic mà đại diện MR2, G-Rb1 GRg1 (Luan, 2003) Sâm Ngọc Linh loài sâm có hàm lượng saponin khung dammaran cao (khoảng 12 - 15%) lượng saponin nhiều so với loài khác chi Panax giới (Dong et al., 2007) Với đặc điểm đó, sâm Ngọc Linh khơng lồi sâm q Việt Nam mà giới Nhân giống sâm Ngọc Linh gặp nhiều khó khăn trồng khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh, thời gian nuôi trồng kéo dài từ đến năm củ tích trữ đủ hoạt chất để thu hoạch Nhân giống hữu tính theo cách thơng thường (gieo hạt) khơng cho kết cao nhiều lý do: khó thu nhận hạt, hạt gieo nằm đất sau thời gian dài nảy mầm, hạt bị lồi động vật, trùng gặm nhấm ăn…; ngồi tỷ lệ nảy mầm từ hạt đạt khoảng 30 - 40% Theo số liệu điều tra nhất, sâm Ngọc Linh bị khai thác mức dường khơng cịn thấy tự nhiên chúng nằm danh mục 250 loài quý cần bảo vệ Do đó, u cầu cấp thiết tìm kỹ thuật giúp nhân giống nhanh đem lại nguồn sinh khối có hiệu lấy từ lồi dược liệu Trước có số nghiên cứu nước thực nhằm nhân giống in vitro loài dược liệu này, nhiên hiệu nhân giống khả sống sót ngồi tự nhiên khơng có yếu không tạo củ phần gốc, áp dụng trồng thử nghiệm 100% chết (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) Chính vậy, kỹ thuật nuôi cấy in vitro, nghiên cứu quy trình nhân nhanh sâm Ngọc Linh có số lượng lớn với sức sống cao, rễ củ phát triển tốt, thích nghi tốt với mơi trường bên ngồi, góp phần cải thiện tái tạo lượng tự nhiên VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn mẫu in vitro Nguồn mẫu ban đầu củ sâm Ngọc 1211 Dương Tấn Nhựt et al Linh 10 năm tuổi (Hình 1a) Củ sau tách từ rửa nhẹ bơng thấm dung dịch Javen để vịi nước chảy Mẫu chuyển vào tủ cấy vô trùng tiếp tục lắc cồn 70% 30 giây, sau rửa lại từ đến lần nước cất vô trùng Tiếp tục lắc mẫu dung dịch HgCl2 0,1% có nhỏ vài giọt Tweens-20 (Polyoxyethylen sorbitan monolaurata) phút Tiếp theo, mẫu rửa lại nước cất vô trùng đến lần Củ cắt thành lát mỏng theo chiều ngang thành khoanh tròn, cắt bỏ phần bên ngồi củ, để lại phần lõi có kích thước cm x cm x mm (dài × rộng × dày) Cuối cùng, mẫu cảm ứng tạo mô sẹo mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 0,2 mg/l TDZ, nguồn mô sẹo tạo sử dụng cho thí nghiệm (Hình 1b) Nguồn mẫu ex vitro Cây sâm Ngọc Linh in vitro sau tháng nuôi cấy mang vườn ươm để khảo sát tỉ lệ sống sót, khả sinh trưởng phát triển Môi trường nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy môi trường thường sử dụng việc nghiên cứu số đối tượng sâm giới: môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) mơi trường SH (Schenk Hildebrandt, 1972) có bổ sung thêm 30 g/l sucrose, g/l agar, chất điều hịa sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4-D, NAA), cytokinin (TDZ, BA), tùy thuộc vào thí nghiệm bổ sung nồng độ khác Sau điều chỉnh pH môi trường từ 5,7 đến 5,8 Linh thực Nhựt đồng tác giả (2009) sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm Trong thí nghiệm này, chúng tơi khảo sát ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng mơi trường ni cấy với mục tiêu tìm mơi trường thích hợp để nhân nhanh mơ sẹo sâm Ngọc Linh thu sinh khối mô sẹo Mô sẹo tách cấy chuyền sang mơi trường nhân mơ sẹo có chứa 1,0 mg/l 2,4D TDZ (0,1 mg/l; 0,2 mg/l; 0,5 mg/l) (Hình 1b) Khảo sát mơi trường khống (MS, SH) lên khả tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh Môi trường SH thường sử dụng nuôi cấy thân thảo môi trường sử dụng ni cấy số lồi sâm giới Môi trường MS môi trường SH có thành phần vitamin, khống đa lượng vi lượng khác đáng kể Do đó, mục tiêu thí nghiệm so sánh ảnh hưởng mơi trường MS môi trường SH đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh in vitro Các mơ sẹo cắt với kích thước 1,0 x 1,0 cm cấy vào loại môi trường MS, SH bổ sung mg/l BA, mg/l NAA g/l than hoạt tính nồng độ BA/NAA nồng độ tốt Nhựt đồng tác giả (2009) Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh in vitro Phương pháp Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác (đèn neon, 100% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED đỏ, 90% ánh sáng LED đỏ 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LED đỏ 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ 30% ánh sáng LED xanh, 50% ánh sáng LED đỏ 50% ánh sánh LED xanh) với cường độ chiếu sáng 1500 lux lên sinh trưởng phát triển chồi rễ sâm Ngọc Linh, từ so sánh khác biệt tỷ lệ ánh sáng đèn LED nhằm tìm tỷ lệ ánh sáng đèn LED phù hợp có chồi sinh trưởng phát triển tốt Sau đó, chồi chuyển vào môi trường rễ (Nhựt et al., 2009) đặt điều kiện chiếu sáng khác để quan sát tiêu trọng lượng tươi, trọng lượng khô, số rễ, chiều dài rễ, số lá, đường kính chiều cao Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với TDZ đến khả nhân mô sẹo Khảo sát tỉ lệ sống sót khả sinh trưởng sâm Ngọc Linh ngồi vườn ươm Mơ sẹo thu từ củ ex vitro sâm Ngọc Vườn ươm trồng sâm Ngọc Linh in vitro Điều kiện nuôi cấy in vitro Nhiệt độ phịng ni 25±2°C, cường độ chiếu sáng khoảng 2500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, độ ẩm trung bình từ 75 80% Một số thí nghiệm sử dụng ánh sáng đèn LED (Light-Emitting Diod) xanh đỏ tỷ lệ khác ni cấy 1212 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 thiết lập khu vực núi Ngọc Linh thuộc xã Tê Xăng, huyện Tu Mơ Rơng, tỉnh Kom Tum, khu vực phân bố sâm Ngọc Linh điều kiện tự nhiên Cây sâm trồng, chăm sóc theo dõi thời gian tháng Kết thu nhận sau tuần nuôi cấy mô sẹo Bảng Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với TDZ đến khả nhân mô sẹo Xử lý số liệu 2,4-D (mg/l) TDZ (mg/l) Trọng lượng tươi trung bình (mg) Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1995) với P = 0,05 0,1 270c 0,2 520a 0,5 370b KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với TDZ đến khả nhân mô sẹo Mơ sẹo loại mơ phát triển khơng có tổ chức từ mẫu cấy thực vật, tạo thành q trình ni cấy in vitro giống với mơ phát sinh in vivo vết thương thực vật Tuy nhiên có khác biệt phát sinh hình thái, cấu trúc tế bào, phát triển chuyển hóa mô sẹo phát sinh nuôi cấy mô mô sẹo tạo từ vết thương thực vật tự nhiên Kỹ thuật nuôi cấy mô phát triển vào thập niên 20 nuôi cấy mô sẹo kỹ thuật sử dụng Rất thực vật không tạo mô sẹo sau xử lý (Yu KW, 2000) Những nghiên cứu đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin Đối với sâm Triều Tiên, nguồn mẫu hạt môi trường khởi tạo mô sẹo MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 0,01 mg/1 kinetin (Arya et al., 1993); từ trụ thượng diệp 1,0 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l kinetin (Lim et al., 1997) Có vài nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo sâm Ngọc Linh trước đó, đáng ý nghiên cứu Dung (1995) tìm mơi trường tạo mơ sẹo tái sinh chồi bất định Năm 2006, Nhựt đồng tác giả nghiên cứu môi trường nhân nhanh sinh khối mô sẹo, chồi, rễ bất định bước đầu định tính saponin sinh khối sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Trong nghiên cứu Nhựt đồng tác giả (2009) cho thấy trình khởi tạo mơ sẹo auxin phù hợp 2,4-D với nồng độ 1,0 mg/l Trong thí nghiệm sử dụng kết hợp auxin cytokinin với mục đích nhân nhanh sẹo Auxin sử dụng 2,4-D giữ nồng độ không đổi (1 mg/l) (Nhựt et al., 2009), thay đổi nồng độ cytokinin (TDZ) Chú thích: *: chữ khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Khối lượng mô sẹo ban đầu: 160 ± 10 (mg) Trong môi trường, mô sẹo tăng trọng từ 1,69 đến 3,25 lần so với trọng lượng tươi ban đầu Mô sẹo môi trường MS bổ sung mg/l 2,4-D kết hợp với 0,2 mg/l TDZ tăng trọng cao (tăng trọng 3,3 lần so với trọng lượng tươi ban đầu, đạt trọng lượng tươi trung bình 520 mg) Tuy nhiên, nhận thấy tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo thấp so sánh với kết thu Nhựt đồng tác giả (2009) Điều giải thích nguồn mẫu sử dụng ban đầu từ củ khác với trước nguồn mẫu từ Trong nhóm cytokinin, TDZ có hoạt tính sinh học mạnh cần sử dụng với nồng độ thấp môi trường nuôi cấy, đặc biệt vi nhân giống Như môi trường tốt môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp 0,2 mg/l TDZ cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo tốt nhất, trọng lượng tươi trung bình 520 mg, tăng trưởng 3,25 lần so với mẫu mô sẹo ban đầu Khảo sát mơi trường khống (MS, SH) lên khả tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh Hiện nuôi cấy mô thực vật, người ta sử dụng nhiều loại môi trường nuôi cấy khác tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy Môi trường MS môi trường giàu dinh dưỡng sử dụng phổ biến phịng thí nghiệm Bên cạnh người ta cịn sử dụng mơi trng MS bin i (nh MSẵ, MSẳ) v cỏc loi mơi trường khống khác Schenk Hildebrandt (1972), Gambord (1968), Linsmainer Skoog (1963), Knop (1974) Trong số nghiên cứu sâm, đặc biệt nghiên cứu Park đồng tác giả (2000) mơi trường SH lại tỏ hiệu để nuôi cấy 1213 Dương Tấn Nhựt et al rễ bất định Nhân sâm hệ thống bioreator Park đồng tác giả (2000) báo cáo số môi trường thử nghiệm mơi trường SH cho số rễ trung bình cao tăng trưởng rễ chịu ảnh hưởng mạnh chất điều hòa tăng trưởng thực vật muối môi trường thử nghiệm Han đồng tác giả (2006) báo cáo việc loại bỏ NH4NO3 khỏi mơi trường ni cấy làm tăng tỷ lệ tạo rễ bất định số lượng rễ mẫu cấy Nhân sâm Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường SH làm tăng hiệu tái sinh chồi sâm Ngọc Linh từ mô sẹo, điều mơi trường SH khơng có NH4NO3 Kết sau tuần ni cấy, nhận thấy khả tái sinh chồi loại môi trường MS SH cao thể bảng Tuy nhiên, số số lượng chồi/mẫu, trọng lượng tươi chồi môi trường SH vượt trội so với môi trường MS, đáng ý tiêu trọng lượng chồi môi trường SH thu mg cao gấp lần so với môi trường MS (Bảng 2) Chồi tái sinh môi trường SH có tỉ lệ hình thành đồng so với môi trường MS, xanh, xẻ thùy nhiều (Hình 1c) Bảng So sánh ảnh hưởng loại mơi trường khống MS SH lên khả tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh Môi trường Số lượng chồi/mẫu Trọng lượng chồi (mg) MS 6,3b 0,37b SH 7,5a 1,0a Chú thích: *: chữ khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Trong ni cấy nhiều lồi thực vật, để tăng cường sinh trưởng mẫu môi trường nuôi cấy phải bổ sung thêm vitamin, axit amin, loại dịch chiết chất điều hịa sinh trưởng thực vật Hầu hết mơ ni cấy có khả tổng hợp tất loại vitamin cần thiết không đầy đủ số lượng Vitamin có vai trị xúc tác q trình trao đổi chất diễn tế bào, muốn đạt sinh trưởng tối ưu mơ ni cấy nhà nghiên cứu thường đưa thêm vào môi trường số vitamin như: thiamin (vitamin B1), axit nicotinic (vitamin B3), vitamin B5, piridoxin 1214 (vitamin B6) Trong số vitamin B1 coi vitamin thiết yếu sinh trưởng biến dưỡng tế bào thực vật Sự phosphoryl hóa biến thiamin thành thiamin-pyrophosphat, chất cocarboxilase tương ứng với khử carboxyl acid cetonic Vitamin B1 tổng hợp hay chồi non (ánh sáng yếu tố thiết yếu) Do B1 có vai trị hình thành chồi từ mơ sẹo Myo-inositol (hay meso-inositol) đồng phần inositol, có vai trị quan trọng truyền tín hiệu hormon liên kết với auxin Như vậy, kết thu nhận từ thí nghiệm cho ta thấy khả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro môi trường SH tốt môi trường MS Điều lý giải hàm lượng vitamin môi trường SH cao nhiều so với môi trường MS đặc biệt môi trường SH khơng có mặt NH4NO3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh in vitro Các điều kiện chiếu sáng khác ảnh hưởng khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Kết thu sau tuần nuôi cấy chồi sâm bảng Qua bảng số liệu cho thấy, nghiệm thức phối hợp ánh sáng LED đỏ ánh sáng LED xanh với tỷ lệ khác kích thích tăng trưởng sâm Ngọc Linh in vitro Các tiêu theo dõi trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều cao cây, số đường kính nghiệm thức tỏ vượt trội so với nghiệm thức đối chứng (ánh sáng đèn neon) Trong đó, tỷ lệ phối hợp 30% ánh sáng LED xanh kết hợp với 70% ánh sáng LED đỏ giúp cho sinh trưởng phát triển tốt so với đối chứng (đèn neon) thể qua trọng lượng tươi, trọng lượng khơ, đường kính (Bảng 3) Kết cho thấy rằng, ánh sáng LED đỏ chiếm tỷ lệ cao chiều cao kéo dài phải có diện ánh sáng LED xanh cân đối phát triển bình thường Chiều cao đạt cao (6,25 cm/cây) điều kiện chiếu sáng 90% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh Tuy nhiên, thí nghiệm với 100% ánh sáng LED đỏ chiều cao đạt thấp (3,00 cm/cây), điều sâm tự nhiên sống tán rừng, việc hấp thụ ánh sáng có khác với trồng khác Trong đó, ánh sáng LED xanh lại Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 ức chế trình cảm ứng tạo rễ, điều kiện 100% ánh sáng LED xanh sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro hồn tồn khơng rễ (Bảng 3, Hình d1, d2, d3, d4, d5) Bảng Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro Điều kiện chiếu sáng Neon 100% B 100% R 50% B + 50% R 30% B + 70% R 20% B + 80% R 10% B + 90% R Trọng lượng tươi (g) 0,66d 0,32f 0,47e 0,81b 0,89a 0,72c 0,63d Trọng lượng khô (mg) 66,00e 31,00g 55,21f 118,50b 142,00a 88,45c 78,61d Số rễ 3,50e 1,50f 5,26d 6,50a 6,00b 5,72c Chiều dài rễ (cm) 1,35d 0,80e 2,20b 2,90a 2,25b 2,00c e d a a 3,21c b Số b 3,50 d f 3,50 b 2,50 g 3,00 c 4,00 a 4,00 Đường kính (cm) 3,10 2,05 1,90 3,40 3,90 3,50 3,00e Chiều cao (cm) 3,25f 3,50e 3,00g 4,50d 5,25c 5,40b 6,25a Chú thích: *: chữ khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test B = blue light; R = red light Hình Quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh in vitro a: sâm trồng Viện Sinh học Tây Nguyên; b: mô sẹo cảm ứng từ củ sâm; c: chồi sâm tái sinh từ mô sẹo; d1, d2, d3, d4, d5: sâm in vitro sinh trưởng phát triển điều kiện chiếu sáng khác 1215 Dương Tấn Nhựt et al Tanaka đồng tác giả (1998) nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng LED đỏ ánh sáng LED xanh lên tăng trưởng Địa lan nuôi cấy in vitro Sự tăng trưởng lá, hàm lượng chlorophyll, trọng lượng tươi chịu ảnh hưởng xạ đèn LED Ánh sáng LED đỏ thúc đẩy tăng trưởng làm giảm hàm lượng chlorophyll hàm lượng chlorophyll lại phục hồi ánh sáng LED xanh Trong nghiên cứu có gia tăng đáng kể tổng trọng lượng chồi rễ nuôi cấy ánh sáng LED đỏ ánh sáng LED xanh so sánh chúng với đèn huỳnh quang (đối chứng) Những nghiên cứu trước cho thấy ánh sáng LED đỏ có tác dụng kéo dài thân, mở rộng tổng hợp chlorophyll (Hoenecke et al., 1992) Trong nghiên cứu họ, trọng lượng tươi trọng lượng khô ánh sáng LED đỏ ánh sáng LED xanh, có giảm đặc biệt trọng lượng rễ hệ thống đèn có ánh sáng LED đỏ có ánh sáng LED xanh, đặc biệt hệ thống ánh sáng LED xanh Khảo sát tỉ lệ sống sót khả sinh trưởng sâm Ngọc Linh vườn ươm Vườn ươm đặt tán rừng địa hình hiểm trở, núi cao Vị trí vườn ươm có độ cao khoảng 1900 - 2000 m so với mặt nước biển nằm dọc theo bờ suối với diện tích 200 m2 Khu vực vườn ươm nằm hệ sinh thái đặc trưng cho kiểu rừng Á nhiệt đới núi cao với rừng kín thường xanh, hỗn giao, bao phủ lớp rêu, rừng có năm tầng lớp thảm mục dày Sâm Ngọc Linh tự nhiên thường phân bố thành quần thể tán rừng, dọc theo dịng suối, nơi có ẩm độ cao đất mùn nhiều; vậy, việc thiết lập vườn ươm nhân giống in vitro sâm thực địa điểm có hệ sinh thái tương tự nằm men theo bờ suối, nơi có lớp thảm mục dày độ ẩm cao Khu vực vườn ươm có khí hậu cao nguyên nhiệt đới gió mùa với hai mùa rõ rệt, mùa mưa từ tháng đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3, lượng mưa trung bình hàng năm từ 2500 - 3000 mm Nhiệt độ trung bình 15 - 18°C, độ ẩm 90%, cường độ ánh sáng đo vị trí thiết lập vườn ươm dao động từ - 15 µmol ngày (Hình 2b2) Thời gian tiến hành trồng vào tháng 12, đầu mùa khô năm 2009 Tổng số lượng sâm Ngọc Linh in vitro trồng vườn ươm 1000 (Hình 2a, Hình 2b1) Tiến hành đánh giá thu thập tiêu như: tỷ lệ sống sót cây, tỉ lệ nảy mầm cây, độ dài trung bình rễ, chiều cao trung bình chồi, tỷ lệ có hai chồi trở lên (hai tháng lần) Kết thu thập sau tháng trồng chăm sóc trình bày bảng (Hình 2c1, Hình 2c2) Một đặc điểm cần ý đánh giá việc trồng thử nghiệm sâm hầu hết sâm tạo môi trường in vitro đem trồng điều kiện ex vitro rụng lá, thân củ trạng thái ngủ nằm đất, từ thân củ sâm rễ, sau phát triển chồi Vì việc khảo sát thêm tỉ lệ sống sót thân củ cịn trạng thái ngủ đất cần thiết kết thể bảng Bảng Kết khảo sát tỉ lệ sống sót sinh trưởng sâm Ngọc Linh in vitro giai đoạn vườn ươm Thời gian thu số liệu Các tiêu theo dõi Tỉ lệ sống sót (%) Tỉ lệ nảy mầm (%) Độ dài TB rễ (cm) Chiều cao TB chồi (cm) Tỉ lệ có hai chồi trở lên (%) tháng sau trồng 91 66 2,22c 5,14c 31 tháng sau trồng 91 78 3,64b 8,14b 58 tháng sau trồng 87 87 6,48a 10,57a 73 Chú thích: *: chữ khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Kết cho thấy sau tháng trồng khu vực vườn ươm có điều kiện sinh thái nói trên, tổng số 1000 sâm Ngọc Linh in vitro trồng 1216 tự nhiên có 870 sống sót nảy mầm phát triển, chiếm tỉ lệ 87%, nhiều sau tháng đạt chiều dài chồi lên tới 14 cm (Hình 2d), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 đặc biệt có tới 730 có hai chồi củ trở lên chiếm tỉ lệ 73%, nhiều đạt – chồi củ sâm gieo hạt có chồi nhất, điều cho thấy tốc độ sinh trưởng sâm Ngọc Linh in vitro so với sâm gieo hạt nhanh Rễ sâm Ngọc linh in vitro sau tháng trồng với chiều dài trung bình rễ lên tới 10 cm dấu hiệu lạc quan cho phép sâm Ngọc Linh in vitro phát triển sinh trưởng tốt ngồi tự nhiên Hình Cây sâm Ngọc Linh in vitro đưa vườn ươm a: sâm in vitro đưa vườn ươm; b1, b2: sâm trồng thực nghiệm huyện Tu Mơ Rơng (Kom Tum); c1, c2: sâm chăm sóc vườn ươm; d: sâm sau tháng trồng vườn ươm 1217 Dương Tấn Nhựt et al Tỉ lệ sâm Ngọc Linh in vitro bị chết thấp (13%), có hai nguyên nhân chủ yếu dẫn đến bị chết giai đoạn vườn ươm xâm nhiễm nấm bệnh số giống chưa đạt yêu cầu Vì vườn ươm thiết lập khu vực núi cao lại khó khăn việc chăm sóc phịng ngừa sâu bệnh chưa thực tốt, nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống sót KẾT LUẬN Trong nghiên cứu chúng tơi thiết lập quy trình nhân nhanh sâm Ngọc Linh Từ nguyên liệu ban đầu củ sâm, sau cảm ứng tạo mô sẹo, môi trường tốt để nhân nhanh mô sẹo môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 0,2 mg/l TDZ Trong giai đoạn tái sinh chồi môi trường SH bổ sung mg/l BA, mg/l NAA cho kết cao Kết hợp với hệ thống chiếu sáng đơn sắc nuôi cấy sâm in vitro tỷ lệ 30% ánh sáng LED xanh kết hợp với 70% ánh sáng LED đỏ giúp chồi sinh trưởng phát triển tốt nhất, tỷ lệ 90% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh chiều cao đạt cao Đèn LED có tuổi thọ cao, cấu trúc đặc an toàn, phát nhiệt ít, tiêu thụ điện nên giảm giá thành sản xuất thương mại thay đổi nguồn chiếu sáng phù hợp với sinh trưởng giai đoạn phát triển sâm Với ưu điểm hệ thống đèn LED nguồn sáng phịng ni cấy sâm in vitro Những kết ban đầu khảo sát trồng thử nghiệm sâm vơ tính ngồi tự nhiên cho thấy tốc độ sinh trưởng phát triển sâm in vitro nhanh so với sâm gieo hạt với tỷ lệ sống sót nảy mầm lên đến 87% TÀI LIỆU THAM KHẢO Arya S, Arya IDI, Eriksson T (1993) Rapid multiplication of adventitious somatic embryos of Panax ginseng Plant Cell Tiss Org Cult 34: 157-162 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007) Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm NXB Khoa học Kỹ thuật: 109-110 Nguyễn Ngọc Dung (1995) Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) đường sinh học NXB 1218 Nông nghiệp: 43-100 Han JY, Kwon YS, Yang DC, Jung YR and Choi YE (2006) Expression and RNA interference-induced silencing of the damarenediol synthase gene in Panax ginseng Plant Cell Physiol 47: 1653-1662 Hoenecke ME, RJ Bula, TW Tibbitts (1992) Importance of "blue" photon levels for lettuce seedlings grown under redlight-emitting diodes Hort Sci 27: 427-430 Trần Công Luận (2003) Kết nghiên cứu hóa học sâm Việt Nam Hội thảo bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh tỉnh Quảng Nam: 62-75 Lim HT, Lee HS (1997) Regeneration of Panax ginseng C.A Meyer by organogenesis DNA analysis of regenerants Plant Cell Tiss Org Cult 49: 179–187 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol Plant (15): 473-497 Duong Tan Nhut, Bui Ngoc Huy, Pham Thanh Phong, Nguyen Thanh Hai, Tran Cong Luan (2006) Primary Study on Multiplication of Adventitious Roots of Panax vietnamensis – a Valuable Material Source for Saponin Isolation Biotechnology in Agriculture, Nong Lam University (NLU), Ho Chi Minh City, Vietnam: 118-121 Dương Tấn Nhựt, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Phạm Thanh Phong, Bùi Ngọc Huy, Đặng Thị Ngọc Hà, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Bùi Thế Vinh, Lâm Thị Mỹ Hằng, Dương Thị Mộng Ngọc, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận (2009) Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro bước đầu phân tích hàm lượng saponin TC Cơng nghệ sinh học 7(3): 365-378 Park SJ, SM Kim, MH Kim, CS Kim, CH Lee (2000) Development of a prototype continuous flow dryer using far infrared ray and heated-air for white ginseng J Korean Society Agril Machin 25(2): 115-122 Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot (50): 199-204 Tanaka M, Takamura T, Watanabe H, Endo, Yanagi T, Okamoto K (1998) In vitro growth of Cymbidium plantlets cultured under super bright red and ble light-emitting diodes (LEDs) J Hortic Sci Biotech 73: 39-44 Yu KW (2000) Production of the Useful Metabolites through Bioreactor Culture of Korean Ginseng (Panax Ginseng C A Meyer) Doctor Thesis Chungbuk National University Korea Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 MICROPROPAGATION OF PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV Duong Tan Nhut∗, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Truc, Nguyen Ba Nam, Tran Xuan Tinh, Vu Quoc Luan, Nguyen Van Binh, Vu Thi Hien, Trinh Thi Huong, Nguyen Cuu Thanh Nhan, Le Nu Minh Thuy, Ly Thi My Nga, Thai Thuong Hien, Nguyen Thanh Hai Tay Nguyen Institute of Biology SUMMARY Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) is one of precious medicinal plants in Vietnam In vitro propagation and ex vitro growth of Panax vietnamensis plantlets were studied The calli of Panax vietnamensis were successfully induced from rhizome explants on MS medium containing mg/l 2,4-D and 0.2 mg/l TDZ under 16h-photoperiod The highest callus biomass yield was obtained on MS medium supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D combined with 0.2 mg/l TDZ The highest number of shoots regenerated from calli was obtained on SH medium supplemented with 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA and 2.0 g/l active charcoal The most suitable medium and condition for plantlet formation were ½MS medium supplemented with 1.0 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose and 2.0 g/l active charcoal under lighting conditions of 70% red LEDs and 30% blue LEDs After months culture in the nursery, in vitro plantlets grew faster than seedderived plants in which the survival rate is 87% Keywords: callus, bud, LED, Ngoc Linh ginseng, Panax vietnamensis, root, saponins ∗ Author for correspondence: Tel: 84-63-3831056; Fax: 84-63-3831028; E-mail: duongtannhut@yahoo.com 1219 ... trưởng sâm Ngọc Linh in vitro so với sâm gieo hạt nhanh Rễ sâm Ngọc linh in vitro sau tháng trồng với chiều dài trung bình rễ lên tới 10 cm dấu hiệu lạc quan cho phép sâm Ngọc Linh in vitro phát... Sinh học 8(3B): 1211-1219, 2010 thiết lập khu vực núi Ngọc Linh thuộc xã Tê Xăng, huyện Tu Mơ Rơng, tỉnh Kom Tum, khu vực phân bố sâm Ngọc Linh điều kiện tự nhiên Cây sâm trồng, chăm sóc theo dõi... khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh in vitro Các điều kiện chiếu sáng khác ảnh hưởng khác lên sinh trưởng phát triển chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Kết thu sau tuần nuôi cấy