Nghiên cứu cây sài đất về hóa học và tác dụng sinh học theo hướng là thuốc bảo vệ gan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ XUÂN HOA NGHIÊN CỨU CÂY SÀI ĐẤT I WEDEUA CALENDULACEA VESS.-ASTERACEAE VỀ HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ■ ■ ■THEO H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ XUÂN HOA

NGHIÊN CỨU CÂY SÀI ĐẤT

(I WEDEUA CALENDULACEA VESS.-ASTERACEAE)

VỀ HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ■ ■ ■THEO HƯỚNG LÀM THUỐC BẢO VỆ GAN■

LUẬN VĂN THẠC s ĩ Dược HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Dược LIỆU Dược HỌC c ổ TRUYỀN

M ởi eủ n t tín

Để có được những kết quả trong luận văn này, trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh, các chị và các bạn đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới hai thầy hướng dẫn:

PGS.TS Phạm Kim Mãn và TS Phạm Văn Thanh đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, đã góp rất nhiều ý kiến và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TSKH Trần Công Khánh đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý kiến giúp đỡ tôi hoàn thành phần thực vật Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến DS Lê Đình Bích đã hướng dẫn, cung cấp những tài liệu, thông tin liên quan đến phần thực vật

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Minh Khai đã chỉ bảo, cung cấp thông tin và truyền đạt những kinh nghiệm liên quan đến phần thử tác dụng dược lý

Tôi xin cảm ơn cử nhân Nguyễn Chiều và cử nhân Ngô Văn Trại đã cung cấp cho tôi những tài liệu và hình ảnh liên quan đến đề tài

Tôi xin được cảm ơn PGS.TS Chu Đình Kính, TS Đỗ Ngọc Thanh và

TS Nguyễn Thị Bích Thu đã giúp tôi trong việc đo phổ và xác định cấu trúc.Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

Bộ môn dược liệu, Bộ môn thực vật, cùng toàn thể thầy cô đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong những lần làm việc tại bộ môn

Tôi vô cùng biết ơn sự giúp đỡ của các anh chị, các bạn đồng nghiệp Khoa Dược lý sinh hóa, Khoa Phân tích tiêu chuẩn-Viện Dược liệu, đã hết sức tạo điều kiện cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi trong học tập

Tôi chân thành cảm ơn anh chị em Khoa Hóa thực vật, nơi tôi công tác

và sinh hoạt đã động viên, cổ vũ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành việc học tập

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới Phòng Sau đại học-Trường Đại học Dược

Hà Nội, Phòng kế hoạch tổng hợp-Viện Dược liệu, đã tạo điều kiện và giúp

đỡ tôi trong thời gian học tập các môn học

Cuối cùng, tôi ghi nhận sự đóng góp của gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và bạn bè

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2002

DS Nguyễn Thị Xuân Hoa

PHẨN MỞ ĐẦU - 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN— - - - 3

1.1 Đặc điểm thực vật - - - 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi W edelia - - - 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bô của cây Sài đ ấ t - - — 4

1.1.2.1 Hình dáng bên n g o à i - - 4

1.1.2.2 Giải phẫu hoa - - - - 5

1.1.2.3 Cấu tạo vi phẫu - - - 5

1.1.2.4 Bột dược liệu - - - 5

1.1.3 Đặc điểm thực vật của những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất - - - 6

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật của cây Sài la n - - - 6

1.1.3.2 Đặc điểm thực vật của cây Chè rừ n g - - 6

1.1.4 Bảng so sánh những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất - 7

1.2 Thành phần hóa học - — 9

1.3 Tác dụng Sinh học và sử dụng của Sài đất - 11

1.3.1 Tác dụng và sử dụng theo YHCT - 11

1.3.2 Những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của Sài đất

-1.4 Sơ lược về bệnh gan và một sô thuốc dùng chữa bệnh gan - 14

1.4.1 B ệnh về gan - - 14

1.4.2 M ột số thuốc chữa bệnh gan - - - 15

1.4.2.1 Thuốc hoá chất - - 16

1.4.2.2 Dược liệu chữa bệnh về gan - 16

1.5 N hận xét chung - 20

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU - - — 23

2.1 Nghiên cứu về thực vật - - 23

2.1.1 Nguyên liệu - - - 23

2.1.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu - - 23

2.2 Nghiên cứu về hoá học - 23

2.2.1 Nguyên liệu— - 23

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu— - - -— 23

2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học - - 24

2.3.1 Nguyên liệu - - 24

2.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu— - - - — 24

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu - 25

2.4 Phương pháp xử lý số liệu— - - - 27

PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 29

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực yật - - 29

3.1.1 Cây Sài đất - - - 29

3.1.1.1 Hình dáng bên ngoài - - - 29

3.1.1.2 Cấu tạo giải phẫu h o a — - 29

3.1.1.3 Vi phẫu thân Sài đ ấ t - - 30

3.1.1.4 Vi phẫu lá Sài đất - 31

3.1.1.5 Soi bột toàn bộ phần trên mặt đất của cây Sài đ ấ t - 31

3.1.2 Cây Sài lan - - - - 32

3.1.2.1 Hình dáng bên n g o à i - - 32

3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu hoa - - 32

3.1.2.3 Vi phẫu thân Sài lan - 33

» 3.1.2.4 Vi phẫu lá Sài la n - - - 34

3.1.2.5 Soi bột toàn bộ phần trên mặt đất của cây Sài l a n - 34

3.1.3 Cây Chè rừng - - 35

3.1.3.1 Hình dáng bên n g o à i— 35

3.1.3.2 Cấu tạo giải phẫu h o a - - 35

3.1.3.3 Vi phẫu thân Chè rừ n g - - - 36

3.1.3.4 Vi phẫu lá chè rừ n g - - - 36

3.1.3.5 Soi bột toàn bộ phần trên mặt đất của cây Chè rừ n g - 37

3.1.4 Bảng so sánh những loài hay nhầm lẫn với Sài đất - 38

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học - - 46

3.2.1 Phân tích sơ bộ thành phần hoá học có trong dược liệu Sài đất - 46

3.2.2 Nghiên cứu vê saponin - 55

3.2.2.1 Xác định chỉ số bọt - - - - - — 55

3.2.2.2 Xác định chỉ số phá huyết - 56

3.2.2.3 Định lượng saponin toàn phần - 58

3.2.2.4 Phân tích saponin toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng - 60

3.2.2.5 Chiết xuất và phân lập s , - - 62

3.2.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm Sj - 63

3.2.2.7 Nhận dạng sản phẩm Sj - 64

3.2.3 Nghiên cứu vê flavonoid - 6 8 3.2.3.1 Định lượng flavonoid toàn phần - 6 8 3.2.3.2 Phân tích flavonoid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng - 70

3.2.3.3 Phân lập flavonoid từ Sài đất - 71

3.2.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm S2 - 71

3.2.3.5 Nhận dạng sản phẩm s , - 71

3.2.4 Nghiên cứu về coum arin - - - 72

3.2.4.1 Chiết tách phần chứa coumarin - 72

3.2.4.2 Định tính coumarin trong dạng b ộ t - 73

3.2.4.3 Phân tích coumarin bằng sắc ký lớp mỏng— — - 73

3.3 Kết quả nghiên cứu vê tác dụng sinh học— - 78

3.3.1 Xác định hoạt tính chông oxy hóa in vitro các phần chiết được từ Sài đất— - - - 78

3.3.2 T hử tác dụng dược lý trên mô hỉnh gây nhiễm độc gan bằng CCl4 của các phần chiết được từ Sài đất— - - 79

3.3.2.1 Xác định hàm lượng MDA ở gan— - 79

3.3.2.2 Xác định hoạt độ men GPT trong huyết thanh chuột - 82

3.3.2.3 Xác định hàm lượng bilirubin ở huyết thanh c h u ộ t - 84

3.3.2.4 Khảo sát hình ảnh tổ chức học giải phẫu bệnh lý gan - 8 6 3.3.3 Nghiên cứu tác dụng lợi mật ở chuột nhắt của các phần chiết được từ Sài đất - - 88

PHẨN 4 BÀN LUẬN, K ÊT LUẬN VÀ ĐỂ n g h ị - 90

Bàn lu ận - - - 90

4.1 Về thực vật - 90

4.2 Về hóa học - - - - - 91

4.3 Về tác dụng sinh học - - - 92

Kết luận - - 94

Đề nghị - - - 96

TÀI LIỆU TH AM K H Ả O - - - - 97

PHU L U C

Bảng 1.1: So sánh những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất - 7

Bảng 1.2: Những cây thuốc có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan gây ra bởi hóa chất trên động vật thí nghiệm. - 16

Bảng 1.3: Những thực vật thường được sử dụng trong hầu hết các bài thuốc ở Ấn độ - 19

Bảng 1.4: Một vài bài thuốc đã được xác minh về tác dụng bảo vệ gan của chúng chống lại tổn thương gan gây ra bởi hóa chất trên động vật thí nghiệm - 20

Bảng 3.1: So sánh về hình dáng cây và cấu tạo hoa - - - 38

Bảng 3.2: So sánh cấu tạo giải p h ẫ u - 40

Bảng 3.3: So sánh cấu tạo hạt phấn - 40

Bảng 3.4: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong Sài đất 54 Bảng 3.5: Thí nghiệm xác định chỉ số bọt - - 55

Bảng 3.6: Thí nghiêm xác định chỉ số phá huyết. - - - 57

Bảng 3.7: Kết quả định lượng saponin toàn phần - 60

Bảng 3.8: Kết quả sắc ký lớp mỏng saponin toàn phần của Sài đất ở các hệ dung môi khác nhau. - 62

Bảng 3.9: Kết quả định lượng flavonoid toàn phần - 6 8 Bảng 3.10: Kết quả sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần của Sài đất ở hệ dung môi (Chloroform : ethyl ac e ta t: acid formic (5:4:1)) - 70

Bảng 3.11: Kết quả thử phản ứng coumarin của dạng bột - 7 3 Bảng 3.12: Kết quả các phản ứng của cắn coumarin toàn phần - 7 4 Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần và coumarin toàn phần - 7 5 Bảng 3.14: Hoạt tính chống oxy hoá ở các nồng độ khác nhau của cao toàn phần - - - 7 9 Bảng 3.15: Hoạt tính chống oxy hoá ở các nồng độ khác nhau của nhóm chất chứa thành phần coumestan - 79

Bảng 3.16: Hoạt tính chống oxy hoá in vitro xác định từ nồng độ có hoạt tính tối ưu - 79

Bảng 3.17: Sự thay đổi hàm lượng MDA của gan chuột trước và sau khi uống cao toàn phần và phần chứa coumestan - 81 Bảng 3.18: Sự thay đổi hàm lượng MDA của gan chuột trước và sau

khi uống acid oleanolic - - - 8 1

Bảng 3.19: Hàm lượng GPT trong huyết thanh của chuột được dùng

cao toàn phần từ Sài đất— - 8 3

DANH MỤC CÁC BẢNG BlỂU

Trang

Bảng 3.20: Hàm lượng GPT trong huyết thanh của chuột được dùngphần chứa coumestan từ Sài đất - - - 83Bảng 3.21: Hàm lượng GPT trong huyết thanh của chuột được dùngacid oleanolic - - - 83Bảng 3.22: Sự thay đổi hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuộttrước và sau khi dùng cao toàn phần - — 85Bảng 3.23: Sự thay đổi hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuộttrước và sau khi dùng phần chứa coumestan - 85Bảng 3.24: Kết quả xét nghiệm vi thể gan chuột thực nghiệm - 86Bảng 3.25: Kết quả thử tác dụng lợi mật - - - - 89

DANH MỤC HÌNH, ẢNH

Ảnh 1.1: Cây Sài đất - - - - 8

Ảnh 1.2: Cây Sài lan - - - - 8

Ảnh 1.3: Cây Chè rừng - - - - 8

Ảnh 3.1: Lá Sài đất, Sài lan, Chè rừng - - - 41

Ảnh 3.2: Cụm hoa Sài đất, Sài lan, Chè rừng - 41

Hình 3.3: Cấu tạo giải phẫu hoa Sài đất, Sài lan, Chè rừ n g - 41

Ánh 3.4: Cấu tạo giải phẫu của Sài đất, Sài lan, Chè rừng - 42

Ảnh 3.5: Một số đặc điểm bột Sài đất— - - - 43

Ảnh 3.6: Một số đặc điểm bột Sài lan - - - - — 44

Ảnh 3.7: Một số đặc điểm bột Chè rừng - - — 44

Ảnh 3.8: Cấu tạo hạt phấn của Sài đất - - 45

Ánh 3.9: Cấu tạo hạt phấn của Sài lan - 45

Ảnh 3.10: Cấu tạo hạt phấn của Chè rừng - 45

Ánh 3.11: Phản ứng định tính saponin - - 67

Ảnh 3.12: SKLM saponin toàn phần ở các hệ dung môi khác nhau - 67

Ảnh 3.13: SKLM chất Sị trên 3 hệ dung môi khác nhau - 67

Ảnh 3.14: Tinh thể s, kết tinh trong ethanol - - — 67

Ảnh 3.15: SKLM flavonoid toàn phần - 77

Anh 3.16: SKLM so sánh giữa flavonoid tp và coumarin tp - 77

Ảnh 3.17: SKLM chất St trên 3 hệ dung môi khác nhau— - - 77

Ảnh 3.18: Tinh thể So kết tinh trong methanol - - 77

Ảnh 3.19: Vi thể gan chuột bệnh lý - ^7

Ảnh 3.20: Vi thể gan chuột sinh lý - 87

Ánh 3.21: Vi thể gan chuột bệnh lý đã dùng cao toàn phần ^7

coumestan-Trang

DANH MỤC S ơ ĐỔ

Trang

Sơ đồ 3.1: Chiết xuất saponin toàn phần - - - 59

Sơ đồ 3.2: Tinh chế saponin toàn phần - - 61

Sơ đồ 3.3: Chiết xuất và phân lập S] - - - 63

Sơ đồ 3.4: Dự đoán sự phá mảnh của acid oleanolic trong phổ khối - 66

Sơ đồ 3.5: Chiết xuất flavovoid toàn phần - 69

Sơ đồ 3.6: Chiết sản phẩm chứa coumarin - 73

Sơ đồ 3.7: Chiết coumarin toàn phần - - - 74

xơ gan và ung thư gan.

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới hiện nay trên thế giới có khoảng 2

tỷ người nhiễm HBV trong đó có khoảng 350 triệu người mang HBV mạn tính, số bệnh nhân này phần lớn chuyển thành xơ gan và ung thư gan Theo số liệu Bộ Y tế cho biết, nước ta có khoảng 7 đến 10 triệu người bị mang virus viêm gan B Ưng thư gan là bệnh có số người mắc và tỷ lệ tử vong cao [69].Nghiên cứu thuốc chữa bệnh về gan là một trong những trọng tâm nghiên cứu của ngành y tế nhiều nước trên thế giới Ngày nay, việc nghiên cứu, khai thác và sử dụng các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên nhất là các thuốc từ cây

cỏ là xu thế chung của nhiều nước Nhiều người bệnh thích trở lại dùng các loại thuốc này do tính an toàn, ít gây tác dụng phụ ngoài mong muốn và rẻ tiền hơn

Nước ta có nguồn cây thuốc dồi dào, kho tàng kinh nghiệm chữa bệnh theo y học cổ truyền và y học dân gian rất phong phú Nghiên cứu khai thác và

sử dụng hợp lý nguồn nguyên liệu cây thuốc trong nước, thừa kế và nâng cao kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông là một trong những chiến lược quan trọng nhằm phát triển nền công nghiệp dược nước nhà, đồng thời là một trong những phương châm hoạt động của ngành y tế kết hợp y học dân tộc với y học hiện đại

-2-Cây Sài đất là một cây thuốc sẵn có trong nước, đã được nhân dân ta dùng

để chữa bệnh viêm nhiễm có hiệu quả Một số tài liệu trên thế giới có nói đếntác dụng bảo vệ gan của Sài đất [21], [50], [54] Ở Việt nam, Sài đất dùng chữa bệnh gan là một khái niệm hoàn toàn mới, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về nội dung này và cũng ít được đề cập tới Với hy vọng khai thác và mở rộng phạm vi ứng dụng của cây Sài đất, chúng tôi tiến hành đề tài:

" Nghiên cứu cây Sài đất (Wedelia calendulacea Less.-Asteraceae) về hóa

học và tác dụng sinh học theo hướng làm thuốc bảo vệ gan

MỤC TIÊU CỦA LUẬN VĂN

1 Nghiên cứu so sánh đặc điểm hình thái và giải phẫu của Sài đất và hai cây dễ nhầm lẫn là Sài lan và Chè rừng nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Sài đất

2 Phân tích sơ bộ thành phần hoá học một số nhóm chất có trong cây Sàiđất

3 Tiến hành định tính và định lượng nhóm chất chính, chủ yếu là nhóm flavonoid và saponin trong dược liệu

4 Chiết xuất, phân lập một số thành phần hoạt chất chính trong dược liệu

5 Bước đầu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm chiết xuất từ dược liệu

-3-PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Wedelia

Cây thảo đứng hoặc bò hoặc dạng dây cuốn, sống 1 hoặc nhiều năm, có lông ngắn thô [73], [72] hoặc có bề mặt sần sùi [41], Lá mọc đối, có răng, hiếm khi nguyên, không phân thuỳ Cụm hoa hình đầu, to đều nhau, có ít hoặc tương đối nhiều, dạng phóng xạ, đơn sinh hoặc 2-3 cụm xuất phát từ nách lá hoặc ở đỉnh cành, có cuống Hoa dị hình, ngoài cùng là một tầng hoa cái màu vàng, có tương đối nhiều hoa lưỡng tính ở giữa, màu vàng, tất cả đều kết quả Tổng bao hình chuông hoặc hình bán cầu Các phiến của tổng bao xếp 2 tầng Các phiến tầng ngoài chất lá, màu xanh, có lông ngắn thô hoặc lông mềm; các phiến tầng trong bằng Các phiến tầng ngoài hơi dài hoặc tương đối ngắn hơn

Đế hoa bằng hoặc hơi lồi, các phiến kèm gần lợp lên nhau, bao quanh hoa lưỡng tính Cánh tràng hoa cái dạng lưỡi, phiến lưỡi dài, trải ra, đỉnh có 2-3 thuỳ răng Phần ống tràng ngắn Tràng hoa lưỡng tính dạng ống, phần ống hình ống tròn hoặc loe dần về phía trên thành dạng chuông hẹp, hiếm khi có phần gốc đột nhiên thu lại thành bộ phận tương tự cuống Vành ống tràng có 5 thuỳ nông Nhị 5 Phần đỉnh bao phấn dạng trứng hoặc cùn hoặc gần nhọn, phần gốc hình kích, có 2 tai cùn nhỏ Vòi nhụy hoa lưỡng tính phân nhánh, có nhiều nốt dạng vú nổi lên, đỉnh có phần phụ dạng đuôi, đuôi nhọn sắc hoặc hơi nhọn, mặt lưng có lông Quả bế hình trứng đảo hoặc hình tròn dạng nêm, đỉnh bằng hoặc hơi tròn, dẹt hoặc ở hoa dạng lưỡi, quả nang có 3 cạnh, mép cạnh cùn hoặc ít khi thành dạng cánh hẹp chất cốt mềm Không mào lông hoặc thoái hoá thành 1-3 râu gai hoặc mào lông có răng hay không răng

Trên thế giới có khoảng 60 loài, phân bố khắp vùng nhiệt đới và á nhiệt đới toàn cầu

Tên khoa học: ^Nedelia calendulacea Less., họ Cúc (Asteraceae).

Tên đồng nghĩa: Wedelia chinensis (Osbeck) Merr [7], [40].

13 mm, gốc hình nêm, đỉnh nhọn hoặc tù, mép thường có 1-3 đôi răng cưa ở

xa nhau, đôi khi nguyên Cả 2 mặt lá có lông mịn ngắn Gân chính rõ ở mặt trên hoặc có khi không rõ, hơi lồi ở mặt dưới Gân bên 1-2 đôi, thông thưòng chỉ có một đôi ở gần gốc là rõ, không có gân mạng

Cụm hoa dạng đầu ít hoa, hoa màu vàng tươi, đường kính 15-20 mm, mọc đơn độc ở đỉnh thân hoặc nách lá Cuống cụm hoa dài 3-10 cm, có lông đính thô, ngắn Gồm có 2 loại hoa: hoa cái hình lưỡi nhỏ có 2-3 răng, trên một hàng; hoa lưỡng tính hình ống, có 4-5 thùy Nhị 5 [73]

Quả bê hình trứng đảo, dài khoảng 4 mm, có các u lồi nhỏ, đỉnh hơi thulại, có 3 cạnh nhỏ, mép cạnh dày, không có mào lông, nhưng có răng dạng mào lông ở đỉnh [73], [72], [41]

Hoa nở vào tháng 3 - tháng 9 Cây có nhiều ở Trung quốc, Ấn độ, Indonexia, Philippin, Nhật bản [73]

Ớ Việt nam phân bố ở: Ninh Bình, Nam Định, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Hà Bắc, Hải Hưng [72]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bô của cây Sài đất

-5-1.1.2.2 Giải phẫu hoa

Cụm hoa dạng đầu ít hoa, đường kính 15-20 mm, mọc đơn độc ở đỉnh hoặc ở trong nách lá Cuống cụm hoa dài 3-10 cm, có lông đính thô, ngắn Tổng bao hình chuông, rộng khoảng 1 cm, dài khoảng 12 mm, xếp 2 tầng; các phiến ở tầng ngoài chất lá, màu xanh, hình ellip, dài 10-12 mm, đỉnh tù hoặc hơi tròn, mặt ngoài có lông ngắn; các phiến ở tầng trong tương đối nhỏ, hình tròn dài, dài 6-7 mm, đỉnh nhọn, nửa trên có lông ở mép; phiến đệm gần hình dải, dài 6 mm, không lông, đỉnh thuôn nhọn, có khi có 3 thùy nông

Hoa dạng lưỡi có một tầng, màu vàng, phiến lưỡi hình tròn dài, dạng trứng, dài khoảng 8 mm, đỉnh có 2-3 thùy sâu, phần ống nhỏ, ngắn, bằng 1/5

độ dài lưỡi Hoa dạng ống tương đối nhiều, màu vàng, dài khoảng 5 mm Tràng hoa gần hình chuông, to dần lên phía trên, tận cùng bằng 5 thùy hình trứng, tù [73]

1.1.2.3 Cấu tạo vi phẫu

Biểu bì trên và dưới có lông che chở và lông tiết, biểu bì dưới có nhiều lỗ khí Phần gân giữa: sát biểu bì có 2 đám mô dày; một bó libe-gỗ to nằm ở giữa Phía trên và phía dưới phần mô mềm vỏ có hai cung mô dày úp vào Phần phiến lá: mô mềm giậu gồm 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật, đều đặn, xếp đứng, xít nhau, dưới mô mềm giậu là mô mềm khuyết [2]

-6-1.1.3 Đặc điểm thực vật của những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất

Từ những năm trước đây, có một số cơ sở Quốc doanh dược liệu hoặc

bệnh viện thu mua Sài đất (Wedelia calendulacea Less., họ Cúc (Asteraceae))

đã mua nhầm hoặc lẫn lộn Sài lan Ợ ridax procumbens L., họ Cúc (.Asteraceae)) hay Chè rừng (Pliylla nodiflora Greene., họ c ỏ roi ngựa (’Verbenaceae)) Ở một số tài liệu cũng đã nêu ra những lưu ý để tránh sự

nhầm lẫn giữa các cây: Sài đất, Sài lan, Chè rừng Do vậy, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi cũng quan tâm đến những sự nhầm lẫn đó

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật của cây Sài lan (Ảnh 1.2-tr 8)

Tên khoa học: Tridax procumbens L., họ Cúc (Asteraceae).

Tên khác: Cúc mai, Thu thảo [7], Sài lông, Cúc mui [40], c ỏ mui [1]

Cây thuộc thảo, thân bò, có nhiều lông Lá mọc đối, hình mác thuôn nhọn, dài 3,5-5 cm, mặt trên màu lục, mặt dưới màu lục nhạt, có nhiều lông ở 2 mặt, mép lá có nhiều răng lớn và sâu, từ cuống gân chính tỏa ra 2 gân phụ rõ rệt Hoa đầu trên một cọng dài tới 20 cm Gồm có 2 loại hoa: hoa cái hình lưỡi hay hình môi 5, trắng hay vàng nhạt, trên một hàng, tràng hình lưỡi rộng, có 2 thùy dài; Hoa lưỡng tính hình ống, màu vàng tươi, chia 5 thùy Nhị 5 Quả bế,

có lông, lông mào do tơ 10 dài, 10 ngắn, rìa lông mịn, n=18 [7], [40]

1.1.3.2 Đặc điểm thực vật của cây Chè rừng (Ánh 1.3-tr 8)

Tên khoa học: Phyla nodiflora Greene, họ c ỏ roi ngựa (Verbenaceae) [6],

[4]

Tên đồng nghĩa: Lippia nodiflora (L.) Michx.

Tên khác: Dây lưỡi, Dây lức [11], Cây Sài đất giả, Cây nứt nan, Thủy hoàng cẩn, Quá giang đằng [6], Lức lan [4J

Cây thân vuông dài, bò, phân nhánh nhiều, nhẵn hay ít lông trắng, có rễ phụ ở mấu Lá không cuống, dài 2-3,5 cm, rộng 0,7-2,5 cm, đầu lá tròn, đáy thuôn thành góc, hai mặt đều có lông Mép lá có răng ở nửa trên, nguyên ở

nửa dưới Gân phụ 6-8 đôi Hoa hợp thành bông ở nách lá, nhiều hoa, dày đặc, lúc đầu có hình cầu, sau thuôn dài, lá bắc lợp lên nhau nom như bắp ngô Cuống mảnh dài 3-8 cm Hoa bé, màu lam nhạt, vàng, hồng hay trắng Tràng nhẵn có 5 thùy, không đều Quả nang hình trứng, nhẵn; hạt hình thấu kính, không có nội nhũ [6].

Cây mọc ở bãi cát ven biển hay trên bờ đê có nước mặn

1.1.4 Bảng so sánh những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất

Bans u _ : So sánh những cây hay nhầm lẫn với cây Sài đất

Đặc

điểm

LoàiSài đất

- Gần như không cuống,

có cuống ngắn 1-3 mm

- Phiến lá hình thuôn dài

- Mép nguyên hoặc khía

răng thô ở xa nhau

- Có cuống dài 8-15 mm

- Phiến lá hình mác thuôn nhọn

- Mép khía răng lớn

và sâu

- Không cuống

- Phiến lá hình trứng ngược

- Mép khía răng nửa trên, nửa dưới nguyên

Cụm

hoa

- Dạng đầu

- Có 2 loại hoa, màu

vàng tươi Nhiều hoa

cái

- Dạng đầu

- Có 2 loại hoa, hoa cái màu trắng ngà ( 5 hoa cái), hoa lưỡng tính màu vàng đậm

- Dạng bông dày đặc

- Có 1 loại hoa màu trắng

- Quả nang hình trứng, nhẵn

-8-Ảnh 1.1: Cây Sài đất

-9-1.2 THÀNH PHẨN HÓA HỌC

Dịch ép của thực vật chứa dầu hòa tan (được biết như là tác nhân làm đen), tanin, caroten, chlorophyll, saponin, phytosterol, sáp, nhựa, gôm, và đường Theo tài liệu nước ngoài, các tác giả Ấn độ làm phản ứng alkaloid cho kết quả

âm tính Trong khi đó, các tác giả Trung quốc lại tin tưởng sự có mặt của alkaloid trong cây Trong lá chứa isoflavonoid, wedelolacton 0,05% đó là lacton của 5,6-dihydroxy 2 (2,6 dihydroxy 4- methoxyphenyl) và benzofuran- 3- carboxylic acid (Cấu trúc này vừa là flavonoid vừa là coumarin) [40]

- Năm 1974 K.K, Seshadra, T.R đã giới thiệu 16 dẫn chất của lacton,

glycosid terpenoid, steroid và polypeptid của Nhọ nổi (Eclỉpta alba) và Sài

- Năm 1985, Govindachari, Tuticorin R.; Premila, Manakkals đã phân lập

từ lá tươi của Sài đất được một chất mới là acid norwedelic (I) tách ra từ norwedelolacton (II), một chất đã tìm thấy trước đó trong Nhọ nồi [64],

/TX A , , (II) N o r w e d e lo la c to n (I) A cid n o rw e d elic ì r i _ , 1 , , « V

7 (D e s m e th y l w e d e lo la c to n )

1,3 ,8 ,9 -te tra h y d ro x y c o u m e s ta n

- Năm 1991, Govindachari, T.R; Premila, M s đã phân lập được 3 saponin

có genin là acid oleanolic và 2 dây nối đường từ lá tươi của Sài đất đã xác

-10-định được cấu trúc của 2 chất: một saponin mới gồm có acid oleanolic với hai dây nối đường (acid oleanolic + glucose + xylose + acid glucoronic) (1) Chất thứ hai đã biết là ginsenosid R0 (2) ( hoặc chikusetsusaponin V) chất này đã được phân lập trước đây từ một vài loài Panax (Araliaceae)

gồm Panax japanicus và Panax ginseng Ginsenosid R0 = (acid oleanolic

+ 2 glucose + acid glucoronic)

Cấu trúc của saponin thứ 3 chưa được xác định một cách đầy đủ nhưng thấy đó là một glycosid acid oleanolic với hai dây nối đường và một nửa

P-D-glucosidyl ở vị trí 28 của acid oleanolic.

Thuỷ phân từng saponin trong môi trường acid, dùng HC1 4N-Dioxan (1:1) thu được acid oleanolic (Định tính bằng TLC, IR và l3C-NMR so sánh với mẫu chuẩn) và các đường được nhận dạng là glucose, xylose, glucuronolacton và acid glucuronic trong trường hợp của (1) và glucose, glucuronolacton và acid glucuronic trong trường hợp của (2) Glucuronolacton được sinh ra trong quá trình thuỷ phân acid bởi sự lacton

hoá của acid glucuronic Nếu thuỷ phân bằng kiềm thì cả 3 saponin trên đều cho levoglucosan [65].

Tác dụng bảo vệ gan của Sài đất có thể là do nửa acid glucuronolic có mặt trong các saponin, người ta đã biết rằng acid glucuronic là một chất khử độc gan [39], [32] Tác dụng đáng kể bảo vệ gan còn được phát hiện do các tiền saponin từ ginsenosid R0 [30]

- Năm 1997, Nguyễn Ngọc Sương, Đỗ Ngọc Tín, Nguyễn Kim Phi Phụng, trường đại học khoa học tự nhiên- Thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Công Hào, Viện sinh thái nhiệt đới- Thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được Wedelolacton và acid norwedelic từ lá tươi của cây Sài đất bằng cách chiết hỗn họp toàn phần sau đó phân lập trên bản mỏng rồi kết tinh lại trong methanol [62]

Các tác giả trên cũng đã phân lập được P-amyrin từ lá khô của Sài đất [63]

oA

Wedelolacton

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ s ử DỤNG CỦA SÀI ĐÂT

1.3.1 Tác dụng và sử dụng theo YHCT

Theo Đông y, Sài đất vị hơi mặn, hơi đắng, tính mát

Qui vào 3 kinh: tâm, phế, vị

Chủ trị: Đinh độc, mụn nhọt, sưng vú, ngứa lở, sốt ho, sốt phát ban [12]

-12-Công dụng: 1 Sài đất được dùng phổ biến trong nhân dân như một vị

thuốc có tính kháng khuẩn, tiêu độc, chữa các vết thương nhiễm trùng, các chỗ viêm tấy, sưng đau, áp xe, chốc lở, sưng

vú, cảm sốt, phát ban, viêm bàng quang Dùng cây tươi nấu nước tắm cho trẻ em trị rôm sảy [12]

2 Dự phòng viêm sởi

3 Cảm cúm

4 Bạch hầu, viêm hầu, sưng amiđan

5 Viêm khí quản, viêm phổi nhẹ, ho gà, ho ra máu

6 Huyết áp cao [3]

7 Dị ứng, chữa sốt rét [13]

Ngoài ra, Sài đất còn được dùng làm rau ăn, thuốc bổ, thuốc hạ nhiệt, trị bệnh gan, trị phù bụng, trị ra máu tử cung, tê thấp, ở Trung quốc , có nơi dùng trị ung thư [7]

Theo tài liệu Ấn độ, lá Sài đất được sử dụng cho việc nhuộm tóc và kích thích mọc tóc Dịch ép dùng xăm mình trên da, sản phẩm màu để giữ cho màu xanh đen không bị mất đi Lá còn được dùng cho các bệnh về da đặc biệt là alopecia Nước sắc của Sài đất được sử dụng cho chứng ra máu tử cung, chứng kinh nhiều Dịch chiết cồn ức chế ung thư biểu mô và cổ chướng [40]

Ớ Việt nam, nhân dân Bắc Ninh, Bắc Giang và nhiều nơi khác vẫn dùng cây Sài đất ăn sống như rau với thịt hay cá

Từ cuối năm 1961, bệnh viện Bắc Giang đã dùng Sài đất điều trị có kết quả các trường hợp viêm tấy ngoài da, ở khớp xương, răng, vú, sưng bắp chuối, sưng khớp nhiễm trùng, lở loét, mụn nhọt, chốc đầu, đau mắt

Theo kết quả nghiên cứu của bệnh viện này, tác dụng kháng sinh của Sài đất trong ống nghiệm rất thấp: không thấy tác dụng với Flexneri, vòng vôkhuẩn đối với cầu trùng Staphyllococcus 0,3 cm, với bạch cầu trùng 0,2 cm,với liên cầu trùng Streptococcus 0,1 cm, với Typhi 0,1 cm Trên lâm sàng,

đi tới kết luận là tác dụng chống viêm của Sài đất rất rõ rệt, những hiện tượng sưng nóng đỏ đều dần dần biến mất, nhưng lá Sài đất không có tác dụng đối với những trạng thái viêm đã chuyển sang giai đoạn mưng mủ, áp xe hoá [11].

1.3.2 Những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của Sài đất

- Năm 1986, Wagner, H.; Fessler, B người Đức đã nghiên cứu in vitro về tác dụng ức chế men 5-lipoxygenase của dịch chiết Nhọ nồi và Sài đất đi đến kết luận: coumestan có nguồn gốc từ Wedelolacton được phân lập từ hai cây trên là nhân tố ức chế có hiệu quả và chọn lọc men 5-lipoxygenase bằng việc thu tóm những gốc o [31]

- Năm 2000, Merr, Kamalam, M; Jegadeesan, M người Ân độ đã nuôi cấy những mô của Sài đất trên in vitro, đánh giá về hàm lượng Wedelolacton và tìm những nhân tố liên quan đến hàm lượng của hoạt chất Kết quả cho thấy hàm lượng Wedelolacton thay đổi theo mùa và thành phần hormon cho vào môi trường nuôi cấy cũng như mùa thu hái sản phẩm đem nuôi cấy có ảnh hưởng đến hàm lượng của Wedelolacton Mô nút thân lấy trong tháng 7 và tháng 8 đem nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung IBA 2mg/l và BA 2 mg cho sản lượng Wedelolacton lớn nhất [36]

- Năm 1989, Sharma AK, Anand KK, Pushpangadan p, Chandan BK, Chopra CL, Prabhakar YS, Damodaran NP nghiên cứu về hiệu lực bảo vệ gan của Sài đất đã đi đến kết luận: dịch chiết cồn của toàn bộ cây Sài đất thể hiện hiệu lực bảo vệ cao chống lại sự phá hại gan trên mô hình gây viêm gan bằng

-14-tetraclorua carbon in vivo Dịch chiết này còn làm tăng lưu lượng mật ở chuột cống do kích thích dung lượng tiết ở gan Liều gây chết tối thiểu là hơn 200 mg/kg đường uống ở chuột nhắt [21]

- Năm 1994, Lin sc, Lin c c , Lin YH, Shynn SJ, đã nghiên cứu hiệu lực bảo vệ gan của Sài đất trên 3 mô hình gây độc cho gan đi đến kết luận: Bệnh gan cấp được gây nên bởi tetraclorua carbon, acetaminophen trên chuột nhắt

và D(+)-galactosamine trên chuột cống điều trị bởi Sài đất (300 mg/kg, đường uống), ở 2, 6 và 10 tiếng, mức độ giảm của men SGOT và SGPT được quan sát ở 24 giờ sau khi gây độc gan Các thí nghiệm soi kính hiển vi tế bào gan cho thấy có sự tiến bộ rõ rệt của nhóm dùng Sài đất Để khẳng định thêm hiệu lực bảo vệ gan của Sài đất, người ta so sánh các hiệu lực về dược lý học và mô

bệnh học với Bupleurum chinense DC một dược liệu tốt đã biết về tác dụng

chống nhiễm độc gan thấy rằng Sài đất có hiệu lực rõ rệt về tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan [54]

- Năm 2001, s Emmanuel, T Amalraj và s Ignacimuthu đã nghiên cứu hiệu lực bảo vệ gan của coumestan phân lập được từ lá Sài đất, trên mô hình gây tổn thương gan bởi paracetamol cũng đi đến kết luận là: coumestan làm giảm rõ rệt sự tăng ngưỡng enzym trong huyết thanh do gan bị tổn thương bởi paracetamol và xác định coumestan có khả năng bảo vệ gan bằng cách làm dịu tổn thương tế bào gan gây ra bởi paracetamol [50]

1.4 S ơ LƯỢC VỂ BỆNH GAN VÀ MỘT s ố THUỐC DÙNG CHỮA BỆNH GAN

1.4.1 Bệnh về gan

Gan là một cơ quan rất quan trọng, một trung tâm chuyển hoá quyết định tình trạng sức khoẻ của cơ thể Hàng loạt các phản ứng diễn ra tại gan để đảm bảo việc thực hiện các chức năng giải độc, điều hoà và bài tiết mật Nhờ vào các phản ứng liên hợp, phản ứng acetyl hoá, phản ứng oxy hoá khử Các chất

-15-độc sinh ra trong quá trình thoái hoá hay ngẫu nhiên xâm nhập vào cơ thể sẽ

bị thay đổi cấu trúc, thay đổi tính chất và đào thải khỏi cơ thể Đây là chức năng khá quan trọng được thực hiện tại gan nhằm bảo vệ cơ thể khỏi bị độc hại

Nguyên nhân chính của các bệnh về gan là do hoá chất độc (Các thuốc kháng sinh, hoá học trị liệu, dầu tẩy nhuộm, aflatoxin, tetraclorua carbon, ), dùng quá nhiều rượu, sự lây nhiễm và sự rối loạn hệ tự miễn dịch, khoảng 90% của bệnh gan cấp tính là do virus Các loại virus chính liên quan là Hepatitis B, A, c, D (delta agents) E và G Sự lây nhiễm virus viêm gan B thường dẫn đến bệnh viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan ở vùng Đông nam á, có khoảng 14-16 triệu người bị lây nhiễm những virus này và khoảng 6% trong tổng số dân ở vùng này bị mắc bệnh [69]

Các bệnh về gan như viêm gan virus, viêm gan mạn tính, xơ gan, ung thư gan, gan nhiễm mỡ thưòng dẫn đến tình trạng thoái hoá cấu trúc gan, tổn thương các tế bào nhu mô gan và làm suy thoái các chức năng gan gây tổn hại đến các hoạt động bình thường của cơ thể, trong trường hợp gan nhiễm mỡ khả năng giải độc giảm đi gần 50% so với gan ở người bình thường Đối với trường hợp xơ gan, khả năng giải độc bị giảm 80% so với bình thường Vì vậy, khi gan suy yếu, khả năng giải độc giảm, nồng độ các chất độc trong cơ thể tăng lên, đặc biệt sự gia tăng amoniac sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng và là nguyên nhân gây ra hội chứng lão gan Như trong trường hợp viêm gan (viêm gan siêu vi trùng, viêm gan sốt vàng da do virus, viêm gan do thuốc hay hoá chất, ) Những triệu chứng chung thường gặp là mệt mỏi, sốt nhẹ, kém ăn, ngứa, nhạy cảm, đau vùng thượng vi phải, nước tiểu sẫm màu và phân xanh xám Nếu không được theo dõi và chữa trị kịp thời để tình trạng mãn tính kéo dài có thể làm tổn hại và thay đổi cấu trúc gan dẫn đến xơ gan, suy giảm chức năng gan và gây ra những hậu quả nghiêm trọng

1.4.2 M ột số thuốc chữa bệnh gan

Các thuốc chữa bệnh viêm gan cho tới nay vẫn là vấn đề khó khăn trong y học Đã có nhiều thuốc được đưa vào điều trị nhưng chưa có thuốc nào mang lại hiệu quả chắc chắn.

1.4.2.1 Thuốc hoá chất

- Đối với viêm gan cấp thuốc điều trị chủ yếu là vitamin và các thuốc

chữa triệu chứng như: tăng tuần hoàn gan, lợi mật, lợi tiểu, Egamin, Fortec, Lipacol, Omitan, Legalon

- Với viêm gan mạn có 3 nhóm thuốc điều trị chính:

+ Nhóm thuốc điều hoà miễn dịch: Corticoid, Levamisol, Thymogen, Interleukin -2, Interleukin -12

+ Nhóm thuốc kháng virus: Lamivudin, Ribaverin,

+ Nhóm Interferon có cả tác dụng kháng virus và điều hoà miễn dịch

1.4.2.2 Dược liệu chữa bệnh về gan

Có rất nhiều dược liệu và bài thuốc nói đến tác dụng bảo vệ gan Gần 150 nghiên cứu về hoá thực vật từ 101 loài cây thuốc có tác dụng liên quan đến bảo vệ gan [61]

Một vài dược liệu được ghi nhận về tác dụng bảo vệ gan chống lại ngộ độc

tế bào gan trên động vật được ghi ở bảng 1.2.

Bảng 1.2: Những cây thuốc có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương

gan gây ra bởi hóa chất trên động vật thí nghiệm.

tham khảo

26

-19-Ở Ân độ, hơn 87 dược liệu được sử dụng trong những sự kết hợp khác nhau trong 33 bài thuốc 9 dược liệu được sử dụng thường xuyên trong hầu hết những bài thuốc được ghi trong bảng 1.3 [19]

Bans 1.3: Những thực vật thường được sử dụng trong hầu hết các bài thuốc

Ghi chú: +: Đã được đánh giá trên động vật thí nghiệm

Chưa được đánh giá trên động vật thí nghiệm Một vài bài thuốc được thẩm tra về tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan gây ra bởi hoá chất trên động vật thực nghiệm (Bảng 1.4)

toàn: Sài đất (Wedelia caỉendulacea Less., họ Cúc Asteraceae), Sài lan

('Tridax procumbens L., họ Cúc Asteraceae), Chè rừng (Phyla nodiflora

Greene., họ c ỏ roi ngựa Verbenaceae) Dù vậy, cho đến nay chưa có công

trình khoa học nào nghiên cứu phân biệt sự khác nhau giữa chúng

-21-• Về hóa học

Trong Sài đất chứa nhiều thành phần hóa học khác nhau: dầu hòa tan, tanin, caroten, chlorophyll, saponin, phytosterol, sáp, nhựa, gôm, đường, alkaloid, isoflavonoid Các nghiên cứu hóa học từ thực vật này đã chứng minh trong nó có:

- Acid norwedelic [64]

- Norwedelolacton [64]

- Wedelolacton [62]

- (3-amyrin [63]

- Ba saponin acid oleanolic CÓ 2 dây nối đường: [65]

+ Saponin thứ nhất có cấu trúc = ( acid oleanolic + glucose + xylose + acid glucoronic)

+ Saponin thứ hai = Ginsenosid R0 = ( acid oleanolic + 2 glucose + acid glucoronic)

+ Saponin thứ ba chưa được xác định đầy đủ nhưng bước đầu thấy đây là một glycosid acid oleanolic với hai dây nối đường và một nửa P-D- glucosidyl ở vị trí 28 của acid oleanolic

Về mặt hóa học cây Sài đất vẫn còn nhiều vấn đề cần quan tâm

Theo tài liệu nước ngoài:

- Coumestan có nguồn gốc từ Wedelolacton được phân lập từ Sài đất là nhân tố ức chế có hiệu quả và chọn lọc men 5-lipoxygenase Wedelolacton

ức chế men 5-lipoxygenase bằng việc thu tóm những gốc o [31]

- Coumestan làm giảm rõ rệt sự tăng ngưỡng enzym huyết thanh do gan bị tổn thương bởi paracetamol Coumestan có khả năng bảo vệ gan bằng cách làm dịu tổn thương tế bào gan do paracetamol [50].

- Dịch chiết cồn của toàn bộ cây Sài đất thể hiện tác dụng bảo vệ, chống lại mô hình gây hại gan bằng tetraclorua carbon in vivo Dịch chiết này còn làm tăng lưu lượng mật ở chuột cống do kích thích dung lượng tiết ở gan [21]

- Bệnh gan cấp được gây bởi 3 chất độc với gan: tetraclorua carbon, acetaminophen trên chuột nhắt và D(+)-galactosamine trên chuột cống, sau đợt điều trị với Sài đất đã làm giảm hoạt độ của men SGOT và SGPT [54]

Vậy Sài đất có đúng có tác dụng bảo vệ gan không, bộ phận nào của cây, hoạt chất hoặc nhóm hoạt chất nào có tác dụng bảo vệ gan Có thể sử dụng cây Sài đất làm thuốc bảo vệ gan như thế nào Đó là những vấn đề khoa học cần được làm sáng tỏ Nội dung của luận văn này sẽ góp phần giải đáp những yêu cầu trên, mục đích cuối cùng là góp phần đưa Sài đất thành một dược liệu dùng trong điều trị bệnh về gan

Cây Chè rừng được thu hái ở khu vực Thanh Oai-Hà Tây (mọc hoang).

2.1.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Quan sát bằng mắt Sử dụng các dụng cụ phân tích thông thường

Kính hiển vi và máy camera kỹ thuật số

Vi phẫu thân, lá được cắt bằng máy cắt và nhuộm kép theo phương pháp chung [9]

Phân tích hạt phấn được làm theo phương pháp làm tiêu bản phấn hoa và bào tử [9]

2.2 NGHIÊN CỨU VỂ HOÁ HỌC

2.2.1 Nguyên liệu

- Dược liệu là toàn bộ phần trên mặt đất của cây Sài đất thu hái ở vườn cây thuốc của trung tâm trổng và chế biến cây thuốc Hà nội

- Các dung môi, hoá chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết

- Bản mỏng Silicagel 60 F254 tráng sẵn của hãng Merck

- Hạt silicagel cỡ 80-160 |im của Merck (dùng chạy cột)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phân tích sơ bộ thành phần hoá học có trong dược liệu Sài đất dựa vào các phản ứng định tính [5]

-24 Phân tích sơ bộ thành phần các nhóm chất bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [5]

- Phân tích định lượng flavonoid và saponosid bằng phương pháp cân

- Chiết tách phân lập các nhóm chất bằng phương pháp thông thường về hoá học, phương pháp sắc ký cột [5]

- Đo độ ẩm dược liệu bằng máy sấy “ULTRA” tại phòng phân tích tiêu chuẩn - Viện dược liệu

- Đo độ chảy bằng máy Kallen Kamp tại phòng nghiên cứu trung tâm- Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy PYE-UNICAM SP-800 và phổ hồng ngoại (IR) trên máy BERMAN ở dạng viên nén KBr tại phòng nghiên cứu trung tâm-Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ khối (MS) đo trên máy 5889-MS tại phòng cấu trúc -Viện hoá học- Trung tâm khoa học và công nghệ quốc gia

2.3 NGHIÊN CỨU VỂ TÁC DỤNG SINH HỌC

Kít định lượng GPT và bilirubin do hãng Human cung cấp

2.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy quang phổ tử ngoại khả kiến HP 8453 (UV-VIS)

Máy bán tự động Scout tại phòng dược lý sinh hoá- Viện dược liệu

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3.1 Xác định hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) in vitro (theo phương

pháp của Bladagarov và CS) [71]

* Nguyên tắc: Tiến hành peroxyd hoá chất lipid sẽ tạo ra một sản phẩm trung gian là malonyl dialdehyd (MDA) Xác định MDA bằng cách cho phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức trimethin có màu hồng và phổ hấp thụ cực đại ở Ằ, = 530 - 532 nm

* Tiến hành: Tạo lượng MDA từ peroxyd hoá lipid: ủ hỗn hợp 2 ml tween

80, 0,2 ml dung dịch FeS04 10'3 M; 0,2 ml dung dịch ascorbic 1 0 2 M và 0,2

ml dung dịch thử ở 40°c trong 48 giờ Định lượng MDA bằng cách tạo phức màu: Lấy 2 ml dung dịch ủ trên thêm 1 ml dung dịch acid tricloracetic 30%, lắc kỹ, ly tâm lấy dịch trong Lấy 2 ml dịch trong thêm 2 ml acid

thiobacbituric 0,25% Đo màu ở X = 530 - 532 nm.

* Tính toán: Từ hàm lượng MDA xác định, tính ra phần trăm bị peroxyd hoá và tính ngược lại là số phần trăm không bị peroxyd hoá được gọi là hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê

2.3.3.2 Xác định hoạt tính chống oxy hoá in vivo bằng việc xác định hàm lượng M DA ở gan (theo phương pháp Stroev E.A và Makarova V.G (1989))

5 ml dung dịch đệm tris pH=7,4, nghiền kỹ Hút 2 ml dịch sau khi nghiền, thêm vào đó 0,2 ml dung dịch FeS04 10'3M, 0,2 ml dung dịch acid ascorbic

-26-10 2M ủ hỗn hofp trên ở 37°c trong 15 phút Sau đó thêm vào 1 ml acid trichloacetic 30%, lắc kỹ, ly tâm ở 4200 vòng/phút Lấy 2 ml dịch trong sau ly tâm, thêm vào đó 0,2 ml dung dịch HC1 0,5N và 2 ml dung dịch acid

thiobarbituric 0,25% Lắc kỹ, đun ở nhiệt độ 100°c trong 15 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng, đo quang ở bước sóng x=532 nm Từ đó tính ra hàm

Quá trình phản ứng xảy ra như sau:

2-oxoglutarate + L-alanine ^ GPT ► L-glutarate + pyruvate

* Tiến hành: Chuột có trọng lượng từ 20-22g, được nuôi trong cùng điều kiện Gây viêm hoại tử gan bằng cách tiêm CC14 10% trong dầu thực vật Đồng thời cho chuột uống thuốc cần thử Sau 8 ngày cắt tiết chuột lấy máu, ly tâm ở 4200 vòng/phút trong 15 phút, lấy huyết thanh định lượng GPT

2.3.3.4 Xác định bilirubin [39], [50].

* Nguyên tắc: Liên kết albumin bilirubin được giải phóng bằng một chất phân giải Cho bilirubin phản ứng với dichloroaniline để tạo màu đỏ Sau đó

đo quang ở Ằ,=546 nm Từ đó tính ra hàm lượng bilirubin

* Tiến hành: Chuột có trọng lượng từ 20-22g, được nuôi trong cùng điều kiện Gây viêm hoại tử gan bằng cách tiêm CC14 10% trong dầu thực vật Đồng thời cho chuột uống thuốc cần thử Sau 8 ngày cắt tiết chuột lấy máu, ly tâm ở 4200 vòng/phút trong 15 phút, lấy huyết thanh định lượng bilirubin

-27-2.3.3.5 Xác định hình ảnh tổ chức học giải phẫu bệnh lý gan:

Quan sát đại thể và vi thể của tổ chức gan

2.3.3.6 Xác định tác dụng lợi mật ở chuột nhắt (theo phương pháp Rudi)

* Tiến hành: Dùng chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, không phân biệt đực cái trọng lượng 30-32 gam là loại chuột nhắt đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do trung tâm vaccin của Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

Cho chuột uống thuốc trước 3 ngày, ngày thứ 4: cho uống thuốc, sau 30 phút, mổ bụng, thắt ống mật chủ, khâu vết mổ lại, sau 30 phút, giết chuột, bóc tách mật Mật bóc tách được thấm vào giấy lọc rồi cân tươi ngay được mj (mg) Rạch túi mật, cho mật chảy ra hết rồi thấm vào giấy lọc, cân lại được rrio (mg) Lượng mật của mỗi con là :

m = m, - rrti ( mg)Lượng sinh mật (L) tính theo công thức:

ta: Hằng số Student (Với a=0,05 và a=0,01)

So sánh hai giá trị trung bình theo giả thiết trung bình cộng (Test T), chấp nhận ở 2 mức ý nghĩa của a (được quy ước là p ở 0,05 và 0,01)

Nếu a > 0,05: Hai giá trị khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Nếu a < 0,01: Hai giá trị khác nhau có ý nghĩa thống kê