Nghiên cứu đột biến gen BRCA 1 và BRCA 2 ở bệnh nhân ung thư vú ở việt nam

Kết quả thực hiện phản ứng PCR Kết quả tách dòng Tinh chế đoạn ADN mang đột biến Kết quả biến nạp ADN Plasmid vào tế bào E.Coli chủng INVaF ’ Kết quả tách chiết ADN Plasmid từ vi khuẩn E

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ■ ■ Dược HÀ NỘI ■ ■

LÊ THỊ MINH CHÍNH

LUẬN VĂN THẠC s ĩ Dược HỌC

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc tới: TS Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng Vỉ sinh vật học phân tử và GS.TSKH Đái Duy Ban- Phòng Miễn dịch, Viện Công Nghệ Sinh học - những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của TS Phùng Hoà Bình, phụ trách Phòng Đào tạo sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu; PGS, TS Phạm Quang Tùng, nguyên trưởng phòng đào tạo sau đại học; Phòng Đào tạo sau đại học; các thầy cô trong Bộ môn Dược lâm sàng; các bộ môn thuộc trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn Trong quá trình thu thập mẫu và làm thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình và có hiệu quả Tôi xin chân thành cảm ơn:

CN Bạch Thị Như Quỳnh, CN Trịnh Quý Bôn, CN Dương Hổng Quân và các bạn đồng nghiệp phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học.

- Thạc sĩ Hoàng Thị Minh Châu- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học.

- Khoa giải phẫu Bệnh viện K, Hà Nội.

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất cả các anh chị đồng nghiệp và bạn bè đã động viền, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 12 năm 2003

Lê Thị Minh Chính

4

479

10

11

12

151717

17 20 22 22

23

25

252526272727272828

2930313132

Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú

Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú

Chẩn đoán ung thư vú

Điều trị ung thư vú

Gen BRCA trong các trường hợp ung thư vú

Kỹ thuật PCR

Real-time PCR

Khái quát chung

Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR

Nguyên liệu nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hoá chất, thiết bị

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tách chiết ADN

Tách ADN từ sinh thiết ung thư vú

Tách ADN từ máu

Phương pháp xác định nồng độ và độ tinh sạch của

AND bằng đo quang phổ OD 260/280

36

39

44474749

505455

5557

59

60

6064

6567717384

PHẦN 4 - KẾT QUẢ BÀN LUẬN VÀ THựC NGHIỆM

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Kết quả tách chiết ADN từ sinh thiết khối u, máu của

bệnh nhân ung thư vú và những phụ nữ cùng huyết

thống

Kết quả tách chiết AND từ mẫu sinh thiết khối u của

bệnh nhân ung thư vú

Kết quả tách chiết ADN, từ mẫu máu của 15 bệnh nhân

ung thư vú và 36 mẫu máu của chị em gái ruột các bệnh

nhân

Kết quả thực hiện phản ứng PCR

Kết quả tách dòng

Tinh chế đoạn ADN mang đột biến

Kết quả biến nạp ADN Plasmid vào tế bào E.Coli chủng

INVaF ’

Kết quả tách chiết ADN Plasmid từ vi khuẩn E.Coli

Kết quả tinh sạch vector tái tổ hợp

Kết quả xác định trình tự gen

Thực hiện phản ứng giải trình tự

Kết quả giải trình tự đoạn ADN mang đột biến 185

delAG exon 2 BRCA 1

Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến 6174 del T

exon 11 BRCA 2

Kết quả thực hiện phản ứng Real time PCR

Thực hiện phản ứng Real time PC

Kết quả phát hiện đột biến 185delAG exon 2 BRCA1

Kết quả phát hiện đột biến 6174 del T exon 11 BRCA 2

4.2.BÀN LUẬN CHUNG

PHẦN 5 - KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

PHẦN 6 - TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN 7 - PHỤ LỤC

ADN Acid Desoxyribonucleic

APS Amonium persulfate

ARN Acid Ribonucleic

ATP Adenine Triphosphat

EtBr Ethidium bromide

GTP Guanine Triphosphat

Kb Kilo base

LB Môi trường thịt để nuôi cấy

MWM Molecular weight marker (yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử)PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase để nhân

bản các đoạn ADN trong phòng thí nghiêm PMC Prophylactic Contratateral Mastectomy (Phương pháp cắt bỏ

tuyến vú còn lại)

PO Prophylactic Oophorectomy (Phương pháp dự phòng cắt 2 buồng

trứng)RAPD-PCR Random Amplified Polymorphic ADN(kỹ thuật phân tích ADN

được nhân bản ngẫu nhiên)RT-PCR Revers transcriptase- PCR ( phản ứng PCR ngược)

SDS Dung dịch Sodium clodecyl sulfate

TAE Đệm TAE (Tris-HCl, Boric acid, EDTA-pH8,5)

TBE Dung dịch đệm (Tris-HCl, Boric acid, EDTA- pH 8,5)

TE Dung dịch đệm TE (Tris-HCl, EDTA)

TEDMED Tetramethylenethylen diamin

TTP Thimine Triphosphat

ƯTV Ung thư vú

YAC Yeast Artificial Chromosomes (nhiễm ịỉắc thể nhân tạo của nấm

men)

và Canada [10] Tại Việt Nam, theo điều tra ung thư ở Hà Nội năm 1998, tỷ

lệ số người mắc ung thư vú là 20,3/100.000 người, đứng đầu trong các loại

ung thư ở nữ Theo thống kê của Bệnh viện K, Hà Nội năm 2000, tỷ lệ ung

thư vú là 17,4/100.000 người Ở các tỉnh phía nam, tỷ lệ ung thư vú ở phụ

nữ là rất cao chỉ sau ung thư cổ tử cung và chiếm tới 27% trong tất cả các trường hợp ung thư ở phụ nữ [5], [10]

Tỷ lệ ung thư vú trên thế giới có chiều hướng gia tăng, nhưng tỷ lệ tử vonơ lại có chiều hướng giảm do được chẩn đoán và điều trị sớm Ngoài các phương pháp chẩn đoán bằng tế bào học, mô học, gần đây các phương pháp chẩn đoán trên cơ sở kỹ thuật sinh học phân tử cũng được ứng dụng rất nhiều trong nghiên cứu và chẩn đoán ung thư vú [3], [11], [17] Hai gen có liên quan mật thiết tới quá trình phát triển ung thư vú đã được thế giới nghiên cứu rất nhiều là BRCA1 và BRCA2 Có nhiều bằng chứng cho thấy

sự đột biến ở hai gen này có thể làm cho nguy cơ ung thư vú gia tăng [26], [35], [55], [63]

Sự đột biến này rất phức tạp, nhưng hay gặp nhất là đột biến 185 delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc exon 11 của BRCA2

[65], [73], [74] Chúng tôi tiến hành đề tài: “N ghiên cứu đột biến gen

B R C A 1 và BRC A2 ở các bệnh nhân ung th ư vú ở V iệt N am ” để góp phần

tìm hiểu mối liên quan giữa ung thư vú và đột biến gen BRCA1,

BRCA2 ở người Việt Nam.

Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu đột biến tại các điểm 185 delAG thuộc exon 2 của BRCA1 và 6174 delT thuộc exon 11 của BRCA2.

Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên ở nước ta về vấn đề này Hy vọng kết quả của đề tài sẽ giúp chúng ta hiểu biết thêm về mối liên quan giữa một

số đột biến di truyền với bệnh ung thư vú ở người Việt Nam, để có các biện pháp chẩn đoán, dự phòng và gợi mở cho những nghiên cứu tiếp theo

*

ra các biến đổi bệnh lý cho toàn bộ cơ thể.

Theo quan điểm hiện đại, quá trình ung thư hoá có thể chia làm hai giai đoạn: khởi phát và tiến triển Giai đoạn khởi phát (initiation) là giai đoạn bị các yếu tố tấn công vào vật liệu di truyền (ADN) với ngưỡng thấp hoặc dưới ngưỡng Giai đoạn tiến triển (promotion) là giai đoạn bắt đầu có các tế bào u xuất hiện một cách thầm lặng Những yếu tố tấn công gây ung thư (carcinogen) như rượu, thuốc lá, các tia bức xạ ion hoá , thường tác động nhiều lần với một nsưỡng nhất định Giai đoạn nàv kéo dài hàng chục năm cho tới khi khối tế bào ung thư phát triển tới kích thước có thể phát hiện được trên lâm sàng Thông thường, khi đó đã là giai đoạn muộn, thời gian sống của người bệnh không còn được bao lâu Trong thời gian gần đây, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật y học, khá nhiều bệnh ung thư được phát hiện sớm, điều trị kịp thời đã kéo dài đáng kể sự sống của người bệnh [5], [11]

Năm 1976, Dominique Stehelin (Pháp) cùng với Michael và Hazold (Mỹ) đã tìm thấy các tiền gen có khả năng gây ra ung thư (protooncogen) ở người Dưới ảnh hưởng của một số yếu tố, các tiền gen sẽ chuyển thành gen gây ung thư (oncogen) Hiện nay, người ta đã phát hiện được trên 40 loại oncogen [2], [13] Tế bào invitro của người bình thường được cấy các gen gây ung thư này sẽ chuyển thành tế bào ung thư

Quá trình sinh ung thư được trình bày tóm tắt ở hình 2.1 [2].

Các yếu tố môi trường

Đâv là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng quan trọng ở nhiều khu vực trên thế

giới, đặc biệt là ở các nước phát triển

Thay đổi bộ gen của tế bào thân

Các yếu tố

di truyền

Theo Parkin D.M, và cs., ở các nước phát triển ƯTV đứng hàng thứ 4 trong số các loại ung thư hay gặp, hàng năm có 347.900 trường hợp mắc mới, còn ở các nước đang phát triển UTV đứng hàng thứ 5 và có 224.200 trường hợp mắc mới hàng năm Nhìn chung, UTV có tỷ lệ mắc cao nhất ở các nước châu Âu Châu Phi và châu Á có tỷ lệ mắc thấp nhất [10].

Trong những thập kỷ qua, tỷ lệ ƯTV ngày càng có xu hướng gia tăng Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Mỹ, tỷ lệ UTV ở người Mỹ đã tăng từ 80/100.000 người trong năm 1975 tới 105/100.000 người trong năm 1985

và 178/100.000 người trong năm 1998 [55] [63], Nghiên cứu của Nazario C.M và cs cho thấy tỷ lệ mắc ƯTV ở Puerto Rico đã tăng từ 15,3/100.000 người trong giai đoạn 1960-1964 lên 43,3/100.000 trong giai đoạn 1985-

1989 và tỷ lệ chết do ung thư tương ứng với các giai đoạn này tăng từ 5,7/100.000 người lên 10,6/100.000 người[55] Tại vùng Vaud, Thuỵ Sĩ, tỷ

lệ ƯTV đã tăng từ 2,1/100.000 phụ nữ (1977-1979) lên 9,4/100.000 phụ nữ (1992-1994) [52] N ghiên cứu của Goelen và cs cho thấy ở Australia tỷ lệ mắc UTV là 37,0/100.000 người, tỷ lệ này táng theo tuổi (ở nhóm tuổi 50-

69 là 78,0/100.000 người)

* Theo báo cáo của Khoo u s và c.s những năm gần đây, tỷ lệ mắc UTV

ở một số nựớc châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt là ở Nhật Bản, Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống phương Tày hoá Điều này gợi ý đến các yếu tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển ƯTV Tỷ lệ mắc UTV ở phụ nữ Hồng Kông hiện là 2,6/1.000 phụ nữ trên 40 tuổi [5] và ở Singapore là 4,8/1.000 phụ nữ ở độ tuổi 50-64 tuổi [10]

Ở phần lớn các nước, tỷ lệ tử vong do UTV tăng chậm dần do tuổi thọ trung bình tăng Tuy vậy, sau khi điều chỉnh theo lứa tuổi, tử vong do UTV tại 28 nước công nghiệp đã tăng đáng kể từ năm 1960 đến năm 1980 UTV ít gặp ở người dưới 25 tuổi và tần số mắc tăng dần theo tuổi Đối với các nước Âu, Mỹ, tỷ lệ UTV tăng vọt ở tuổi mãn kinh (lứa tuổi 40- 60) Riêng tại Mỹ, tỷ lệ mắc UTV tăng từ 30/100.000 dân ở nhóm dưới 35 tuổi lên đến 150/100.000 dân ở nhóm trên 35 tuổi [55]

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi tại Hà Nội là 20,3/100.000 nsười, đứng đầu trong số các loại ung thư ở nữ Tỷ lệ này tại thành phố Hồ Chí M inh là 17,1/100.000 người, đứng hàng thứ hai sau ung thư cổ tử cung [8], [10] Tuổi mắc UTV trung bình ở phụ nữ Việt Nam tập

trung chủ yếu ở độ tuổi 50- 59 tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30 Tỷ lệ mắc

UTV dao động ít ờ độ tuổi ngay trước và sau mãn kinh [10]

Bảng 2.1 Tỷ lệ mắc ung thư vú nữ ở Hà Nội

2.1.2.2 C ác yếu tố nguy cơ gây ung thư vú [2], [5], [10], [26].

Mặc dù bệnh sinh của UTV còn chưa được biết rõ, nhưng có một số yếu tố làm tăng nguy cơ phát sinh UTV Các yếu tố này gồm:

* Tiền sử gia đình:

Nguy cơ bị UTV tăng từ 1,5-3 lần nếu người phụ nữ có mẹ hoặc chị

em gái mắc bệnh này Đặc biệt khi phụ nữ có mẹ và các chị em gái bị UTV

ở tuổi tiền mãn kinh, thì nguy cơ mắc ƯTV của họ gần như tuyệt đối [12], [17] Nghiên cứu của Hamel N và cs cho thấy nguy cơ UTV đối với con gái sẽ tăng từ 1,7 lần nếu người mẹ bị UTV một bên lên đến 3,28 lần nếu

người mẹ bị UTV cả hai bên Vì vậy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong nguy cơ mắc UTV.

* Tiền sử sinh sản

Tuổi có kinh, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liên quan chặt chẽ với UTV Người ta đã chứng minh rằng ở những phụ nữ có kinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao hơn so với phụ nữ bình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển UTV Một số nshiên cứu bệnh - chứng khác c ũ n s cho thấy cứ chậm kinh lần đầu một năm thì nsuy cơ phát triển UTV sẽ giảm 20% [10], [18] Mãn kinh muộn sau tuổi 55 và tổng thời gian có kinh nguyệt trong cuộc đời người phụ nữ cũng là những yếu tố quan trọng trong nguy cơ gây ƯTV Phụ

nữ chưa mang thai có nguy cơ mắc UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có mang thai Sinh con sau tuổi 30 có nguy cơ bị UTV cao gấp 2-5 lần so với nhóm sinh con trước tuổi 19 [10], [17], [26]

*

* Thuốc tránh thai và điểu trị các hormon thay th ế

N hiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai trong thời gian dài với ƯTV Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1 lần Dùng hormon thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trong thời gian ngắn Nhưng dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10-20 năm nguy cơ mắc ƯTV tăng từ 1,5-2,0 lần [9], [10]

* C h ế độ ăn

Liên quan giữa UTV với chế độ ăn, đặc biệt là chất béo trong khẩu phần ăn vẫn còn nhiều tranh cãi Uống rượu 1-2 lần/ngày có nguy cơ phát

0

triển ƯTV gấp 1,2 lần Rượu có ảnh hưởng nhiều nhất trong phát triển UTV

ở phụ nữ dưới 30 tuổi[2]

* Cấc yếu tố môi trường

Sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hoá từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ

làm tăng nguy cơ phát triển ƯTV Sự phát sinh UTV có liên quan tới liều bức xạ, tuổi tiếp xúc đặc biệt là ở độ tuổi thanh niên

2.1.2.3 Bệnh sử tự nhiên của ung thư vú

* Đặc điểm tự nhiên của ung thư vú

UTV là loại bệnh diễn biến chậm, chỉ có < 3% số bệnh nhân ƯTV

tiến triển nhanh, dẫn đến tử vong trong vòng vài tháng Người ta ước tính từ khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có kích thước lc m thì mất khoảng 7- 8 năm Nhưng khối u từ 1 cm phát triển

ỷ

đến 2 cm thì thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng, ớ thời điểm này, nếu không được phát hiện và điều trị thì sau 2 năm tế bào uns thư đã di căn vào các hạch bạch huyết, vào máu và đi khắp cơ thể [5], [8], [21]

* Giai đoạn xâm nhiêm tại chỗ

Khối u nguyên phát nằm ở biểu mô của ống tuyến hay của tiểu thuỳ tuvến vú, xâm lấn vào mô lân cận, xô đẩy tuyến vú, rồi vượt khỏi mô tuyến

vú xâm nhiễm vào mô xuns quanh như da, làm co rút da, sần da cam, phù

nề da, đỏ và loét da Các tế bào ung thư xâm nhiễm đến cân cơ ngực, cơ ngực và thành nsực tạo nên một khối dính cứng [9], [10]

* Giai đoạn lan tràn

Tế bào ung thư theo đường bạch huyết đến các hạch để vào máu Các hạch này như một cái lọc, khi tế bào ung thư rời khỏi khối u nguyên phát sẽ theo mạng bạch huyết nông để đến các tầng hạch nách theo thứ tự tầng dưới, tầns giữa và tầng trên của hạch nách, tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi hoà nhập vào tuần hoàn tĩnh m ạch dưới đòn Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp (khoảng 3,0-3,8% các trường hợp UTV) di căn theo kiểu nhảy cóc (skip m etastasis) Ngoài ra, tế bào ung thư còn theo mạng bạch huyết sâu để đến chuỗi hạch vú trong nằm ở khoang liên sườn 2, 3, 4 dọc theo động mạch vú trong, từ đó vào mạch bạch huyết trung thất [8], [10], [54],

2.1.2.4 Chẩn đoán ung thư vú

* Sàng lọc và phát hiện sớm

Để sàng lọc và phát hiện sớm UTV, người ta áp dụng các phương pháp tự khám vú, khám lâm sàng và chụp X quang tuyến vú (mammography) [5], [8], [9] Việc sàng lọc UTV bằng chụp X quang có thể phát hiện được UTV thể ống tại chỗ, giảm được hơn 50% tỷ lệ số người bị UTV chết do bệnh này Các biện pháp dự phòng UTV đối với các phụ nữ có nguy cơ cao do yếu tố di truyền là rất có hiệu quả

* Chẩn đoán xác định:

Chẩn đoán xác định UTV nhất thiết phải có sự khẳng định của tế bào học và/ hoặc giải phẫu bệnh học [5], [8], [10] Trên thực tế lâm sàng, UTV thường được chẩn đoán dựa vào 3 phương pháp: lâm sàng, tế bào học và chụp X quang tuyến vú Nếu một trong ba yếu tố này còn nghi ngờ thì bệnh nhân sẽ được tiến hành làm sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định

* M ột s ố phương pháp mới chẩn đoán UTV [1], [3], [4].

Hiện nay, đã phát triển được một số phươns pháp chẩn đoán và theo dõi điều trị un2 thư vú mới như:

- Theo dõi sự biến đổi sinh học của CA 15-3 trong quá trình điều trị

để có cơ sờ dự đoán chính xác mức độ tái phát và di căn của ung thư vú

- Dựa vào sự biểu hiện và khuếch đại gen Her-2/neu trong ung thư vú nguyên phát để chẩn đoán và lựa chọn phác đồ điều trị cho thích hợp

- Liên quan giữa sự đột biến gen P53 với độ ác tính, di căn và đáp ứng với phác đồ điều trị

- Gen BRCA1 và BRCA2 cũng đang được các nhà nghiên cứu rất quan tâm Đột biến 2 gen này dẫn đến ƯTV ở phụ nữ trẻ tuổi mang tính di truyền

Tuy tỷ lệ đột biến 2 gen này là hiếm nhưng mức độ xuất hiện ung thư là rất cao Do vậy, việc phát hiện được đột biến ở 2 gen này rất có ý nghĩa trong việc phòns, phát hiện, điều trị dự phòng ung thư vú ở những người có tiền

sử gia đình bị uns thư vú Phươns pháp được áp dụns nhiều nhất trons nghiên cứu 2 gen này là kỹ thuật PCR, tách dòns và giải mã gen nhằm phát hiện đột biến

2.I.2.5 Điều trị ung thư vú [8], [9], [70].

Điều trị ung thư vú phụ thuộc vào độ tuổi, sức khoẻ cũns như tiên lượns bệnh, ung thư vẫn còn khu trú ở vú hay đã di căn Điều trị có thể bằng phẫu thuật, chiếu xạ, hoá trị liệu, hoóc môn trị liệu hay phối hợp nhiều biện pháp điều trị Điều trị dự phòng cho các phụ nữ có nauy cơ UTV cao do yếu tố di truyền là rất có hiệu quả

Năm 2000, Schrag D và cs đã khái quát lợi ích của chiến lược dự phòng đối với những phụ nữ bị ung thư vú và mang đột biến gen BRCA1

hoặc BRCA2 Solomon J.S và cs (2000) đã đánh giá quá trình điều trị cho những người được chẩn đoán là BRCA dươns tính và đưa ra những nhận xét sau đây Những phụ nữ ung thư vú có liên quan tới biến đổi gen BRCA1 hoặc BRCA2 thườn 2 có nsuy cơ cao với ung thư ở một bên vú và một bên buồng trứng Như vậv biện pháp để phòng ngừa ung thư thứ cấp xẩy ra ở phía đối diện là cần thiết Bằng phương pháp thống kê, người ta đã đánh giá tác dụng của các phương thức điều trị như điều trị bằng tam oxifen, các phương pháp dự phòns như phẫu thuật cắt bỏ cả hai bên buồng trứng (PO), cắt bỏ nốt bên vú còn lại hay (PMC) phối hợp các phương pháp điều trị để kéo dài tuổi thọ cho những nsười bị ung thư vú xẩy ở một bên và có đột biến gen BRCA1 hoặc BRCA2 Với mô hình Markov, người ta đã đánh giá xác suất tiến triển thành ung thư ở vú và buồng trứng đối diện và tử vong

do các ung thư này, tử vong do ung thư tiên phát và sự giảm tỉ lệ ung thư và

tử vong do các phươns pháp dự phòng bằng phẫu thuật, phẫu thuật phối hợp với trị liệu bằng tamoxifen hoặc chỉ dùns tamoxifen

Các phươns pháp được thực hiện dự phòns bao gồm: Dùng tam oxifen

5 năm, PO, PMC và phối hợp các phương pháp , sau đó so sánh hiệu quả của phương pháp này Kết quả cho thấy, ở những bệnh nhân lứa tuổi 30 bị

ung thư vú ở giai đoạn sớm với các đột biến BRCA thì có thể kéo dài tuổi

thọ trung bình 0,4 đến 1,3 năm với điều trị bằng tamoxifen, 0,2 đến 0,8 năm với PO và 0.6 đến 2,1 năm với PMC

2.2 GEN BRCA TRONG CÁC TRƯỜNG HỢP UNG THƯ v ú

Cornelisse C.J và cs (1996) cho rằng một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng của ung thư vú là yếu tố di truyền Các tác giả cũng cho rằng gen quan trọng nhất chịu trách nhiệm đối với ung thư vú là BRCA1 và BRCA2 Từ đầu thập kỷ 90, các nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư đã bắt đầu được tiến hành Hiện có 6 gen BRCA1, BRCA2, P53, Cowden, AR (ADNrogen

receptor gene) và TA (ataxia telangiectasia gene), có liên quan nhiều đến ung thư vú đang được chú trọng nghiên cứu (bảng 2)

Bảng 2.2 Những gen liên quan tới nguy cơ mắc UTV có tính di truyền [10]

Gen

Tỷ lệ

Liên quan tới UTV

Vị trí trên nhiễm sắc thể

Ưng thư đang xác định

não, bạch cầu

AR Hiếm Chưa rõ X ql 1.2-12 Vú nam

TA Thườn 2 2ặp Thấp 1lq22-23 Tăng sinh lympho

Tuỵ tỷ lệ đột biến gen BRCA1 và BRCA2 là hiếm, nhưng nếu có đột biến trong gen nàv dẫn tới mất allele thì nguy cơ ung thư trong gia đình sẽ tăng (Casey G và cs 1993, Lalle p và cs 1994) Đột biến gen BRCA1 và BRCA2 hiếm gặp trong ung thư vú đơn phát [12] Thống kê cho thấy có từ 50- 60% phụ nữ mang đột biến của 2 gen sẽ bị ung thư vú ở độ tuổi 70 Do vậy, những khám phá về gen BRCA1 và BRCA2 đã có ảnh hưởng rất lớn tới nghiên cứu ung thư vú Gil F., 1996 cho rằng việc xác định các m arker di truyền quyết định tính ung thư là một công việc nghiên cứu mang ý nghĩa quyết định trong ngành ung thư học Việc kiểm tra gen BRCA1 và BRCA2

kết hợp với việc tự kiểm tra thường xuyên để phát hiện sớm là phương pháp

dự phòng ung thư vú rất tốt

Gen BRCA1 nằm trên nhiễm thể 17q 12-21 được phát hiện vào năm

1990 sau đó được Miki và cs., W ooster và cs., xác định trình tự vào năm

1994 Người có thể đột biến dòng tế bào phôi của gen BRCA1 thường có nguy cơ ung thư biểu mô buồng trứng cao hơn và nguy cơ mắc các ung thư tuyến tiền liệt, đại tràng Một số nshiên cứu khác cho rằng gen BRCA1 rất

dễ bị tổn thương, chiếm 71% trong số các đột biến gen này gây nguy cơ ung thư vú Phụ nữ bị đột biến gen BRCA1 ước tính nguy cơ ung thư vú là

20% ở tuổi 40, 51% ở tuổi 50, 62% ở tuổi 60, 81% ở tuổi 70 và có nguy cơ

ung thư buồng trứng là 11% ở tuổi 60 Những biến đổi gen BRCA1 ở đàn ông cũng làm tăna nguy cơ phát triển ung thư tuyến liệt Easton và cs ước tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ

Một điều đáng chú ý là BRCA1 biểu hiện ở tuổi trẻ hơn (tuổi trung bình là 42,8 so với ung thư vú chung là 62,9) Những u này thường biểu hiện tỷ lệ tăng sinh cao và thường có dị bội thể Tỷ lệ tái phát đối với nhữns bệnh nhân ung thư vú có đột biến sen BRCA1 thấp hơn so với những ung thư vú khác

Có 5 loại đột biến với tỷ lệ cao, chiếm 40% các biến đổi thuộc gen BRCA1, trong đó đột biến 185 delAG là loại hay gặp nhất, chiếm khoảng 12% Nếu có đột biến này thì nguy cơ u n ơ thư vú là 16% và ung thư buồng trứng là 39% ở tuổi 50 Tuy nhiên, Jara L và cs (2002) nghiên cứu đột biến 185delAG ở 382 trường hợp thuộc các gia đình có tiền sử ung thư vú ở Chilê thì chỉ tìm thấy 1/382 trường hợp có đột biến 185delAG, chiếm 0.26%

Laplace- Marieze V và cs (1999) đã xác định trình tự vùng m ans mã thuộc gen BRCA1 để phát hiện đột biến ở 70 gia đình người Pháp có nguy

cơ ung thư cao Đột biến BRCA1 phát hiện thấy ở 24 % các gia đình được xét nghiệm, ở các gia đình này các trường hợp ung thư vú và ung thư buồng trứng xuất hiện ở phụ nữ còn tươns đối trẻ, và tồn tại cả hai loại ung thư là ung thư vú và ung thư buồng trứng ở cùng một bệnh nhân có thể giả định về khả năn2 có mặt của các đột biến BRCA1 Tuv nhiên, kết quả cho thấy tần suất xuất hiện đột biến BRCA1 thấp, như vậy có thể giả định rằng

có một số biến đổi gen không thể phát hiện được trong một số gia đình có thể là đột biến BRCA2 hoặc BRCAx nào đó chưa xác định được

Gen BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể 13 q ỉ 2 -ỉ 3, được phát hiện vào tháng 9 năm 1994 Nó là một gen lớn có 27 exon, mã hoá một protein có

3418 acid amin BRCA2 liên quan đến 35- 40% ung thư vú, mang tính di truyền trong những gia đình bị ung thư vú, gặp cả ở nam và nữ Nghiên cứu đột biến gen BRCA2 (Schubert E.L và cs.,1997) cho biết đột biến BRCA2 gây nguy cơ ung thư vú là 32% đối với người ở tuổi 50, 67% đối với người

ở tuổi 70 và tới 80% đối với những nsười ở lứa tuổi 90 Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy các đột biến BRCA2 làm tăng nguy cơ phát sinh ung thư vú nam giới, buồng trứng, tuyến tiền liệt, tụy và thanh quản [16]

Cho đến nay, chức năng của BRCA1 và BRCA2 chưa được xác định đầy đủ Các sản phẩm protein của cả hai gen này đều khu trú ở trong nhân

và được cho là tham gia vào điều hoà phiên mã Một số bằng chứng gợi ý

là BRCA1 và BRCA2 tham gia vào sửa chữa ADN Kết luận này dựa trên nhận xét là các protein của BRCA1 và BRCA2 tác động qua lại với Rad

51, một protein tham gia vào điều hoà việc tái tổ hợp và sửa chữa ADN chuỗi xoắn kép Theo quan điểm này, những đột biến của gen BRCA làm tiền đề cho những sai sót trong mã ADN, dẫn đến những đột biến trong những gen khác ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển của tế bào.Sự phức tạp của vấn đề này hiện nay đang được nghiên cứu tích cực

2.3 KỸ THUẬT PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được Kary Mullis và cs hoàn thiện vào giữa nhữns năm 80 đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử PCR cho phép phân lập và nhân bản một cách nhanh chóng, chính xác các đoạn ADN mong muốn trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ nếu biết một phần nhỏ trình tự ở 2 đầu của đoạn ADN cần phân lập

Đến nay nhiều kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu sinh học và ứng dụng sinh y đều được phát triển trên cơ sở kỹ thuật PCR như: kỹ thuật RT-PCR để nhân bản sợi bổ sung của ARN, RAPD- PCR, Real-time PCR Một đặc tính tuyệt vời khác của PCR là có độ nhậy và độ chính xác rất cao, thành phần hỗn hợp PCR đơn giản

Nguyên Ịý của PCR tương tự quá trình sao chép ADN trong tế bào, thực chất là quá trình tổn2 hợp ADN invitro nhờ enzvm ADN polymerase chịu

nhiệt Các bước cơ bản của PCR gồm:

- Biến tính ADN khuôn sợi đôi nhờ nhiệt độ cao: ADN sợi đôi trong đó

có đoạn ADN đích cần phân lập và nhân bản sẽ tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt

độ cao (thường ở 94- 96°C), tạo điều kiện cho mồi bám vào

- Lai mồi (primer) với khuôn ADN sợi đơn: khi nhiệt độ hạ thấp, cặp mồi (là các oligonucleotide thường có trên dưới 20 nucleotide) có khả năng bám (lai) vào ADN sợi đơn Điều khiển nhiệt độ bám thích hợp sẽ tạo khả năng cho mồi bám vào đúng vị trí mong muốn Số lượng mồi rất lớn sẽ cạnh tranh tốt với sự bám trở lại của sợi đôi ADN khuôn ban đầu

- Tổng hợp sợi ADN mới: ngay sau khi mồi bám vào ADN khuôn, enzym ADN polvmerase sẽ tổng hợp sợi ADN mới trên cơ sở kéo dài đầu 3 ’ của mồi, bằng cách gắn liên tiếp 4 loại nucleotide theo nguyên tắc bổ xung theo sợi ADN đơn làm khuôn mẫu Nhiệt độ sẽ nâng cao dần đến nhiệt độ tối

«

ưu cho enzym ADN polymerase hoạt động (thườns trong phạm vi 68- 72°C) trong một thời gian ngắn Sau đó nhiệt độ sẽ tăng lên cho quá trình biến tính ADN khuôn đê’ bắt đầu một chu kỳ mới.

Chu kỳ trên lặp lại nhiều lần (thường từ 25 - 40 lần) Các sợi mới tổng hợp trong chu kỳ trước sẽ đóng vai trò sợi ADN khuôn trons chu kỳ sau và tốc

độ tổng hợp sợi ADN mới sẽ tăng theo cấp số nhân, tạo hàng triệu bản sao sợi ADN mới trong một thời gian ngắn, đáp ứng số lượng cho yêu cầu nahiên cứu

Độ dài đoạn ADN cần nhân bản nằm giữa vị trí bám của cặp mồi trên 2 sợi của ADN khuôn (mỗi mồi chỉ bám vào một sợi nhất định) Thiết kế trình

tự mồi và điều khiển nhiệt độ lai mồi là yếu tố cơ bản để mồi bám đúng vị trí trên sợi khuồn và nhân bản đúng đoạn ADN mong muốn Kết quả cuối cùng

của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n

bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi Đó là đặc điểm quan trọn2 thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn đến kết quả là một đoạn ADN định trước được "nhân lên" với một lượng rất lớn Ví dụ sau 28 chu kỳ (228) số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là: 1073741824

2.4 REAL-TIME PCR

2.4.1 Khái quát chung

Real-time PCR do Higuchi R và cs phát minh năm 1992 Nguyên lý của Real-time PCR về cơ bản là giống với PCR, tuy nhiên Real-time PCR có sự khác biệt lớn so với PCR ở những điểm cơ bản sau đây:

- Đối với Real-time PCR, người ta có thể nhận biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm của quá trình khuếch đại Vì vậy đây là kỹ thuật rất hữu hiệu cho việc định lượng ADN hoặc ARN

*

- Có thể tự động hoá vì vậy xét nghiệm được số lượng mẫu lớn cần điện di để phát hiện sản phẩm sau khi tiến hành PCR

- Đây là phương pháp rất hữu hiệu để phát hiện nhanh các đột biến.

2.4.2 Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR

Green I tồn tại ở dạng tự do và không phát quang (A) Sau khi primer bắt cặp

với sợi khuôn, SYBR Green I bắt đầu liên kết với ADN và phát quang (B) Trong quá trình kéo dài chuỗi, đoạn ADN sợi kép dài dần, lượng SYBR Green

I liên kết cũng tăng dần kéo theo sự tăng dần của mức độ phát quang (C) sản phẩm PCR tăng theo cấp số nhân vì vậy cường độ phát quang cũng tăng theo theo chu kỳ của phản ứng (D) Bộ detector trong máy chuyên dụng sẽ nghi nhận và xử lý nhờ phần mềm Lượng sản phẩm PCR sẽ được nhận biết theo từng thời điểm trên màn hình máy tính và lưu vào bộ nhớ

+ Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR dựa trên sự bắt cặp của các mẫu dò đặc hiệu

Nguyên lý bắt cặp của các mẫu dò đặc hiệu (hay còn gọi là nguyên lý phát quang nhờ chuyển năng lượng cộng hưởng) được mô tả ở hình 2.4 Hai mẫu dò đặc hiệu số 1 và số 2 được gắn hai hợp chất phát quang khác nhau

Fluorescein ở đầu 3 ’ của mẫu dò số 1 và LC Red ở đầu 5’ của mẫu dò số 2

Khi mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 ở dạng tự do thì LC Red không phát quang vì

ở xa Fluorescein và không nhận được năng lượng từ Fluorescein (A) Sau khi mẫu dò số 1 và mẫu dò số 2 bắt cặp vào khuôn thì LC Red phát quang vì nhận được năng lượng từ Fluorescein (B) Quá trình tổng hợp chuỗi được tiến hành qua mỗi chu kỳ của PCR làm cho lượng sản phẩm PCR tăng dần (C,D) Số lượng mẫu dò số 1 và 2 bắt cặp vào khuôn cũng tăng dần và cường độ phát quang của LC Red cũng tăng theo Detector của máy chuyên dụng sẽ nhận túi hiệu phát quang của LC Red nhờ bộ lọc thích hợp với bước sóng của LC Red

* p y 00 2

mwr inmnTl MTTfflfM

Itinim /

Hình 2.4 Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên sự bắt cặp của

các mẫu dò (Probes) đặc hiệu.

+ Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR dựa trên khả năng thủy phân mẫu dò (TaqMan probe) nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5 ’ của Taq DNA polymerase.

Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên khả năng thủy phân mẫu dò nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5 ’ của Taq DNA polymerase được nêu

ở hình 5 Theo nguyên lý này, hợp chất phát quang (Repoter, R) và hợp chất dập tắt (Quencher, Q) cùng nằm trên một mẫu dò ở một khoảng cách nhất định Ở khoảng cách này, khi được kích hoạt R sẽ chuyển năng lượng cho Q làm cho Q phát quang và R không còn khả năng phát quang với bước sóng đặc hiệu của mình Khi R chưa được tách khỏi Q thì dù mẫu dò ở dạng tự do (A) hay bắt cặp (B), R cũng không phát quang Nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5’ của Taq DNA polymerase, R sẽ được thủy phân và tách khỏi mẫu dò Ở dạng

tự do, R sẽ phát quang vói bước sóng đặc hiệu của mình (C) Lượng sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng, lượng mẫu dò bắt cặp và được thủy phân cũng tăng kéo theo sự gia tăng cường độ phát quang (D) Detector của máy chuyên dụng sẽ nhận tín hiệu phát quang của R nhờ bộ lọc thích hợp với bước sóng của R

Hình 2.5 Nguyên lý hoạt động của Real-time PCR, dựa trên khả năng thủy

phân mẫu dò nhờ hoạt tính exonuclease đầu 5 ’ của Taq A D N polymerase.

2.4.3 ứng dụng của Real-time PCR

Real-time PCR là một phương tiện rất hữu hiệu để chẩn đoán nhanh bệnh ở người, vật nuôi mà không cần điện di sản phẩm PCR như các bệnh nguy hiểm do virut: vữut cúm (Matsuzaki Y., 2003), cytomegalovirus

t

(Hanfler J và cs, 2003), virut gây tiêu chảy ở bò (Hofmann M.A., 2003), virut Herpes (Wald A và cs 2003), virut HPV gâv ung thư (Taylor E.R và Morgan IM., 2003), virut lớ mồm long móng (Rasmussen T.B và cs, 2003), viêm gan

B (Mukaide M và cs, 2003), virut SARS (Poon L.L và cs, 2003) v.v Các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cũng được chẩn đoán rất hiệu quả như lao kháng thuốc (Rindi L và cs, 2003), vi khuẩn bệnh than (Ryu c và cs, 2003), dịch

hạch (Loiez c và cs, 2003), Helicobacter pylori gây viêm loét và ung thư dạ

dày (Lascols c và cs, 2003; Mikula M và cs, 2003) v.v Đặc biệt quan trọng, Real-time PCR còn là phương tiện tin cậy để phát hiện các đột biến, các

tế bào và các marker ung thư: phát hiện tế bào ung thư trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú (Stathopoulou A và cs, 2003; Baker M.K và cs, 2003), phát hiện nhanh bệnh hổng cầu hình lưỡi liềm do đột biến gen beta-globulin ở phôi trước khi sinh (Costa c và cs, 2003), phát hiện các tế bào ung thư máu

%

còn sót lại trong quá trình điều trị để tiên lượng bệnh (Hirt c và cs, 2003) Đánh giá các gen kiểm soát ung thư máu và mức độ biểu hiện của các gen này bằng Real-time RT-PCR định lượng đã được đưa vào chương trình phòng chống ung thư của Châu Âu (Beillard E và cs, 2003) Real-time PCR còn là một phương pháp được sử dụng trong việc định lượng ADN, ARN và đặc biệt trong việc đánh aiá mức độ biểu hiện của sen bởi vì mức độ biểu hiện quá mạnh hoặc quá yếu của một gen, đặc biệt là các gen kiểm soát quá trình phân bào và áp chế ung thư Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá cho các receptor ErbB hoặc các đồng phân của chúng có thể là chỉ tiêu chẩn đoán và tiên lượng trong quá trình điều trị ung thư bàng quang (Junttila T.T và cs, 2003) Tương

tự như vậy, các tác giả Hafner c và cs (2003) cũng sử dụng real-time RT-PCR định lượng để đánh giá mức độ biểu hiện của EphB6 trong các tế bào tạo sắc

tố bị ung thư và cho rằng sự giảm mức độ biểu hiện EphB6 có thể dẫn tới ung thư Đây cũng là một phương pháp để chẩn đoán và tiên lượng cho các bệnh nhân bị u ác tính tế bào tạo sắc tố

Real-time PCR còn là phương tiện hữu hiệu để phát hiện các đột biến

gen (Wilhelm J và Pingoud A., 2003) Đột biến gen TCOF1 thuộc exon 4 ở

bệnh nhân có hội chứng Treacher Collins đã được Marszalek B và cs (2003)

phát hiện bằng Real-time PCR Đột biến thuộc gen mã hóa MCP-1 (Monocyte

chemotactic protein-1) sẽ làm cho bệnh nhân viêm gan c có triệu chứng nặng

hơn và dễ biến chứng thành xơ gan (Muhlbauer M và cs, 2003) Hilbe w và

cs (2003) đã sử dụng real-time PCR với TaqMan probe để phát hiện 12 đột

biến codon K-ras ở 66 bệnh nhân ung thư phổi Các tác giả cho rằng real-time

PCR tự động với TaqMan probe là phương pháp đặc hiệu và cho phép sàng lọc

một số lượng lớn các đột biến K-ras ở các bệnh nhân uns thư phổi

Người ta cũns có thể sử dung real-time PCR với các mẫu dò lai

(hybridisation probes) để phát hiện các đột biến Steffensen R và cs (2003) đã

sử dụng phương pháp này để phát hiện nhanh các đột biến gen MBL2

(mannose-binding lectin 2 gene) ở 100 người Đan Mạch và 30 người Phi Kết

quả cho thấy Real time- PCR là một phương pháp nhanh và tin cậy đê

phát hiện đột biến.

2.5 VECTOR TÁCH DÒNG

2.5.1 Khái niệm về vector tách dòng [5]

Có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, YAC Người ta chọn sử

dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục

đích tạo dòng

Vector sử dụng cho mục đích tách dòng cần phải có các đặc tính sau:

- Có khả năns sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào

sự sao chép bộ gen tế bào chủ

- Có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thê’ thu nhận một lượng ADN tối đa và dễ dàng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và được sao chép hiệu quả.

- Có các đặc tính cho phép dễ dàng phát hiện chúng trong tế bào vi khuẩn có chứa chúng, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen chọn lọc Thông thường đó là các đặc tính kháng chất kháng sinh, giúp vi khuẩn có mang vector sống được trên môi trường có chất kháng sinh, hoặc có khả năng sản sinh một enzym chuyển hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch

- Vector phải tồn tại được trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ

- Vector phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượns tối

đa enzym giới hạn, nhằm tạo thuận tiện cho việc chèn, cắt và các thao tác khác trên vector Nhờ vậy mà một khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính giữa gen và làm bất hoạt gen đấy

Trong số các loại vector hiện có, các plasmit được sử dụng rộn2 rãi nhất Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid, thế hệ sau là sự cải tiến của thế

hệ trước và ngày càng mang nhiều đặc tính quí báu cho việc tạo dòng

2.5.2 Plasmid pCR 2.1

Plasmid pCR 2.1 (hình 2.6), của hãng Invitrogen là vector tách dòng hay được dùng nhất hiện nay Nó có kích thước 3.9 kb, được thiết kế gắn một operon chuyển hoá đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promotor của operon này và gen cấu trúc mã hoá cho beta glactosidase có

vùng cắt gắn với 17 vị trí cắt cho các enzym giới hạn: EcoR I, Hind III, Nsi I,

I, Apa I trong đó EcoR I, BstX I có 2 vị trí cắt Nếu vector đính hoặc không

đính đoạn ADN ngoại lai, sản phẩm beta glactosidaza sẽ được tạo ra hoặc không, kèm theo màu chỉ thị Dựa vào màu chuẩn đó có thể lựa chọn dễ dàng những tế bào mang vector tái tổ hợp Ngoài ra, vector pCR 2.1 có chứa gen kháng Ampixilin và kanamyxin, nên có thể sinh trường bình thường trên môi trường có chứa khánh sinh ampixilin hoặc kanamyxin với nồng độ ức chế tối thiểu.

H ình 2 6 Vectơ tách dòng pCR 2.1 của hãng Invitrogen

PHẦN 3

NGUYÊN LIỆU, NỘI DƯNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

3.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu sinh thiết khối u của bệnh nhân ung thư vú (được chấn đoán huyết học và tế bào học - là bệnh ung thư vú) được lấy tại Bệnh viện K

- Máu của bệnh nhân ung thư vú và một số thành viên cùng huyết thống với bệnh nhân

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết ADN từ sinh thiết khối u ung thư vú, từ máu của bệnh nhân và máu của mẹ và chị, em gái của một số bệnh nhân ung thư vú

- Tạo dòns và giải trình tự vùng ADN mang đột biến 185delAG thuộc exon2 của gen BRCA1

- Tạo dòng và giải trình tự vùng ADN mang đột biến 6174delT thuộc exonl 1 của gen BRCA2

- So sánh trình tự đã xác định với các trình tự công bố trong Neân hàng

Dữ liệu gen Quốc tế để xác định xem vùng đã giải mã có mang đột biến 185delAG hoặc 6174delT hay không

- Lấy mẫu ADN đã xác định làm đối chứng để phát hiện các đột biến 185delAG thuộc exon2 của gen BRCA1 và đột biến 6174delT thuộc e x o n ll của gen BRCA2 bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụns công nghệ TaqMan

3.3 Sơ đồ thiết kê nghiên cứu

Thu mẫu mô, máu người bệnh ung thư vú, máu người có liên quan

ị

Hình 3.1 Thiết k ế nghiên cứii

3.4 Hoá chất, thiết bị

Hoá chất:

- Nitơ lỏns, Ethanol, Phenol, Chloroform, NaCl, KC1, Agarose, Isopropanol, EDTA, Tris HC1

- Các enzym: Taq ADN polymeraza, Proteinaza K

- dNTP, TaqManR Universal PCR Master Mix, No AmpErase Ung 2X, 40X assay Mix (hệ thống mồi PCR và probes FAM™ADN VICR dye- labeled), plasmid pCR 2.1

Máy móc thiết bị:

Máy li tâm lạnh Sorvall Biofuge Pico, máy lắc ổn nhiệt MSI

M inishaker, bộ nsuồn điện di Biorad Power PAC 300 của Advance Co., Ltd., máy chụp ảnh điện di Pharmacia Biotech, máy Speed Vac Plus s c 110A, máy hút chân không, máy PCR GenAmp System 9700 (Applied Biosystems), máv đo quang phổ Gene Quant RNA/DNA calculator (Pharmacia), tủ hút, máy Real-time PCR ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), Máy giải trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems)

Dụng cụ:

ố n ơ hút vi lượng Pipetteman (Gilson), Eppendorf chày cối sứ, găng tay, bình tam giác, ống đong,

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp tách chiết ADN

3.5.1.1 Tách ADN từ sinh thiết ung thư vú (theo Ausubel F và cs

(Ỉ995)[19]

Bước 1 Phá màng tế bào và màng nhân bằns cách nghiền mô trong nitơ lỏng,

có bổ sung dung dịch đệm chiết và proteinase và proteinase K

Bước 2 Loại bỏ các thành phần không mons muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein bằng dung dịch phenol bão hoà TE

Bước 3 Tủa ADN trons etylic alcohol.

Bước 4 Tinh sạch sản phẩm ADN

Bước 5 Kiểm tra sản phẩm ADN

3.5.1.2 T ách ADN từ m áu (theo Ausubel F và cs (1995)[ 19]

B ư ớ cl Loại bỏ huyết sắc tố bằng PBS (NaCl, KC1, Na2HPƠ4, KH2PO4

Bước 2 Phá vỡ màng tế bào và màng nhàn bằng SDS và proteinase K

Bước 3 Loại bỏ các protein và tạp chất bằng phenol:chloroform

Bước 4 Tủa ADN trong etylic alcohol

Bước 5 Tinh sạch sản phẩm ADN

Bước 6 Kiểm tra sản phẩm ADN

3.5.2 Phương pháp xác định nồng độ và độ tinh sạch của ADN bằng đo quang phổ OD 260/280 [5], [7].

N guyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng

260nm của các base purin và pyrimidin, các protein hấp thụ mạnh ở bước sóng 280nm

Đ iều kiện: Các dung dịch acid nucleic phải sạch.

Cách tín h : Nồng độ A D N trong mẫu được tính theo công thức:

C- adn = A-260 x 5 0 X d

CADN: Nồng độ ADN (|Lig/ml)

A260: Hấp phụ ADN ở bước sóng 260 nm

50: Hệ số hấp thụ ADN sợi kép ở bước sons 260 nm (50 ịig ADN/ml

3.5.3 Phương pháp điện di

Gel Agarose:

Là loại gen để tách những đoạn ADN có kích thước khoảng 0,5-20 kb Gel được đổ trên 1 giá thể nằm ngang, phương của điện di là phương nằm ngang

• Tách các đoạn ADN nhỏ có chiều dài dưới 500 bp

Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng Bản gel polyacrymide gồm 2 lớp Lớp dưới: gel phân tách, lớp trên: gel cô

Gel phân tách: HiO khử ion vô trùng

Tris HCI pH=8,8 Acryamide 30%

Glycerol 50%SDS 10%

APS 10%

TEDMED

Gel cô: H :0 khử ion vô trừng

Tris HCl pH=6,8 Acryamide 30%

- Tất cả các ADN- polymerase khi hoạt độnơ tổns hợp một mạch ADN

mới từ mạch khuôn đều cần phải có những mồi chuyên biệt

- PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, do vậy phải có sự tham gia của enzym chịu nhiệt ADN- polymerase

Thành phần:

- ADN khuôn.

- 2 đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN

- Taq ADN- polvmerase

- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotid ( ờ dạng dNTP)

- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (M g++) và nước tinh khiết (không có ADNase, A R N ase )

(Dung tích tổng số cho phản ứng PCR là 25 |!g/ml)

Tiến hành:

- Thiết kế cặp mồi để khuếch đại vùng ADN mang đột biến 185 delAG thuộc exon 2 của gen BRCA1, 6174 delT thuộc exon 2 của gen BRCA2

- Chuẩn bị các thành phần khác cho phản ứng PCR: Taq buffer, Taq ADN -Polym erase, dNTPs, MgCk, nước khử ion vô trùng

- Trộn hỗn hợp phản ứng trong Eppendorf

- Chạy PCR trên máy PCR Gen Ampsystem 9700 (Applied Biosystems) theo chu trình nhiệt của kv thuật touchdown PCR.

3.5.5 Phương pháp tinh chè sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ Kit S.N.A.P của Hãng Invitrogen, theo qui trình sau:

- Chuẩn bị gel tinh chế: gel Agarose 1%

- Bổ sun2 dung dịch tra mẫu 6X vào sản phẩm PCR tra vào các giếng theo thứ tự để đánh dấu

- Điện di sản phẩm PCR

- Cắt băng ADN trong gel tươns ứns với chiều dài đoạn ADN mang đột biến

- Tinh sạch đoạn ADN bằng bộ kit S.N.A.P

- Kiểm tra ADN thu được bằng điện di Polyacrylamid

ADN thu được có thể tiến hành ngay với các thí nghiệm khác hoặc bảo quản ở

- 20 °c.

3.5.6 Phương pháp tạo dòng [4], [6], [7], [19].

3.5.6.1 Gán ADN vào plasmid

Tách dòng sản phẩm PCR mang đột biến 6174delT và 185delAG đượctiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1, sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng và qui trình của hãns Invitrogen

o Để trên đá 10 phút Ly tâm lạnh Thu cặn Bỏ dịch,

o Hoà cặn trong CaCb , giữ lạnh 1 2ĨỜ trước khi biến nạp

- Biến nạp:

o Trộn vectơ tái tổ hợp với tế bào trong ống Eppendorf

o Để trên đá 30 phút

o Sốc nhiệt ờ 42 °c trong thời sian 1 phút 30 giây,

o Bổ sung môi trường LB lỏng,

o Nuôi lắc ờ 37°c, 200 vòng/phút Thời sian 1 giờ

o Cấy trên đĩa petri môi trường thạch LB chứa Ampixilin, X-gel

3.5.Ó.2 Phương pháp tinh sạch vector tái tổ hợp

Tinh sạch vector tái tổ hợp bằng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit dohãng Invitrogen cung cấp theo quy trình của nhà sản xuất

3.5.6.3 Tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E coli

- Ly tâm dịch nuôi cấy Bỏ dịch Thu cặn

- Tách ADN bằnơ chloroform: isoamyl alcohol (24:1)

- Tủa ADN plasm id bằng etylic alcohol 100% Loại ARN bằngARNase

3.5.7 Phương pháp xác định trình tự AND [62]

Giải trình tự ADN trên cơ sở phương pháp của Sanger (1976), sử dụng

bộ kít phản ứng giải trình tự BigDye® Terminater v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) theo qui trình của nhà sản xuất và sử dụng 2 mồi M13F và M13R để giải trình tự ADN sợi đôi nhằm thu được kết quả chính xác Giải trình tự được tiến hành bằng máy tự động ABI 3100- Avant Genetic Analyzers (Applied Biosystems, USA)

3.5.8 Phương pháp Real-time PCR xác định đột biến sử dụng công nghệ TaqMan [38], [43], [52], [60],

Được tiến hành trên máy Realtime-PCR ABI Prims 7000 (Mỹ) Hoá chất do hãng Roche (New Jersey, USA) cung cấp

Nguyên lý:

Sử dụng hai mẫu dò (probes), một mẫu bắt cặp đặc hiệu với allele thường (không đột biến) gắn chất màu phát quang VIC, một mẫu bắt cặp đặc hiệu với allele đột biến tương ứng gắn chất màu phát quang FAM (6- carboxyfluorescein) (hình 3.2)

Bộ detector của máy ABI Prism 7000 sẽ nhân tín hiệu phát quang với

các bước sóng khác nhau của VIC, VIC + 6-FAM và 6-FAM nhờ bộ lọc màu

thích hợp và phần mềm máy tính sẽ phân ra thành ba vùng riêng biệt: vùng

đồng hợp tử không đột biến, vùng dị hợp tử và vùng đồng hợp tử đột biến

(hình 3.3) Quá trình này được gọi là sự tách biệt allele (allelic

discrimination)

y ria ip Au y o i u ạ Ạn>i»nv u i> n m im « u v n Ạ r\q y u uJ

Marker: [Ãpõc3 ▼ ; £dl: [Allele X j r j f j 0 IS IỄ D I ẽ O

AHelic Discnmination

Hình 3.3 Sự tách biệt allele bằng real-time PCR với công nghệ

TaqMan và máy tự động ABI Prism 7000 Vùng A th ể hiện mẫu đồng hợp tử

tử đột biến.

Phân tích kết quả

Sau khi phản ứn2 kết thúc, kết quả được phân tích bằng các phần mềm phân tích chuyên dụng