Kết quả bước đầu định lượng 5 vitamin (b1, b2, b6, pp, c ) và 2 vi kim loại ( zn,fe ) trong 4 chế phẩm polyvitamin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỤC Dược HÀ NỘI DS VŨ ĐẶNG HOÀNG KẾT QUẢ Bước ĐẦU ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN (B„ B2, Bg, pp, C) VI LƯỢNG KIM LOẠI (Zn, Fe) TRONG CHế PHẨM POLYVITAMIN BẰNG KỸ THUẬT cực PHỔ SĨNG VNG LUẬN VĂN THẠC D ợc HỌC * * * % KHOÁ II (1997- 1999) Chuyên ngành: DCiểỉn ttạ/tỉêtn - rDò(‘ th a t hoe Mã sô: 30205 Thày hướng dẫn : PGS TS TRÂN t a n HÀ NỘI - 1999 - LỜI CÁM ƠN Đề tài thực môn Hố phân tích, trường Đại học Dược Hà Nội hướng dẫn PGS.TS Trần Tử An Chân thành cảm ơn thày PGS.TS Trần Tử An thày TS Nguyễn Trọng Giao hết lòng tận tuỵ hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho việc thực nghiệm hoàn thành luận văn thạc sĩ Chân thành cảm ơn thày, mơn Hố phân tích đóng góp nhiều ý kiến q báu, khích lệ động viên em hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn quan tâm, giúp đỡ phòng sau đại học lrường Đại học Dược Hà Nội DS Vu Đặng Hoàng CÁC QUY UỚC VIẾT TẮT dd: dung dịch DD: Dung dịch mẫu tự tạo QT: Qui trình tiến hành định lượng Vitamin B6 vđ: vừa đủ AAS: Atomic Absorption Spectrophotometry (phổ hấp thụ nguyên t ) DPP: Differential Pulse Polarography (cực phổ xung vi phân) FQS: Full Spectrum Quantitation (phân tích tồn phổ) HPLC: High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏnghiệu cao) IR: Infra-red (hổng n g o i) MCA: Multi - Component Analysis (phân tích định lượng đa cấu tử) NPP: Normal Pulse Polarography (cực phổ xung biến đổi đều) RSD: SD: Relative Standard Deviation (độ lệch chuẩn tương đối) Standard Deviation (độ lệch chuẩn) s 2: Variance (phương sai) TEA: Triethanolamin UV-VIS: Ultraviolet-Visible (tử ngoại-khả kiến) MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 1 Tổng q u a n 1.1 Các phương pháp định lượng Vitamin (Bp B2, Bf), pp, C) vi lượng kim loại chế phẩm Polyvitamin 1.2 Các phương pháp cực phổ 12 1.3 Các tiêu chuẩn định lư ợ ng 19 Nguyên liệu, đối tượng phương pháp nghiên c ứ u 22 2.] Nguyên l i ệ u 22 2.2 Máy cực p h ổ 23 2.3 Chuẩn bị dung dịch thực n g h iệ m 24 2.4 Kỹ thuật Ihực n g h iệ m 26 2.5 Xử lý số liệ u 27 Kết qua thực nghiệm bàn luận 29 Kết định lượng vitamin c , Bị, B2 29 3.2 Kết định lượng Vitamin B() 37 3.3 Kết qua định lượng Vitamin pp, Z n 41 3.4 Kết định lượng F e 47 3.5 Bàn luận 51 Kết luận, kiến nghị đề x u ấ t 53 Tài liệu tliam k h ả o 55 Phụ l ụ c 59 ĐẶT Vấ N ĐỂ Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, nghiên cứu dược động học sinh dược học thường phải xác định hàm lượng nhiều hoạt chất mẫu phức tạp Việc phân tích xác định thường phải trải qua hai giai đoạn chính: chiết tách riêng hoạt chất sau tiến hành định lượng Phương pháp có nhiều hạn chế nên người ta phải tìm cách định lượng đồng thời hoạt chất mẫu không qua giai đoạn tách chiết Hiện có nhiều loai thuốc Polyvitamin Ill'll hành thị trường với đa dạng chủng loại, phong phú số lượng công ly dược phẩm nước Bên cạnh số loại thuốc qua khâu kiểm nghiệm, việc đánh giá chất lượng chế phẩm Polyvitamin đặc biệt còng ty dược phẩm nước ngồi gặp nhiều khó khăn Từ trước đến người ta thường sử dụng phương pháp quang phổ sắc ký để thực định lượng đồng thời, bên cạnh phương pháp điện hố đề cập đến Chúng triển khai đề tài nghiên cứu: “Định lượng Vitamin (B,, B2, B(„ pp, C) vi lượng kim loại (Zn Fe) chê phẩm Polyvitamin kỹ thuật cực phổ sóng vng” nhằm luii mục tiêu: - Đánh giá khả sử dụng máy phân t.ich Analyzer MI' 701 cho việc định lượng vitamin vi lượng kim loại hệ nhiều thành phần - Mỏ' lộng ứng dụng phương pháp điện hoá cho việc đánh giá chất lượng thuốc mà lâu chưa ý Trên sở kết thu chúng tơi hy vọng triển khai ỨIIU dụng phương pháp cho việc đánh giá chất lượng thuốc cư sớ TỔNG QUAN 1.1 Các phương pháp định Iưựng Vitamin (15ị, Iỉ2, H6, PI\ C) vi lượng kim loại (Zn, Fe) chê phẩm Polyvitamin Mặc dù từ lâu thuốc Polyvitamin sử dụng phổ biến đến trước năm 1995 có hai chuyên luận “Decavitamin” [20j “ Vitamins B and c injection”[26] đưa vào dược điển Các phương pháp phân tích [20] chủ yếu phương pháp hoá học, vi sinh đo quang kèm theo việc chiết tách thành phần Hầu hết phương pháp phân lích cho chế phẩm đơn thành phần khơng thích họp cho phân tích chế phẩm Polyvitamin(ví dụ: phương pháp định lượng Vitamin c chuẩn độ iocỉ, phương pháp đo quang định lượng Vitamin B6 định lượng Vitamin pp phương pháp định lượng nitrogen [2]) Để định lượng nguyên tố vi lượng (Zn, Fe) chế phẩm Polyvitamin người ta thường sử tlụim quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [20], ngồi chưa có chun luận dược điển đề cập đến vấn đề Dưới xin điểm qua số phương pháp định lượng Vitamin kinh điển áp dụng định lượng thành phần dạns thuốc Polyvitamin * Vitamin C: chuẩn độ thể tích dd chuẩn độ đặc hiệu 2,6 cliclorophenol - indophenol [20] * Vitamin B,: tạo tủa với dd acid silicotungstic, lọc lấy tủa, sấy cân [2] Phương pháp cho kết ổn định, độ lặp cao phải nhiều thời gian (ít hai ngày) Đo cường độ huỳnh quang dd Vitamin B, isobutanol sau oxi hoá(bẳng kali ferricyanid) với bước sóng kích thích 365mn bước sóng đo 430nm [20] * Vitamin B2: đo quang cực đại hấp thụ khoảng 444nm [2], [20] môi trường acid (acid acetic) Nhược điểm phương pháp nhiều trường hợp thực ảnh hưởng tá dược màu đặc biệt tá dược màu vàng gây sai số thừa * Vitamin Bớ: tạo màu với thuốc thử đặc hiệu 2,6 dieloro- quinonclorimid đo quang cực đại hấp thụ 650nm [2], [20], * Vitamin PP: tạo màu với thuốc thử cyanogen bromid đo độ hấp thụ bước sóng 430nm Nhược điểm phương pháp tiến hành pluíc tạp thuốc thử độc [20] Phương pháp vi sinh [20]: sử dụng chủng Lactobacilus plantarum; trình định lượng phức tạp nhiều thòi gian cần nhiều thuốc thử mòi trường (dd casein thuỷ phân môi trường acid, dd tryptophan-cystein, del adenin-guanidin-uracil, ) đòi hỏi cán kiểm nghiệm phải có kinh nghiệm Để tiến hành định lượng đồng thời vitamin chê phẩm Polyvitamin người ta thường sử dụng quang phổ hấp thụ UV-VỈS, quang phổ đạo hàm quang phổ MCA phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.1.1 Định lượng Vitamin quang phổ hấp thụ UV- VIS Các Vitamin c, B|, B2, B6, pp tan nước có công thức cấu tạo công thức phân tử khác Trong công thức cấu tạo cùa Vitamin có dây nối đơi nối đơi liên hợp hấp thụ xạ tử ngoại Tuy nhiên độ hấp thụ mạnh yếu khác Các cực đại hấp (hụ tử ngoại khác gần (trong môi trường acid) nằm vùng 245290nm Cụ thể sau: Bảng ỉ : Tính chất quang plìổ v-V IS Vitamin Vitamin B, b2 Tên khoa học, công thức Cực đại hấp thụ UV-VIS khối lượng phân tử (E|': hệ số hấp thụ riêng) Thiamin hydroclorid Môi trường acid C 12H l7ClN4OS.HCl = 337,3 246nm; E'| = Thiamin nitrat Môi trường kiềm C 12H 17N , 4S = 327,4 232nm; E 11 = 566 Riboflavin Môi trường acid C „H 2„N40 = 376,4 267nm; E ', = 820 Riboflavin sodium phosphat Môi trường kiềm C |7H20N4NaO9P.2H2O = 514,4 270nm; E 1, = 356 Môi trường acid b6 Pyridoxin hydroclorid 290nm; E 1ị = CrH j ,N 3.HC1 = 205,6 Đệm phosphat pH7 324nm; E-, = 426 Acid ascorbic c q ,H 80 = 176,1 Môi trường acid Natri ascorbat 243nm; E 11 = 556 C6H70 6Na = 198,1 Nicotinamid PP(B3) C6H6N20 = 122,1 Môi trường acid Acid nicotinic 261nm; E ',= 45l C„HfiN = 123,1 Căn vào tính chất quang phổ hấp thụ nêu để định lượng Vitamin đa số dược điển qui định phương pháp áp dụng cho chê phẩm đơn thành phần dựa vào tính chất hố học định lượng trực tiếp đo độ hấp thụ ánh sáng Tuy nhiên phương pháp nhiều thực ánh hưởng tá dược Để định lượng đồng thời Vitamin chế phẩni Polyvitamin người ta sử dụng phương pháp quang phổ đạo hàm quang phổ MCA (Multi - Component Analysis) FQS (Full Spectrum Quantitation) [9], [16] * Phương pháp quang phổ đạo hàm: Tro nơ phổ đạo hàm độ hấp thụ (A) lấy vi phân bước sóng (Ả) để đạo hàm bậc 1, bậc bậc cao hoìi A = f(X) dA/àX = f\Ằ ) d2A/ỚX2 = r \ X ) , Vì phổ đạo hàm kết chuyển đổi từ phổ hấp thụ nên giá Irị phổ đạo hàm bước sóng có cộng tính'như độ hấp thụ (khi đo độ hấp thụ hỗn hợp nhiều chất) A, = A, + A2 + -Ì- An CỈAtỉA dẰ I (j.Aj ' + _ CỈẲ dÁ + _ + dẲ dÀ d 2A./ _ cỉ2A,1 d 2A2 , d Ả d Ầ ciẪ2 , d 2A CỈẪ2 Trong dó tổng chất: 1,2, chất 1, chất 2, chất 11 hỗn hợp Theo ý nghĩa toán học đạo hàm: điểm cực trị (cực đại hay cực tiểu) đường cong giá trị đao hàm bậc I 0, điểm L1ỐI1 cua đường cong giá trị đạo hàm bậc Đó sỏ' lý thuyết để dùng phổ đạo hàm định lượng đồng thời chất hỗn hợp (hai hay nhiều thành phần) Trong phương pháp cổ điển, cần xác định đồng thời hai chất nguyên tắc lựa chọn hai bước sóng người ta ln hướng tới đo bước sóng hấp thụ cực đại chất chọn bước sóng ỏ' độ hấp thụ chất khác nhiều để làm tăng độ lặp phương pháp Nhưng hai chất có hấp thụ cực đại bước sóng gẩn (nhu' Vitamin nêu) việc lựa chọn gặp khó khăn Trên phổ đạo hàm bậc chất thứ nhất, số bước sóng ứng vứi giá trị nhiều số bước sóng hấp thụ cực đại Tại điểm có giá trị có thổ gặp giá trị khác phổ đạo hàm bậc chất thứ hai Vậy bước sóng xác định chất thứ hai cách độc lập, không bị ảnh hưởng có mặt nhiều hay chất thứ Dùng phổ đạo hàm bậc hai vấn đề tương tự, hai chất có cực đại hấp thụ gần điểm uốn lại xa Tại bước sóng ứng với điểm uốn phổ hấp thụ điểm đạo hàm bậc hai chất gặp giá trị khác đường đạo hàm bậc hai chất Dựa nguyên tắc nêu người ta tiến hành định lượng đồng thòi Vitamin nhóm B [10], [27], [28], [29], [30] * Phương pháp đo quang phổ phân tích đa cấu tử Trên nhiều máy quang phổ hệ đây, thiết bị cộng kết máy tính (instrument on line, instrument in line), nhờ tích hợp vi xử lý tốc độ cao cluiyên dụng, thuật tốn mạnh thực để giai tốn đa thành phán mà khơng cần thiết phải tách chiết Phân tích Peaks or C('lll.l (%) Ịl||5.47|i/\;85mV) lV’iiks of a i l 1.2 (%) [111 l2.5nA;87mVJ Peaks ofCCIII (%) 11II21,9|iA; 96mV] l’e.'iks of CCI11.4 (%) 0.4 02 Volt Pint lục I : Đườnq chuẩn định lượng Vitamin 60 c (3.1.3) PÌÌIỊ / ụ c : Kết (lịnh lượng Vitamin 61 c Plussz ( 7) / 10 f A Analyzer MF.701 Peaks of H2CII1.1 (%) [ l][1.27(iA; -291mV] Peaks o( IÌ2CII12 (%) ll][4.07|iA; -289mVJ Peaks or H2CII1.3 (7c ) [IJ[6.69nA;-28-lmV] l’enks of H2CI11.4 (%) ll][9.09nA;-271mV| (IpA Yok Phụ Ilie 3: Đường chuẩn định lượng Vitamin B2(3.1.3) 62 Analyzer MF.701 IVaksor IỈ21IffíRViri.3(%) |lJ[2.52nA;-270inV| (!) ỉ \ \ 02 ■0 ( ■08 •OS •I Yotl Phụ lục 4: Kết qua (iịiih lượng Vitamin B? Therơvừ (3.1.7) 63 •1.2 -u -I? -1.8 -2 Volt Phil lục 5: Kết quà định lượng Vitamin Bị Astymiii (3.1.7) 64 I|iA Analyzer MF.701 Peaks of D6 Cl 11.1 (%) [1IỊƠ.217 (.lA;-1253m VI Peaks or H6CII1.2(%) [ IJ [0.323|.iA;-1256m V J • • • • Peaks of 1)6 Cl 11.3 (%) [ IJ10.441 ^A;- i 262mVI Peaks of IJ6 Cl 11.4 (%) [ 1||0.662(.iA;-1269mVI 1) ) \ (1 : 1 I I I / /// OpA 0.6 ■ •12 • 1.4 • 1.6 ■1.8 Volt Phụ Iuc 6: Đường chuẩn định lưựìig Vitamin Bô (3.2.3) 65 Analyzer MF.701 Pint lục 7: Kết quạ định lượnq Vitamin B6 PỈUSSĨ (3.2.7) Analyzer MF.701 Peaks of I’PCIII.I (%) ll][10.9|.iA; -1584)11 VI Peaks of PPCII1.2 (%) [1)114.5 (,iA;-1587niV| Peaks of PPCII1.3 (%) []]|18.3|.tA;-1593mV| Peaks C>rppcil].4(%) [l][23.f)j.iA; -1594mV| Phụ lục 8: t ì lùm V chuẩn định lượng Vitamin p p (3.3.3) 67 PỈÌII lục 9: Kết định lượng Vitamin p p Supradyne (3.3.7) 68 Analyzer MF.701 • Peaks of ZNC '111 (%) : |l][1.22f.iA ;-122lm V ] Peaks of ZNCH1.2 (%) : 1I ][2.03f.iA; -1232mV] : Peaks of ZNC1113 {%) i.|l]|3.03(.iA ;-l235in V | ; Peaks of ZNCH1.4 (%) j I IJ|4.95(.iA; -124JmV| 1.8 Volt Phụ lục 10: Dường chuẩn định lượng Zn (3.3.3) 69 Peaks of ZNTIIIZRA 1.1 (%) l][2.61j.iA;-1295mVJ 0.8 • 0.8 • • 1.2 •1.4 • 1.6 • 1.8 •2 Yolt Phụ lục ỉ I : Kết định lượng Zn Theravit (3.3.7) 70 Analyzer MF.701 500nA Peaks of TECH 1.1 (%) ịl][0.135(iA;-1028n>Vl Peaks of r r a i l (%) [l][0.288|.iA; -1034mV] Peaks of FECI 11.3 (%) |l][0.4()lnA;-1035mV] Peaks of FECIII.4 (%) [1][0.529(.|A;-1039mV) 0.6 ■ ■u ■OS Vp» Phụ lục 12: ĐườniỊ chuẩn ắịiiìi lượng Fe (3.4.3) 71 «00nA Analyzer MF.701 Pint lục 13: Kết địìiìi lnựiìíỊ Fe trom ịAslynii.il (3.4.7) 72 Analyzer MF.701 Peaks of CLAN (%) 1J|4.l7(.iA; 85mVI Peaks of CLAN2 (%) I |[4.45|iA; 85mVI Peaks of CLAN3 (7c) I lf4.17f.iA; 85mVI Peaks of CLAN4 (%) I ||4.35|.iA; 85mVI Peaks of CLANS (7c) 11L4.54f.iA; 85mVI 0.< 0.2 VoU Phụ lục 14: Xác định độ phép định lượng Vitamin c (3.1.5) Analyzer MF.701 Peaks of FELAN I (%) llJ[0.133|xA;-1028mVJ Peaks or l’ELAN2 (%) 11 ||().139|.i/\;-l028m V] Peaks of [ 'ELAN3 (%) 11][() 130j_iA; -1028mV] Peaks (>r TELAN4 (%) 11J10 133J4.A; -K)28mV| Peaks or F'ELAN5 (%) 11 |[O.I43(.iA:-l«28mV| 0H —f '0Ễ j -I : -t.2 - Ĩz 1.4 I—ị VoU Phụ lục 15: Xác định độ phép định lượng Fe (3.4.5) ... 1.1 C c phương pháp định lượng Vitamin (Bp B2, Bf), pp, C) vi lượng kim loại chế phẩm Polyvitamin 1 .2 C c phương pháp c c phổ 12 1.3 C c tiêu chuẩn định lư ợ ng ... thiết bị gồm máy c c phổ tự ghi bình điện phân gồm hệ c c : c c làm vi c c c giọt thuỷ ngân tĩnh c c rắn đĩa, c c so sánh khơng đổi thường c c calomen c c b c clorid c bề mặt lớn c c phù trợ Pt... tan calcxl (cathodic stripping vontammetry) Trên đường Von-Ampe hoà tan xuất pic chất c n x c định C ng gần tương tự sóng c c phổ dòng chiều (c c phổ c điển) đường c c phổ sóng vng, c c phổ