Nghiên cứu cây sài đất về hóa học và tác dụng sinh học theo hướng là thuốc bảo vệ gan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BỘ Y TẾ Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ XUÂN HOA NGHIÊN CỨU CÂY SÀI ĐẤT (IWEDEUA CALENDULACEA VESS.-ASTERACEAE) VỀ HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ■ ■ ■ THEO HƯỚNG LÀM THUỐC BẢO VỆ GAN ■ LUẬN VĂN THẠC s ĩ CHUYÊN NGÀNH: Dược HỌC Dược LIỆU Dược HỌC c ổ TRUYỀN Mã sô: 03.02.03 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.Ts Phạm Kim Mãn Ts Phạm Văn Thanh HÀ NỘI - 2002 M ởi eủ n t tín Để có kết luận văn này, q trình học tập nghiên cứu, tơi nhận nhiều giúp đỡ thầy cô, anh, chị bạn đồng nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới hai thầy hướng dẫn: PGS.TS Phạm Kim Mãn TS Phạm Văn Thanh hướng dẫn, bảo tận tình, góp nhiều ý kiến giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TSKH Trần Công Khánh hướng dẫn, bảo, góp ý kiến giúp đỡ tơi hồn thành phần thực vật Tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS Lê Đình Bích hướng dẫn, cung cấp tài liệu, thông tin liên quan đến phần thực vật Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Minh Khai bảo, cung cấp thông tin truyền đạt kinh nghiệm liên quan đến phần thử tác dụng dược lý Tôi xin cảm ơn cử nhân Nguyễn Chiều cử nhân Ngô Văn Trại cung cấp cho tơi tài liệu hình ảnh liên quan đến đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Chu Đình Kính, TS Đỗ Ngọc Thanh TS Nguyễn Thị Bích Thu giúp tơi việc đo phổ xác định cấu trúc Với lòng biết ơn sâu sắc mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn dược liệu, Bộ môn thực vật, tồn thể thầy tạo điều kiện thuận lợi cho lần làm việc môn Tôi vô biết ơn giúp đỡ anh chị, bạn đồng nghiệp Khoa Dược lý sinh hóa, Khoa Phân tích tiêu chuẩn-Viện Dược liệu, tạo điều kiện sở vật chất giúp đỡ học tập Tôi chân thành cảm ơn anh chị em Khoa Hóa thực vật, nơi tơi cơng tác sinh hoạt động viên, cổ vũ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành việc học tập Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn tới Phòng Sau đại học-Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng kế hoạch tổng hợp-Viện Dược liệu, tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập môn học Cuối cùng, tơi ghi nhận đóng góp gia đình, bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô bạn bè Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2002 DS Nguyễn Thị Xuân Hoa MỤC LỤC Trang PHẨN MỞ ĐẦU PHẦN1 TỔNGQUAN— 1.1 Đặc điểm thực vật - 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi W edelia - 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bô Sài đ ấ t - — 1.1.2.1 Hình dáng bên n g o ài - - 1.1.2.2 Giải phẫu hoa - - 1.1.2.3 Cấu tạo vi phẫu - 1.1.2.4 Bột dược liệu - - - 1.1.3 Đặc điểm thực vật hay nhầm lẫn với Sài đất 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật Sài la n - 1.1.3.2 Đặc điểm thực vật Chè rừ n g - 1.1.4 Bảng so sánh hay nhầm lẫn với Sài đất 1.2 Thành phần hóa học - — 1.3 Tác dụng Sinh học sử dụng Sài đất 11 1.3.1 Tác dụng sử dụng theo YHCT - 11 1.3.2 Những nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Sài đất 1.4 Sơ lược bệnh gan sô thuốc dùng chữa bệnh gan 14 1.4.1 Bệnh gan 14 1.4.2 M ột số thuốc chữa bệnh gan - - - 15 1.4.2.1 Thuốc hoá chất - - 16 1.4.2.2 Dược liệu chữa bệnh gan - 16 1.5 Nhận xét chung 20 » PHẦN NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - — 23 2.1 Nghiên cứu thực vật - - 23 2.1.1 Nguyên liệu - - 23 2.1.2 Phương tiện phương pháp nghiên cứu 23 2.2 Nghiên cứu hoá học 23 2.2.1 Nguyên liệu— 23 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu— — 23 2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học - 24 2.3.1 Nguyên liệu - - 24 2.3.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu— - — 24 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp xử lý số liệu— 27 PHẦN3 THỰCNGHIỆMVÀKẾTQUẢ 29 3.1 Kết nghiên cứu thực yật - 29 3.1.1 Cây Sài đất 29 3.1.1.1 Hình dáng bên ngồi - 29 3.1.1.2 Cấu tạo giải phẫu h o a — - 29 3.1.1.3 Vi phẫu thân Sài đ ấ t 30 3.1.1.4 Vi phẫu Sài đất - 31 3.1.1.5 Soi bột toàn phần mặt đấtcủa Sài đ ấ t - 31 3.1.2 Cây Sài lan - - 32 3.1.2.1 Hình dáng bên n g o ài - 32 3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu hoa - 32 3.1.2.3 Vi phẫu thân Sài lan 33 3.1.2.4 Vi phẫu Sài la n - - - 34 3.1.2.5 Soi bột toàn phần mặt đấtcủa Sài la n - 34 3.1.3 Cây Chè rừng - - 35 3.1.3.1 Hình dáng bên n g o ài— 35 3.1.3.2 Cấu tạo giải phẫu h o a - 35 3.1.3.3 Vi phẫu thân Chè rừ n g - 36 3.1.3.4 Vi phẫu chè rừ n g - 36 3.1.3.5 Soi bột toàn phần mặt đất Chè rừ n g - 37 3.1.4 Bảng so sánh loài hay nhầm lẫn với Sài đất - 38 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 46 3.2.1 Phân tích sơ thành phần hố học có dược liệu Sài đất 46 3.2.2 Nghiên cứu vê saponin - 55 3.2.2.1 Xác định số bọt - — 55 3.2.2.2 Xác định số phá huyết 56 3.2.2.3 Định lượng saponin toàn phần 58 3.2.2.4 Phân tích saponin tồn phần sắc ký lớp mỏng - 60 3.2.2.5 Chiết xuất phân lập s , 62 3.2.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm Sj 63 3.2.2.7 Nhận dạng sản phẩm Sj 64 3.2.3 Nghiên cứu vê flavonoid 68 3.2.3.1 Định lượng flavonoid toàn phần 68 3.2.3.2 Phân tích flavonoid tồn phần sắcký lớp mỏng - 70 3.2.3.3 Phân lập flavonoid từ Sài đất 71 3.2.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm S2 71 3.2.3.5 Nhận dạng sản phẩm s , 71 3.2.4 72 Nghiên cứu coum arin - - 3.2.4.1 Chiết tách phần chứa coumarin - 72 3.2.4.2 Định tính coumarin dạng b ộ t 73 3.2.4.3 Phân tích coumarin sắc ký lớp mỏng— .— 73 3.3 Kết nghiên cứu vê tác dụng sinh học— - 78 3.3.1 Xác định hoạt tính chơng oxy hóa in vitro phần chiết từ Sài đất— - - 78 3.3.2 Thử tác dụng dược lý mô hỉnh gây nhiễm độc gan CCl4 phần chiết từ Sài đất— - - 79 3.3.2.1 Xác định hàm lượng MDA gan— 79 3.3.2.2 Xác định hoạt độ men GPT huyết chuột - 82 3.3.2.3 Xác định hàm lượng bilirubin huyết ch u ộ t - 84 3.3.2.4 Khảo sát hình ảnh tổ chức học giải phẫu bệnh lý gan 86 3.3.3 Nghiên cứu tác dụng lợi mật chuột nhắt phần chiết từ Sài đất - 88 PHẨN BÀN LUẬN, K ÊT LUẬN VÀ ĐỂ n g h ị 90 Bàn luận - - 90 4.1 Về thực vật - 90 4.2 Về hóa học - - - 91 4.3 Về tác dụng sinh học - 92 Kết luận - 94 Đề nghị - - 96 TÀI LIỆU THAM K H Ả O - - 97 PHU L U C - CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Cs : Cộng CSB : Chỉ số tạo bọt CSPH : Chỉ số phá huyết BL : Bệnh lý Dd : Dung dịch DL : Dược liệu EDTA : Ethylen diamine tetra acetic sendizodic acid GPT : Glutamic piruvic transaminase HBV : Virus viêm gan B HTCO : Hoạt tính chống oxy hóa IR : Infra red (Hồng ngoại) KL : Kết luận MDA : Malonyldialdehyd MS : Mass spectrometry (Khối phổ) 13C-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance SGOT : Serum glutamate oxaloacetic transaminase SGPT : Serum glutamate pyruvic transaminase SKLM : Sắc ký lớp mỏng SL : Sinh lý Tp : Toàn phần tr : Trang UY : Ultra Violete YHCT : Y học cổ truyền w : Thể trọng : Hoa : Hoa lưỡng tính DANH MỤC CÁC BẢNG BlỂU Trang Bảng 1.1: So sánh hay nhầm lẫn với Sài đất -Bảng 1.2: Những thuốc có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan gây hóa chất động vật thí nghiệm. Bảng 1.3: Những thực vật thường sử dụng hầu hết thuốc Ấn độ Bảng 1.4: Một vài thuốc xác minh tác dụng bảo vệ gan chúng chống lại tổn thương gan gây hóa chất động vật thí nghiệm -Bảng 3.1: So sánh hình dáng vàcấu tạohoa - - -Bảng 3.2: So sánh cấu tạo giải p h ẫu -Bảng 3.3: So sánh cấu tạo hạt phấn -Bảng 3.4: Kết phân tích sơ thành phần hóa học có Sài đất Bảng 3.5: Thí nghiệm xác định số bọt - -Bảng 3.6: Thí nghiêm xác định số phá huyết. - -Bảng 3.7: Kết định lượng saponin toàn phần -Bảng 3.8: Kết sắc ký lớp mỏng saponin toàn phần Sài đất hệ dung môi khác nhau. -Bảng 3.9: Kết định lượng flavonoid toàn phần Bảng 3.10: Kết sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần Sài đất hệ dung môi (Chloroform : ethyl acetat: acid formic (5:4:1)) -Bảng 3.11: Kết thử phản ứng coumarin dạng bột -Bảng 3.12: Kết phản ứng cắn coumarin toàn phần Bảng 3.13: Kết sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần coumarin toàn phần -Bảng 3.14: Hoạt tính chống oxy hố nồng độ khác cao toàn phần - -Bảng 3.15: Hoạt tính chống oxy hố nồng độ khác nhóm chất chứa thành phần coumestan -Bảng 3.16: Hoạt tính chống oxy hố in vitro xác định từ nồng độ có hoạt tính tối ưu Bảng 3.17: Sự thay đổi hàm lượng MDA gan chuột trước sau uống cao toàn phần phần chứa coumestan -Bảng 3.18: Sự thay đổi hàm lượng MDA gan chuột trước sau uống acid oleanolic - Bảng 3.19: Hàm lượng GPT huyết chuột dùng cao toàn phần từ Sài đất— - 16 19 20 38 40 40 54 55 57 60 62 68 70 73 74 75 79 79 79 81 81 83 Bảng 3.20: Hàm lượng GPT huyết chuột dùng phần chứa coumestan từ Sài đất Bảng 3.21: Hàm lượng GPT huyết chuột dùng acid oleanolic -Bảng 3.22: Sự thay đổi hàm lượng bilirubin huyết chuột trước sau dùng cao toàn phần — Bảng 3.23: Sự thay đổi hàm lượng bilirubin huyết chuột trước sau dùng phần chứa coumestan -Bảng 3.24: Kết xét nghiệm vi thể ganchuột thực nghiệm Bảng 3.25: Kết thử tác dụng lợi mật - - - 83 83 85 85 86 89 PHỤ LỤC I PHỤ LỤC 1: PHỔ uv, IR, MS CỦA CHÂT S! II PHỤ LỤC 2: P H ổ u v , MS CỦA ACID OLEANOLIC CHưẨN m PHỤ LỤC 3: P H ổ u v , IR, MS CỦA CHẤT S2 IV PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM VI THỂ GAN CHUỘT THỰC NGHIỆM PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1.1 PHỔ u v CỦA CHÂT s t PHỤLỤC1.2 PHỔIRCỦACHÂTs, PHỤ LỤC 1.3 PHỔ MS CỦA CHÂT sỉ spectrum at time 1.76 L a m ộ d a m a x ' 242 2 21 p 2 ‘207 L a m b d a m in 213 211 2 208 3 -200 I J 190 200 v\ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 Current data file, 1.76 Phụ lục 1.1 Phổ u v chất s, 310 320 330 340 350 360 370 PEFIKINELMER 02/11/21 14:42 Phon^ TNTT-DH Duoc V: scan, 4.0cm-l, flat, smooth Man QP-y Mns/V r>| Phụ lục 1.2 Phổ IR chất S] m File Operator Ac qu ire d Instrument Sample Name Misc Info Vial Number C:\HPCHEM\1\DATA\M-DIP145.D Phong Cau true, Vien Hoa hoc 25 Nov 102 2:59 pm using AcqMethod N-DIP 5989B MS Si Solvent: CHC13 Phụ lục 1.3 Phổ MS chất s, PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2.1 PHỔ u v CỦA ACID OLEANOLIC CHUAN PHỤ LỤC 2.2 PHỔ MS CỦA ACID OLEANOLIC CHUAN Spectrum at time 1.77 Lam ijxla m ax 242 2 / ', ( ) 206 '203 L a m b d a m if 213 2 208 204 6 Ỉ/1 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 Current data file, 1.77 Phụ lục 2.1 Phổ uv acid oleanolic chuẩn 340 350 360 370 Oleanolic acid $$ O l ean -1 -ện-28-oic acid, 3-hydroxy-, (3.be ta.)- $$ Astrantiagenin c $$ Caryophyllin $$ Giganteumgenin c $$ Olean-12-en-28-oic acid, 3.b e t a -hydroxy- $$ oleanic ac id $$ virgaureagenin B ’ Entry Number CAS Melting Point k Boiling Point Retention Index Mol Formula Mol Weight Company ID 251733 from 000508-02-1 -300 -3 0 C3 0H4803 456.36 124283 C:\DATABASE\wiley2 75.1 Miscellaneous Information QI = 887, Source=CD-4 61- 0-0 Abundance #251733 : Oleanolic acid $$ 01ean-12-en-28-oic acid, 248 3-hydrox (*) 8000 -1 6000 4000 203 2000 133 43 69 i 'l l.lậ 11,1.11 Jl, - m/z- 105 ÌI ^ I l L , l.lllll 50 100 % 147 I lịlll lit l u 189 25 l ắ t 11 [J 111 j i l k , i l Ậ _1 150 200 410 300 438 456 JIL 25Ơ 300 350 400 450 HO (>: \DATABASE\wiley275 Mon Nov 25 15:43:22 2002 Phụ lục 2.2 Phổ MS acid oleanolic chuẩn Page PHỤ LỤC PHỤ LỤC 3.1 PHỔ u v CỦA CHÂT S2 PHỤ LỤC 3.2 PHỔ IR CỦA CHÂT S2 PHỤ LỤC 3.3 PHỔ MS CỦA CHÂT S2 3S 3S 3S 3S 06951 92230 99205 10494 - 0 0 *BS 0 0 NM NM NM NM 347.778 266 667 253 333 207.778 Mau S - X Hoa/ỤDL Gain 84 Basel ine OFF 21 Nou 2002 SBU Page _ Nil 400.00 300.00 ÌBS 0.8800 -> 2.6000 aseline Erase Ụieu Re-scale Zoom se the graphics cursor, track, slope 5 0 2.0 T 500.00 Nrt Label 200.00 -> More Phụ lục 3.1 Phổ u v chất S2 550.00 PERKIN ELMER 37.36- XT J 4000 I 3500 I - 1— 3000 2500 02/11/21 14:35 Phong TNTT-DH Duoc X: scan, 4.0cm~l, flat, smooth Mau Sl-X.Hoa/V.DL 2000 » / A ì A'V I I IS 1500 1000 Phu luc 3.2 Phổ IR chất St 500 cm4 File Operator Acquired Instrument Sample Name Misc Info Vial Number Abundance 11000 - 10000 - C : \HPCHEM\1\DATA\M-DIP14 6.D Phong Cau true, Vien Hoa hoc 25 Nov 102 3:29 pm using AcqMethod N-DIP 5989B MS S2 Solvent: CH30H Average of 4.625 to 4.820 min.: M-DIP146.D 9000 8000 7000 -I 6000 5000 4000 3000 2000 - 1000 185 TT j-r- m /z > 180 Phụ lục 3.3 Phổ MS chất s^ 199 r 200 213 227 23 -T— Ị— r - 220 TT^ 240 260 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM VI THỂ GAN CHUỘT THựC NGHIỆM Kết qua xét nghiệm vi thể chuột thực nghiệm uống CCL4 ( sinh viên Thương Hoa-Cao học Dược) ( ) „ — Chuòt số 1: Các tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ tĩnh mạch cửa rãn rộng,đặc biệt tĩnh mạch khoảng cửa.Khoảng cửa có xâm nhập viêm rõ.Trong nhu mơ gan có ổ hoại tử thoái hoá hốc tế bào gan xâm nhập tế bào viêm CA : Rãn tĩnh mạch; hoại tử +tế bào viêm Chưôt s ố : Hình ảnh tương tự chuột số 1, có mộl số ổ hoại đỏng,bào tương toan,nhân teo CA: Ổ hoại tử đông+nhân teo Chưôt s ổ : Tĩnh mạch cửa rãn nhẹ,tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ không rãn,khoảng cửa xâm nhập viêm nhẹ.Tế bào gan có số nơi thối hố nhỏ xâm nhập viêm CA : ổ thoái hoá tế bào+viêm Cht s ố : Hình ảnh tổn thương tương tự chuột số mức độ nặng hơn,có nhiều ổ hoại tử+xâm nhập viêm thành ổ nhỏ.Khoảng cửa có xâm nhập viêm,các tĩnh mạch cửa có rãn,một số vùng tế bào gan thối hố hốc Cht s ố : Tế bào gan thoái hoá nhẹ số vùng,bào tương có hốc nhỏ.Khơng có ố hoại tử tế bào Tĩnh mạch cửa rãn nhẹ,xâm nhập viêm nhẹ gồm limphô vài bạch cầu đa nhân CA : Khoảng cửa rãn nhẹ,tế bào không hoại tử Chuôt số : Khoảng cửa khơng có xâm nhập viêm,tế bào gan khơng có ổ hoại tử,nhưng bào tương có thối hố nhẹ số tế bào Chuôt số : Tế bào gan khơng hoại tử,hầu khơng có thối hố,nhưng tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ tĩnh mạch cửa có xung huyết ứ hồng cầu.Khoảng cửa viêm nhẹ giới hạn bình thường CA : Tĩnh mạch cửa tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ ứ hồng cầu Chuòt số : Tế bào gan khong hoại tử, khơng có thối hố ,tĩnh mạch cửa tĩnh mạch trung tâm có xung huyết nhẹ.Khoảng cửa có tế bào viêm giới hạn bình thường Cht s ố : Tế bào gan khơng thối hố,khơng có ổ hoại tử,khoảng cửa khơng có xâm nhập viêm.Các tĩnh mạch cửa tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ không xung huyết.Gan bìnhthường CA : Khoảng cửa khơng viêm ,khơng xung huyết Cht số 10 : Hình ảnh tương tự chuột số Gan bình thường Hà nội n g y^^th n g 10 năm 2002 Ghi chú: Kết đánh máy thành Ngừơi đọc kết Các sinh viên giữ 01 bản, người đọc kết giữ 01 có giá trị -_ PGS.TS.'^mVăn3iợỊì ... Nghiên cứu Sài đất (Wedelia calendulacea Less.-Asteraceae) hóa học tác dụng sinh học theo hướng làm thuốc bảo vệ gan MỤC TIÊU CỦA LUẬN VĂN Nghiên cứu so sánh đặc điểm hình thái giải phẫu Sài đất. .. P-amyrin từ khô Sài đất [63] o A H3cỐ 55ĩ:ỉ^ ,^OH Wedelolacton 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ s DỤNG CỦA SÀI ĐÂT 1.3.1 Tác dụng sử dụng theo YHCT Theo Đông y, Sài đất vị mặn, đắng, tính mát Qui vào kinh:... với Sài đất 1.2 Thành phần hóa học - — 1.3 Tác dụng Sinh học sử dụng Sài đất 11 1.3.1 Tác dụng sử dụng theo YHCT - 11 1.3.2 Những nghiên