Trên thế giới hen suyễn là một trong những bệnh mãn tính phổ biến nhất và các thuốc chống hen suyễn ngày càng được sử dụng rộng rãi. Thật vậy, ở những nước công nghiệp chi phí cho điều trị hen suyễn chiếm 12% chi phí y tế, có thể do môi trường sống bị ô nhiễm, đời sống bị căng thẳng, ngày càng có nhiều các tiếp xúc với các vật dụng, thuốc men và các hóa chất. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong trị liệu nhưng ảnh hưởng của hen suyễn, chết do hen suyễn và số bệnh nhân nhập viện vì hen suyễn không ngừng tăng trong thập niên vừa qua 19. Theo số liệu thống kê, ở Việt Nam, số người mắc bệnh chiếm khoảng 45% dân số. Trong tương lai các nhà khoa học đã cảnh báo rằng đến năm 2025, thế giới sẽ có thêm 100 triệu người mắc bệnh hen suyễn, và chủ yếu gia tăng ở các thành phố lớn. Cũng như hen suyễn, bệnh viêm khớp dạng thấp cũng đã trở thành một mối đe dọa lớn. Viêm khớp dạng thấp có thể gặp ở mọi quốc gia, mọi chủng tộc, mọi lứa tuổi và mọi giới. Tỷ lệ mắc bệnh chung là 13% dân số trên 15 tuổi, bệnh thường gặp ở nữ (75%) và thường gặp ở độ tuổi từ 30 60. Viêm khớp dạng thấp là bệnh khớp mạn tính, thường kéo dài nhiều năm và đeo đẳng người bệnh suốt cuộc đời, đây cũng là một bệnh lý tự miễn với các biểu hiện tại khớp, ngoài khớp, toàn thân ở nhiều mức độ khác nhau, diễn biến phức tạp, gây hậu quả nặng nề. Bệnh tuy ít khi trực tiếp làm chết người nhưng làm giảm chất lượng cuộc sống, gắn liền với đau đớn, mất sức, và tật nguyền… nên cần phải được điều trị tích cực ngay từ đầu. Ngoài hen suyễn, viêm khớp dạng thấp còn có nhiều dạng viêm khác đã và đang gây ảnh hưởng tiêu cực cho người bệnh. Do đó, việc tìm và phát triển những hoạt chất có tác dụng trong điều trị các bệnh viêm là một nhu cầu cấp bách, hết sức cần thiết và quan trọng. Trong nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện vai trò tích cực của cAMP trong các tế bào viêm. Trong hầu hết các tế bào viêm, việc nâng cao mức độ AMP vòng (cAMP) có vai trò ức chế sự đáp ứng tế bào (ức chế phóng thích chất trung gian) làm giảm nhẹ các triệu chứng viêm. Và một phương pháp hiệu quả làm tăng mức AMP vòng này là sự ức chế hoạt động trung gian của enzym phosphodiesterase (PDE). Vì thế, nhiều công trình nghiên cứu định hướng đến việc tìm ra và phát triển những hợp chất có khả năng ức chế hiệu quả và chọn lọc PDE giúp cho việc điều trị các bệnh viêm cấp tính và mãn tính, điển hình là bệnh viêm khớp dạng thấp và bệnh hen suyễn. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra những dẫn chất phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc và hiệu quả phosphodiesterase (PDE), đặc biệt là PDE4. Nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã thực hiện quá trình tổng hợp các phthalazinon có hoạt tính, trong đó tại khoa Dược trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh cũng đã có đề tài tổng hợp thành công các dẫn xuất cistetra và cishexa hydro phthalazinon. Tiếp nối đề tài của năm trước, chúng tôi thực hiện khóa luận: “Tổng hợp các hợp chất quang hoạt cis(+) và cis()4(3,4dimethoxyphenyl)hexahydrophthalazinon có hoạt tính ức chế chọn lọc phosphodiesterase 4 ”. Từ mục tiêu trên chúng tôi đặt ra những mục tiêu cụ thể sau: Tổng hợp acid cis2(3,4dimethoxybenzoyl)cyclohexan và cyclohexen carboxylic dạng racemic từ anhydrid cis1,2cyclohexan và cyclohexen dicarboxylic và dẫn chất của benzen là 1,2dimethoxybenzen Đóng vòng acid carboxylic vừa tổng hợp được với hydrazin tạo phthalazinon dạng racemic có tính kháng viêm Từ hỗn hợp racemic của acid carboxylic trên tiến hành tách đồng phân quang hoạt nhờ (R)(+) và (S)()methylbenzylamin, từ đó đóng vòng tạo phthalazinon có tính quang hoạt Thế ankyl vào gốc N của phthalazinon dùng xúc tác natri hydrid tạo dẫn chất Nsubstituted của cishexahydrophthalazinon Tiến hành một số phương pháp xác định độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được Rút ra kết luận về quá trình tổng hợp và kết quả thu được Đưa ra một số đề nghị liên quan đến phạm vi đề tài nghiên cứu
Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới hen suyễn bệnh mãn tính phổ biến thuốc chống hen suyễn ngày sử dụng rộng rãi Thật vậy, nước cơng nghiệp chi phí cho điều trị hen suyễn chiếm 1-2% chi phí y tế, mơi trường sống bị nhiễm, đời sống bị căng thẳng, ngày có nhiều tiếp xúc với vật dụng, thuốc men hóa chất Mặc dù có nhiều tiến trị liệu ảnh hưởng hen suyễn, chết hen suyễn số bệnh nhân nhập viện hen suyễn không ngừng tăng thập niên vừa qua [19] Theo số liệu thống kê, Việt Nam, số người mắc bệnh chiếm khoảng 4-5% dân số Trong tương lai nhà khoa học cảnh báo đến năm 2025, giới có thêm 100 triệu người mắc bệnh hen suyễn, chủ yếu gia tăng thành phố lớn Cũng hen suyễn, bệnh viêm khớp dạng thấp trở thành mối đe dọa lớn Viêm khớp dạng thấp gặp quốc gia, chủng tộc, lứa tuổi giới Tỷ lệ mắc bệnh chung 1-3% dân số 15 tuổi, bệnh thường gặp nữ (75%) thường gặp độ tuổi từ 30 - 60 Viêm khớp dạng thấp bệnh khớp mạn tính, thường kéo dài nhiều năm đeo đẳng người bệnh suốt đời, bệnh lý tự miễn với biểu khớp, khớp, toàn thân nhiều mức độ khác nhau, diễn biến phức tạp, gây hậu nặng nề Bệnh trực tiếp làm chết người làm giảm chất lượng sống, gắn liền với đau đớn, sức, tật nguyền… nên cần phải điều trị tích cực từ đầu Ngồi hen suyễn, viêm khớp dạng thấp có nhiều dạng viêm khác gây ảnh hưởng tiêu cực cho người bệnh Do đó, việc tìm phát triển hoạt chất có tác dụng điều trị bệnh viêm nhu cầu cấp bách, cần thiết quan trọng Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Trong nhiều cơng trình nghiên cứu, nhà khoa học phát vai trò tích cực cAMP tế bào viêm Trong hầu hết tế bào viêm, việc nâng cao mức độ AMP vòng (cAMP) có vai trò ức chế đáp ứng tế bào (ức chế phóng thích chất trung gian) làm giảm nhẹ triệu chứng viêm Và phương pháp hiệu làm tăng mức AMP vòng ức chế hoạt động trung gian enzym phosphodiesterase (PDE) Vì thế, nhiều cơng trình nghiên cứu định hướng đến việc tìm phát triển hợp chất có khả ức chế hiệu chọn lọc PDE giúp cho việc điều trị bệnh viêm cấp tính mãn tính, điển hình bệnh viêm khớp dạng thấp bệnh hen suyễn Gần đây, nhà khoa học phát dẫn chất phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc hiệu phosphodiesterase (PDE), đặc biệt PDE4 Nhiều cơng trình nghiên cứu ngồi nước thực q trình tổng hợp phthalazinon có hoạt tính, khoa Dược trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh có đề tài tổng hợp thành cơng dẫn xuất cis-tetra cis-hexa hydro phthalazinon Tiếp nối đề tài năm trước, chúng tơi thực khóa luận: “Tổng hợp hợp chất quang hoạt cis(+) cis(-)-4-(3,4dimethoxyphenyl)hexahydrophthalazinon có hoạt tính ức chế chọn lọc phosphodiesterase ” Từ mục tiêu đặt mục tiêu cụ thể sau: Tổng hợp acid cis-2-(3,4-dimethoxybenzoyl)cyclohexan cyclohexen carboxylic dạng racemic từ anhydrid cis-1,2-cyclohexan cyclohexen dicarboxylic dẫn chất benzen 1,2-dimethoxybenzen Đóng vòng acid carboxylic vừa tổng hợp với hydrazin tạo phthalazinon dạng racemic có tính kháng viêm Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Từ hỗn hợp racemic acid carboxylic tiến hành tách đồng phân quang hoạt nhờ (R)-(+) (S)-(-)-α-methylbenzylamin, từ đóng vòng tạo phthalazinon có tính quang hoạt Thế ankyl vào gốc N- phthalazinon dùng xúc tác natri hydrid tạo dẫn chất N-substituted cis-hexahydrophthalazinon Tiến hành số phương pháp xác định độ tinh khiết xác định cấu trúc dẫn chất tổng hợp Rút kết luận trình tổng hợp kết thu Đưa số đề nghị liên quan đến phạm vi đề tài nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ VIÊM VÀ BỆNH LIÊN QUAN 2.1.1 Khái niệm viêm [9], [27], [28] Viêm phản ứng bảo vệ nhằm đưa thể trở lại tình trạng trước bị tổn thương để trì định nội môi Tuy nhiên giống miễn dịch, đáp ứng viêm khơng phù hợp có gia tăng mức, viêm trở thành có hại cho túc chủ, gây đau đớn, tổn thương mô lành, rối loạn chức năng… phản ứng viêm cần kiểm soát giới hạn cho phép Phản ứng viêm phản ứng phức tạp thể, gồm biểu lâm sàng như: sưng, nóng, đỏ, đau kèm theo rối loạn chức quan bị viêm Các nguyên nhân gây viêm : • Ngun nhân từ bên ngồi: vi khuẩn tác nhân gây viêm thường thấy nhất, ngồi có yếu tố gây viêm khác : vật lý, hóa học, học, sinh học Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề • Nguyên nhân từ bên trong: hoại tử tổ chức nghẽn mạch, xuất huyết, viêm tắc động mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng, miễn dịch (bệnh tự miễn) 2.1.2 Hen suyễn [4], [29] Hen suyễn hay gọi hen phế quản bệnh lý viêm mạn tính với tình trạng tắc nghẽn đường thở có hồi phục Bệnh đặc trưng đợt khò khè tái diễn, thường kèm theo ho, đáp ứng với thuốc giãn phế quản thuốc kháng viêm (WHO) Hen suyễn (Asthma) tình trạng khí quản phế quản tăng đáp ứng với loại kích thích khác dẫn đến co thắt khí quản sưng viêm đường dẫn khí có hồi phục với mức độ không giống Cả hai loại, hen suyễn cấp tính hay mãn tính hậu việc tăng chất trung gian gây viêm khác như: histamin, LT, thromboxan, prostaglandin D2, PAF (yếu tố hoạt hóa tiểu cầu),… gây co thắt gây hóa hướng động dẫn đến tăng đáp ứng làm sưng viêm khí quản Vì vậy, việc ngăn cản hoạt động chất hoạt tính quan trọng hợp chất dùng để điều trị hiệu bệnh hen suyễn Các nhóm thuốc thường dùng: β-adrenergic, corticoid, xanthin, anti-cholinergic (Ipratropium), nhóm bảo vệ tế bào (Cromolyn), nhóm kháng leucotrien (Zafirlukast, Montelukast) 2.1.3 Viêm khớp dạng thấp [3], [28] Viêm khớp dạng thấp (Rheumetoid arthritis) rối loạn viêm mạn tính, thường viêm tiến triển chưa rõ nguyên nhân với đặc điểm viêm đa khớp đối xứng có triệu chứng tồn thân Đây bệnh tương đối nguy hiểm, ban đầu viêm khớp, sau ảnh hưởng đến tim, gây biến chứng nguy hiểm tim mạch Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Bệnh viêm khớp dạng thấp chưa có cách chữa khỏi hay phòng ngừa Chẩn đốn điều trị sớm làm chậm tiến triển bệnh Những thuốc sử dụng: NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatory drugs), DMARDs (Disease-modifying antirheumatic drug: Thuốc chống thấp khớp thay đổi bệnh methotrexat, cyclosporin, penicillamin, muối vàng,…) 2.2 VAI TRÒ CỦA ENZYM PHOSPHODIESTERASE 2.2.1 Sơ lược enzym phosphodiesterase [19], [20], [23] Nucleotid vòng phosphodiesterase (PDE) enzym chi phối trình thủy phân chất truyền tin thứ hai cGMP cAMP tế bào, biểu thị ức chế hay cảm ứng đặc trưng (co hay giãn cơ) Hệ thống đồng phân enzym PDE phân loại dựa tương quan đặc hiệu với chất (cAMP, cGMP), đặc tính động học (Km Vmax), phân phối tế bào đặc tính điều hòa ức chế hay hoạt hóa đặc hiệu Ngày nhiều nghiên cứu tập trung vào ức chế chọn lọc enzym PDE4 enzym PDE4 enzym bật có tế bào viêm Trong đa số tế bào viêm tế bào miễn dịch, ức chế đáp ứng tế bào có liên quan đến việc tăng mức độ cAMP Sự ức chế PDE, đặc biệt PDE4, làm tăng mức độ cAMP, làm tế bào Mast giảm tiết chất trung gian gây viêm: histamin, cytokin, hydrogen peroxid,… giúp giãn trơn Vì vậy, bệnh viêm cấp mãn tính bệnh hen suyễn viêm khớp dạng thấp điều trị hữu hiệu cách ức chế hiệu chọn lọc PDE4 2.2.2 Cơ chế hoạt động enzym phosphodiesterase [2] Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Giãn phế quản Giãn mạch Ức chế phóng thích chất trung gian cAMP ATP Adenyl cyclase 5’- AMP Phosphodiesterase ức chế Phthalazinon Các nghiên cứu cho thấy phế quản người có chứa lượng lớn enzym PDE3 PDE4, ức chế hệ thống enzym PDE có ý nghĩa việc làm giãn phế quản Thật kết hợp ức chế PDE4 PDE3 tạo tác dụng dãn phế quản mạnh ức chế chọn lọc enzym riêng lẻ [19] [22] Trong sơ đồ trên: PDE ức chế chuyển cAMP thành 5’-AMP làm lượng cAMP tăng lên Lượng cAMP tăng làm tế bào Mast giảm tiết chất trung gian hóa học gây viêm, làm giảm trình viêm, giúp giãn từ kiểm sốt tốt bệnh hen suyễn 2.3 SƠ LƯỢC VỀ NGUYÊN LIỆU SỬ DỤNG: [17] 2.3.1 Anhydrid cis-1,2-cyclohexan dicarboxylic CTPT: C8H10O3 KLPT: 154 CTCT: H O O H O TC: Tinh thể trắng, hình khối, dễ hút ẩm nhiệt độ thường, cứng nhiệt độ lạnh 2.3.2 1,2-dimethoxybenzen [18] CTPT: C8H10O2 KLPT: 138 Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề CTCT: OCH3 OCH3 TC: Là dẫn chất benzen, dạng lỏng dạng tinh thể, mùi khó chịu Tan nhẹ nước, cồn, ether, dầu béo D = 1.084, mp = 22-23 0C, bp = 206-207 0C 2.3.3 Hydrazin monohydrat [13] CTPT: N2H6O KLPT: 50 CTCT: H2N-NH2.H2O TC: Là chất lỏng, không màu, mùi nhẹ Có tính base tính ăn mòn mạnh, hỗn hòa với nước alcol, khơng tan chloroform ether Là chất khử mạnh, độc, gây kích ứng mắt chậm 2.3.4 (R)-(+) (S)-(-)-α-methylbenzylamin [14] CTPT: C8H11N CTCT: KLPT: 121 C6 H H2N C6H5 CH3 H3C H NH2 H (R)-(+)-α-methylbenzylamin (S)-(-)-α-methylbenzylamin TC: Chất lỏng mùi khai, bảo quản tránh ánh sáng 2.3.5 Nhôm clorid CTPT: AlCl3 KLPT: 133.5 TC: Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Nhơm clorid acid Lewis [14], dạng bột mịn, màu vàng nhạt, bốc khói thao tác, dễ hút ẩm điều kiện thường tạo khối chất màu nâu đen, khơng tơi xốp, khơng khả xúc tác Phản ứng với nước mãnh liệt, bốc khói tỏa nhiệt Sau xúc tác thường tạo phức AlCl 4- cần hỗn hợp nước-đá để phá vỡ liên kết tạo Al(OH)3, sau dùng HCl để biến Al(OH) thành AlCl3 tan nước 2.3.4 Natri hydrid - NaH [17] Tinh thể trắng, dễ hút ẩm tạo thành natri hydroxid Phản ứng với nước sinh lượng nhiệt lớn Yêu cầu: Đeo bao tay thao tác Cách khống chế tác hại ẩm: Phân tán natri hydrid 55-60% dầu khoáng trắng để tránh ẩm sau loại dầu trước phản ứng Trong phản ứng dùng dung mơi hữu hòa tan dầu (eter dầu hỏa, benzen, toluen, …) có mặt dầu khống khơng ảnh hưởng đến khả xúc tác natri hydrid 2.4 GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT PHTHALAZINON 2.4.1.Hợp chất phthalazinon [15] 4a N 8a N O H Cấu trúc: Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Đây hợp chất vòng ngưng tụ pyridazinone benzen, tạo từ phản ứng ngưng tụ đóng vòng nội phân tử γ–ceto acid tương ứng với hydrazin monohydrat 2.4.2 Mối quan hệ cấu trúc tác dụng dược lý [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] Nhiều cơng trình nghiên cứu tổng hợp dẫn chất phthalazinon tìm thấy tác dụng ức chế chọn lọc chất PDE4 R1 X R2 R3 N N O R Hình 1.2: Cis–hexahydro-2H-phthalazinon Những hợp chất có hoạt tính kháng viêm cao thường có cấu trúc sau: X: vòng cyclohexan cyclohexene tạo hợp chất có khả kháng viêm cao nhiều so với X nhân thơm C-H: nhóm R1, R2, R3 thường 3,4-dialkoxyphenyl N-H: nhóm R tốt nhóm benzyl, cycloheptyl Bảng 2.1 Dẫn xuất 4-aryl rac cis– 4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2Hphthalazinon hoạt tính ức chế PDE4.[19] R1 R2 R3 N N O H Hợp chất R1 R2 R3 PDE4 pIC50 H H H < 5.0 OMe H H 5.9 OMe OMe H 8.1 OEt H 7.8 OcC5H9 H 8.0 Trang - DượcOEt Nguyễn Thị Ngọc 2003 OMe Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Bảng 2.2 Các dẫn xuất 4-aryl rac cis– 4a,5,8,8a-tetrahydro-2Hphthalazinon hoạt tính ức chế PDE4.[19] R1 R2 R3 N N O H Hợp chất R1 R2 R3 PDE4 pIC50 OMe OCH2cPr H 9.0 OMe OMe H 9.1 OMe OH H 7.4 OMe OcC5H9 H 8.9 Nhóm 4-(3,4–dialkoxyphenyl) giữ vai trò thiết yếu hiệu lực ức chế PDE4, xem có vai trò định việc kết nối nguyên tử oxy ether catechol với enzym Ngồi thay vị trí vòng phenyl (R 2) hạn chế nhóm thân dầu nhỏ (tốt nhóm methoxy), thay vị trí lại bị hạn chế Bảng 2.3 Sự ức chế PDE hoạt tính kháng viêm in vivo dẫn xuất hexahydro-2H-phthalazinon R1 R2 R3 Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 N N R O 10 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Phương pháp có tính chất lịch sử, sử dụng thực tế Phương pháp đặt mầm: Thêm đối quang tinh khiết vào dung dịch racemic bão hòa để dung dịch trạng thái bão hòa đối quang thêm vào Sau dạng đối quang kết tinh tách Phương pháp tạo đồng phân dia: Đây phương pháp quan trọng để tách đồng phân đối quang từ hỗn hợp racemic D1D2 D1L1 + D2 L1D2 Trong đó: D1L1: biến thể racemic D2: tác nhân bất đối xứng D1D2, L1D2: Đôi đồng phân lập thể không đối quang Khi dùng tác nhân bất đối xứng D tác động lên biến thể racemic, ta thu hai chất D1D2, L1D2, đôi đồng phân lập thể không đối quang cần tách Hai chất khác áp suất hơi, khác tính tan, độ phân cực … Sự khác đủ để tách riêng hai đồng phân 2.8.2 Tác nhân bất đối xứng dung môi 2.8.2.1 Tác nhân bất đối xứng Việc lựa chọn tác nhân bất đối xứng phù hợp quan trọng, ảnh hưởng lớn đến khả tách đồng phân đối quang Yêu cầu: Khi hóa hợp hỗn hợp racemic chất đối quang đồng phân dia phải dễ tạo thành dễ dàng phân tách thành đối quang Chất đối quang lựa Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 16 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề chọn phải tinh khiết, dễ kiếm rẻ tiền dễ điều chế, dễ thu hồi sau hoàn thành phân đôi Các đồng phân dia thường muối acid base Sau thu đồng phân dia tiến hành acid hóa base hóa để thu chất cần tách 2.8.2.2 Dung môi Khi chọn tác nhân bất đối xứng, cần ý đến ảnh hưởng dung môi dùng tách riêng đồng phân lập thể không đối quang Ví dụ: Khi tách α-phenylethylamin racemic, tác nhân đối quang acid tartric, với dung mơi nước tách riêng khơng thành cơng dùng cồn methanol tách riêng dễ dàng 2.8.2.3 Các phương pháp tách đồng phân thường áp dụng Từ nghiên cứu công bố [22] cho thấy, dẫn xuất rac-cis(± )phthalazinon thể hoạt tính ức chế PDE4 mạnh dẫn chất rac-trans tương ứng Do việc tách riêng đồng phân quang học có ý nghĩa quan trọng cần thiết để tăng tác dụng kháng viêm phthalazinon Trên thực tế thường áp dụng hai cách sau: Qui trình 1: [19], [22] Chất đối quang sử dụng base tinh khiết mặt quang học (R)-(+) (S)-(-)-α-methylbenzylamin Khi cho chất có tính base vào hỗn hợp acid racemic, chúng tạo thành muối có tính chất khác tách thành phần riêng rẽ Từ muối tiến hành acid hóa trở lại tạo acid có tính quang hoạt khác Đem acid đóng vòng với hydrazin tạo phthalazinon tinh khiết mặt quang học, có tác dụng dược lý cao Qui trình 2: [25] Dùng chất (Y): (4S)-isopropyl-1,3-thiazolidin-2-thione [(4S)-IPTT] Khi [Y] tác động vào hỗn hợp racemic tạo amid tinh khiết mặt quang học Sau Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 17 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề amid ngưng tụ đóng vòng với hydrazin tạo phthalazinon có tính chọn lọc mặt quang học, có khả kháng viêm cao So sánh qui trình qui trình 2: [26] Đặc điểm Qui trình Qui trình Cơ chế phản ứng Tạo đồng phân dia dạng muối Tạo đồng phân dia dạng amid Khả thực Dễ tạo đôi đồng phân lập thể không đối quang Dễ tạo đôi đồng phân lập thể không đối quang Chất đối quang (R)-(+) (S)-(-)-αmethylbenzylamin (Y ): [(4S)-IPTT] Rẻ tiền, tinh khiết, dễ kiếm Đắt tiền, khó điều chế Độ tinh khiết quang học cao, dễ tiến hành Độ tinh khiết quang học cao (99% de), khó thực Hiệu suất phản ứng tách đồng phân Từ so sánh định chọn tách đồng phân quang hoạt theo qui trình 1: Tạo đồng phân dia dùng (R)-(+) (S)-(-)-α-methylbenzylamin Phương pháp tách đồng phân cách tạo đồng phân dia gồm bước sau: - Hóa hợp dạng racemic với đối quang để tạo thành đồng phân dia - Dùng phương pháp kết tinh phân đoạn tách riêng hai đồng phân dia - Tái sinh riêng biệt dạng đối quang có hỗn hợp racemic cách acid hóa trở lại muối thu - Tinh chế cô lập đối quang khỏi hỗn hợp Cách xác định độ tinh khiết: Phần trăm tinh khiết = Trong đó: A x 100 X A: [α] đo X: [α] max Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 18 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Mối quan hệ độ quay cực nồng độ quan hệ tuyến tính Vì xem độ tinh khiết quang học phần trăm diện đối quang so với đối quang Độ tinh khiết quang học = [ R] − [ S ] x100 = %R - %S [ R] + [ S ] Độ tinh khiết xác định theo phương pháp đo NMR, HPLC số phương pháp khác 2.9 PHẢN ỨNG N-ALKYL HÓA [15], [26] R1 R1 R2 + N N NaH (CH3ONa) R-X R2 DMF O N H O N R Phản ứng N-alkyl hóa dùng hai xúc tác sau: alkoxid, natri hydrid 2.9.1 Xúc tác alkoxid [15] Alkoxid tạo cách cho lượng alcol (methanol ethanol) tác dụng với lượng natri kim loại vừa đủ (natri phải tan hoàn toàn), phản ứng tỏa nhiệt mạnh R-ONa + H2 ROH + Na R- thường CH3- C2H5- R1 CH3 H3 C C (tert butyl-) CH3 R1 H H CH3O - Na+ R2 H Sau alkoxid tạo thành xúc tác phản ứng alkyl R2 hóa theo chế sau: H N N N O N H O Na R1 R1 H DMF H R-X Nguyễn ThịRNgọc Trang - Dược 2003 H N N Na R2 H N O N R O 19 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề 2.9.2 Xúc tác natri hydrid (NaH): [26] NaH xúc tác phản ứng với chế tương tự: R1 R1 H H NaH R2 H R2 N N H N O N H O Na R1 R1 H DMF H R-X R2 H N N R2 H N O Na N O R Các R-X thường dùng benzyl, cycloheptyl, adamantanyl halogenid halogenid thường dùng bromid Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 20 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 TỔNG HỢP 3.1.1 Tổng hợp acid cyclohexan carboxylic dạng racemic Mục đích: Để tiếp tục đóng vòng tạo phthalazinon dạng racemic Tách đồng phân quang hoạt từ hỗn hợp acid carboxylic dạng racemic, sau đóng vòng tạo phthalazinon mang tính quang hoạt có tác dụng dược lý tốt Loại phản ứng: Phản ứng acyl hóa Friedel-Crafts, xúc tác nhơm chlorid AlCl 3, dung môi dichloromethan Nhiệt độ: 55-65 0C, đun cách thủy, hồi lưu sinh hàn nước Yêu cầu: Phản ứng thực môi trường khan nước Phương trình phản ứng (1): [30] O O R1 AlCl3 R2 CH2Cl2 + O R1 R2 O COOH Cách tiến hành: Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 21 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Cân nhơm clorid vào bình cầu, cho dichloromethan làm lạnh vào bình cầu Tiếp theo cho từ từ dẫn chất benzene vào, cuối anhydrid carboxylic Đun hồi lưu đến phản ứng hoàn toàn Cho hỗn hợp sau phản ứng vào hỗn hợp nước-đá Acid hóa HCl 10%, khuấy kĩ, sau chiết dichloromethan lấy phần dung môi hữu Rửa dịch chiết HCl 10%, nước, NaCl bão hòa Cơ quay dịch chiết tới cắn, hòa lượng vừa đủ dichloromethan lọc qua phễu thủy tinh xốp lấy dịch lọc Cô quay dịch lọc loại dung môi Tinh chế kết tinh phân đoạn diethylether/n-hexan và/hoặc sắc ký cột Theo dõi mức độ phản ứng SKLM Áp dụng: R1=R2= -OCH3 - dẫn chất 1,2-dimethoxybenzen Anhydrid cyclohexan dicarboxylic, anhydrid cyclohexen dicarboxylic 3.1.2 Đóng vòng tạo phthalazinon dạng racemic Loại phản ứng: Phản ứng đóng vòng với hydrazin monohydrat, dung môi ethanol tuyệt đối Nhiệt độ cao, đun trực tiếp đế nhôm, đun hồi lưu sinh hàn nước Yêu cầu: Cung cấp đủ nhiệt độ Phương trình phản ứng (2): [12], [13] R1 R1 EtOH + R2 O H2N-NH2 R2 Hồi lưu N COOH N O H Cách tiến hành: Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 22 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Cho acid carboxylic hydrazin vào bình cầu chứa sẵn EtOH tuyệt đối Tiến hành đun hồi lưu nhiệt độ cao đến phản ứng kết thúc Sau đun hồi lưu cho hỗn hợp thu vào lượng vừa đủ nước-đá Đem lọc lấy tủa, để riêng Phần dịch lọc đem cô quay tới cắn, hòa cắn ethylacetat Rửa dịch chiết nước cất, sau chiết tiếp NaHCO3 10%, HCl 5%, làm khan MgSO4 Cô quay dịch chiết loại dung môi, cắn thu tiếp tục kết tinh phân đoạn cồn nóng thu tủa thứ Gộp chung tủa cân tính hiệu suất Áp dụng: R1=R2= -OCH3 - dẫn chất 1,2-dimethoxybenzen Acid cis-2-(3,4-dimethoxybenzoyl)cyclohexan/cyclohexen carboxylic 3.1.3 Tách đồng phân quang hoạt với (R)-(+) (S)-(-) Sơ đồ tổng quát - phản ứng (3,4): [22] R1 R2 O R(+) COOH S(-) R1 R1 R2 O R2 -+ COONH3 H3C CH -+ COONH3 O H3C C6 H HCl CH C6 H HCl R1 R1 R2 R2 O O COOH H2N-NH2 R1 COOH H2N-NH2 R1 R2 R2 N N 2003 O Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược H N N H O 23 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Cách tiến hành: Cho acid carboxylic (2), ethanol tuyệt đối, R(+) vào bình cầu Khuấy hỗn hợp 15 phút Để yên 16 giờ, lọc thu tủa (1) dung dịch (1) Rửa tủa (1) lần ethanol tuyệt đối Cô dung dịch (1) đến nửa thể tích, tiếp tục khuấy giờ, sau làm lạnh hỗn hợp xuất tủa Lọc thu tủa (2) dung dịch (2) Tiến hành kết tinh phân đoạn tủa (2) cồn nóng lần Gộp tủa (1) tủa (2) sau acid hóa chuyển tủa từ dạng muối trở dạng acid Dung dịch (2) đem cô quay tới bay hết dung mơi, sau tiến hành acid hóa tủa thật kĩ HCl 5% Thu tủa, acid có tính quang hoạt Với S(-)-α-methylbenzylamin tiến hành tương tự Áp dụng: R1=R2= -OCH3 - acid cis-2-(3,4-dimethoxybenzoyl)cyclohexancarboxylic 3.1.4 Đóng vòng tạo phthalazinon có tính quang hoạt [12], [13] Tiến hành tương tự phần 3.1.2 Đóng vòng tạo phthalazinon dạng racemic Tuy nhiên sau cho hỗn hợp đun hồi lưu vào nước-đá khơng tạo thành tủa lọc mà tạo thành tủa mịn lọc được, khác phthalazinon dạng racemic phthalazinon có tính quang hoạt Đem hỗn hợp cô quay loại cồn, nước tạo chất nhầy màu trắng đục Làm tủa chất nhầy n-hexan có đun nóng Do khơng thể tinh chế KTPĐ nên phải tinh chế chất SK cột Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 24 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Thu tủa tinh khiết sau tinh chế, cân tính hiệu suất 3.1.5 Phản ứng N-alkyl hóa [15] Mục đích: Từ phthalazinon tinh khiết mặt quang học tiến hành phản ứng alkyl hóa tạo dẫn chất có hoạt tính kháng viêm cao Loại phản ứng: Phản ứng alkyl hóa, xúc tác natri hydride NaH, dung môi DMF Yêu cầu: Kiểm soát phản ứng SKLM phản ứng xảy hồn tồn Phương trình phản ứng (5): R1 R1 R2 + N N O R-X NaH (CH3ONa) DMF H R2 N N O R Cách tiến hành: Nếu xúc tác alkoxid: Hòa tan phthalazinon nguyên liệu dung môi hữu (DMF) với lượng nhỏ, sau cho hỗn hợp xúc tác alkoxid vào, khuấy nhiệt độ phòng khoảng Thêm dẫn xuất alkyl halogenid vào, khuấy tiếp nhiệt độ phòng tối thiểu Sau kết thúc phản ứng, sản phẩm cho vào nước chiết ethylacetat, sau rửa dịch chiết nước, nước muối, làm khan MgSO4 Loại dung môi, thu sản phẩm Nếu xúc tác NaH: Hòa tan phthalazinon dung mơi hữu DMF, sau cho NaH vào Khuấy nhiệt độ phòng Sau cho alkyl bromid vào, khuấy thời gian khoảng nhiệt độ phòng Sản phẩm sau phản ứng hòa vào nước cất, chiết acetat ethyl Dịch chiết rửa nước, nước muối, làm khan MgSO Loại dung môi, thu sản phẩm Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 25 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Từ kết khóa luận thực hiện: dùng xúc tác alkoxid hiệu suất phản ứng không cao dù thay đổi điều kiện phản ứng, xúc tác NaH lại tỏ hiệu quả, phản ứng thu hiệu xuất cao Do đó, chúng tơi chọn NaH để xúc tác cho phản ứng alkyl hóa phthalazinon tổng hợp Áp dụng: R1= R2 = -OCH3 R-X = Ar-Br - Benzyl bromid 3.2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 3.2.1 Kiểm định độ tinh khiết [13], [14] Muốn xác định xác cấu trúc hóa học chất, yêu cầu mẫu phải tinh khiết > 95% Để xác định độ tinh khiết sử dụng nhiều phương pháp: SKLM, đo điểm chảy, GC-MS, HPLC, đo góc quay cực α… 3.2.1.1 SKLM SKLM phương tiện đơn giản để theo dõi mức độ phản ứng độ tinh khiết sản phẩm Cách tiến hành: Chuẩn bị dịch chấm SK: Hòa tan lượng nhỏ mẫu dichloromethan Dùng mỏng silica gel 60 F254 tráng sẵn Merk, kích thước 2x10 cm Áp dụng: Sắc ký nhiệt độ phòng, phát vết đèn UV, bước sóng 254 nm Trên SKLM chấm vết: Vết 1: Nguyên liệu, vết 2: chấm trùng vết nguyên liệu sản phẩm, vết 3: vết sản phẩm sau phản ứng Nếu Rf sản phẩm thu sau phản ứng khác Rf nguyên liệu ban đầu, suy có chất tạo thành sơ kết luận phản ứng xảy Nếu vết chấm thứ 3- sản phẩm thu sau phản ứng có vết chứng tỏ phản ứng xảy hoàn toàn, sản phẩm xem tinh khiết SKLM- tiếp tục kiểm tra tiêu khác Khi tiến hành SKLM sử dụng hệ dung môi khác để kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm: Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 26 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Hệ 1: n-hexan : ethylacetat = (1:3) Hệ 2: benzen : ethylacetat = (1:1) Hệ 3: n-hexan : aceton (7:5) = Ưu điểm: Lượng mẫu nhỏ, dụng cụ đơn giản, dễ thực hiện, nhanh có kết Khả tách tốt, nhạy đáp ứng yêu cầu đặt phương pháp Hạn chế phương pháp: Tinh khiết SKLM chưa đủ để kết luận sản phẩm tinh khiết, cần thực thêm phương pháp khác 3.2.1.2 Đo nhiệt độ nóng chảy (mp) - Đối với chất tinh khiết: Nhiệt độ nóng chảy xác định thay đổi khơng q 0.5 0C từ lúc bắt đầu nóng chảy đến chảy hồn tồn - Đối với chất khơng tinh khiết: Nhiệt độ nóng chảy chất khơng tinh khiết thấp khoảng nhiệt độ nóng chảy rộng so với chất tinh khiết Do đó, đo nhiệt độ nóng chảy phương pháp để xác định độ tinh khiết sản phẩm So sánh kết với nhiệt độ nóng chảy chất tương ứng tài liệu công bố Đo máy Gallenkamp Bộ mơn Hóa Hữu Cơ - Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, dựa nguyên tắc đốt nóng mẫu đĩa nung Ưu điểm: Lượng mẫu nhỏ, dụng cụ đơn giản Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 27 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Nhược điểm: Độ xác khơng cao nung mẫu đĩa nung tránh khỏi sai số Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết kĩ thuật đo 3.2.1.3 Đo góc quay cực [α]D [13], [14] Tương tự phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, tạp chất làm thay đổi góc quay cực [α]D Góc quay cực chất góc mặt phẳng phân cực bị quay ánh sáng phân cực qua dung dịch chất Góc quay cực riêng [α]D chất rắn góc quay cực đo chùm ánh sáng D truyền qua lớp dung dịch có bề dày dm có nồng độ 1g/l 20 0C Để xác định góc quay cực ta dùng phân cực kế với nguồn sáng đèn natri (D), thủy ngân; phân cực kế quang điện cho phép đo lường bước sóng riêng biệt Cơng thức tính góc quay cực: Đối với chất lỏng: [α]D= Đối với chất rắn: [α]D= α lxd α lxC x 100 Trong đó: α: Góc quay cực l: Chiều dài cốc đo phân cực kế (dm) d: tỷ trọng chất lỏng C: nồng độ phần trăm chất thử dung dịch 3.2.2 Xác định cấu trúc Xác định cấu trúc sản phẩm thu dựa vào phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (GC-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 3.2.2.1 Quang phổ hồng ngoại (IR): [1] Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 28 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Phổ hồng ngoại phổ dao động quay phân tử hay nhóm chức có phân tử, cho biết thơng tin dao động nhóm chức có phân tử, nên phổ hồng ngoại phương pháp góp phần vào việc xác định diện nhóm chức có phân tử, từ góp phần vào việc xây dựng cấu trúc hợp chất Đo máy FTIR 8201 Shimadzu khoa Dược – trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 3.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H NMR): [10] Việc đo phổ NMR cho phép xác định cấu trúc chất: thông tin công thức khai triển cấu trúc lập thể phân tử Do NMR ứng dụng nhiều thực tế Hiện tượng cộng hưởng từ xảy hấp thu lượng có chọn lọc hạt nhân có moment từ đặt từ trường kích thích sóng điện từ Có loại phổ NMR : 1H NMR 13C NMR, phổ cộng hưởng từ proton 1H NMR sử dụng phổ biến Mỗi hợp chất có phổ proton 1H NMR đặc trưng thông số sau: Độ dịch chuyển hóa học pic Số lượng pic Hình dạng pic số ghép J Cường độ pic (độ lớn tích phân pic) Với thơng số đặc trưng ta xác định : Số lượng proton phân tử Môi trường hóa học mà proton tồn (nhóm chức) Cấu trúc hay mối quan hệ đồng phân Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 29 Khóa luận tốt nghiệp Đặt vấn đề Sự có mặt chất lạ Phổ đo máy ASIA BRUKER 500 MHz Viện Hóa Học Việt Nam Các chất thử nghiệm đo dung môi đề nghị CDCl3 Nguyễn Thị Ngọc Trang - Dược 2003 30 ... Minh có đề tài tổng hợp thành công dẫn xuất cis-tetra cis-hexa hydro phthalazinon Tiếp nối đề tài năm trước, thực khóa luận: Tổng hợp hợp chất quang hoạt cis(+ ) cis(- )- 4- (3, 4dimethoxyphenyl)hexahydrophthalazinon. .. cis -4- (3 ,4- diethoxyphenyl); rac cis -4( 4-methoxyphenyl) rac cis -4- phenyl hexahydro-2H-phthalazinon dẫn chất Nalkyl có hoạt tính ức chế PDE4 cao 2 .4. 3 Mối quan hệ tính quang hoạt tác dụng dược lý [22] Tính quang hoạt. .. nghiên cứu hợp chất Bảng 2 .4: Khả ức chế PDE4 hợp chất racemic dẫn chất 4- arylhexa tetrahydrophthalazinon [22] MeO X Y R2 R3 N N O H ( +)/ ( -) R2 R3 X-Y PDE4 pIC50 (± ) OMe H H2C-CH2 6 .4 ( +) OMe H