Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa TEV protease và thu nhận TEV protease tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA TEV PROTEASE VÀ THU NHẬN TEV PROTEASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA TEV PROTEASE VÀ THU NHẬN TEV PROTEASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ : 60 73 25 Người hướng dẫn khoa học: TS Đồng Văn Quyền TS Phùng Thanh Hương HÀ NỘI 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời biết ơn chân thành, lòng kính trọng tới TS Đồng Văn Quyền TS Phùng Thanh Hương – người Thầy, người Cơ trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành luận văn Em xin cảm ơn cô chú, anh chị cơng tác phòng Vi sinh học phân tử - Viện công nghệ sinh học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người ln tận tình giải đáp thắc mắc cơng việc hết lòng giúp đỡ em trình thực luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy giúp đỡ em suốt trình học tập trường Và cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn người thân, bạn bè, người sát cánh em, chia sẻ, động viên em giúp em hồn thành khóa học luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2012 Học viên Đỗ Thị Huế MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung protease 1.1.1 Khái niệm protease 1.1.2 Phân loại protease 1.2 Đại cương TEVp 1.2.1 Giới thiệu chung Tobacco etch virus 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc 1.2.4 Đặc điểm hoạt động xúc tác 1.2.5 Cơ chất đặc hiệu 1.2.6 Ứng dụng TEVp 10 1.3 Nghiên cứu TEVp tái tổ hợp 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Nguồn gen 16 2.1.2 Hoá chất sinh phẩm 16 2.1.3 Trang thiết bị máy móc 16 2.1.4 Môi trường dung dịch 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Khuếch đại gen mã hoá enzym TEVp phương pháp PCR 20 2.2.2 Phương pháp giải trình tự ADN 21 2.2.3 Phương pháp so sánh trình tự ADN 23 2.2.4 Phương pháp tích hợp gen mã hóa TEVp vào vector pCR2.1 23 2.2.5 Phương pháp tích hợp gen mã hóa TEVp vào vector biểu pET21 a(+)24 2.2.6 Phương pháp cắt enzym giới hạn 24 2.2.7 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E coli 26 2.2.8 Phương pháp lựa chọn E coli mang plasmid pCR2.1 tích hợp gen mã hóa TEVp 27 2.2.9 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 28 2.2.10 Phương pháp biểu protein tái tổ hợp E coli 29 2.2.11 Phương pháp điện di ADN gel agarose 29 2.2.12 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamid 30 2.2.13 Phương pháp xác định trạng thái tồn TEVp tái tổ hợp ảnh hưởng nhiệt độ lên mức độ biểu gen mã hóa TEVp 31 2.2.14 Phương pháp xác định ảnh hưởng nồng độ IPTG lên mức độ biểu gen mã hóa TEVp 32 2.2.15 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy E coli lên mức độ biểu gen mã hóa TEVp 32 2.2.16 Phương pháp tinh protein tái tổ hợp cột Probond nickelchelating resin 33 2.2.17 Định lượng protein phương pháp Bradford 34 2.2.18 Phương pháp thử hoạt tính TEVp 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 36 3.1 Kết biểu gen mã hóa TEVp 36 3.1.1.Khuếch đại gen mã hóa TEVp 36 3.1.2 Tách dòng gen mã hóa TEVp 37 3.1.3 Xác định trình tự ADN 38 3.1.4 Thiết kế vector biểu pET 21a(+) mang gen TEVp 40 3.1.5 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố lên q trình biểu gen mã hóa TEVp 41 3.2 Kết tinh TEVp tái tổ hợp 45 3.3 Kiểm tra hàm lượng hoạt tính TEVp tái tổ hợp thu 45 3.1 Xác định hàm lượng TEVp tái tổ hợp thu 45 3.3.2 Thử hoạt tính TEVp 47 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 49 4.1 Biểu gen mã hóa TEVp 49 4.1.1 Lựa chọn hệ biểu E coli 49 4.1.2 Lựa chọn vector biểu 49 4.1.3 Điều kiện biểu 51 4.2 Tinh TEVp tái tổ hợp 54 4.3 Về hàm lượng TEVp tái tổ hợp thu 55 4.4 Về hoạt tính TEVp tái tổ hợp thu 56 KẾT LUẬN 58 ĐỀ XUẤT 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ala Alanin APS Ammonium persulfat Arg Arginin Asn Asparagin bp Base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool cDNA Complementary DNA cs Cộng Cys Cystein E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamin tetraacetic acid Gln Glutamin Glu Acid glutamic Gly Glycin GST Glutathion S transferase His Histidin Ile Isoleucin IPTG Isopropyl β - D - - thiogalatopyranosid kDa Kilo dalton LB Luria Bertani Leu Leucin LIF Leukemia inhibitory factor MBP Maltose binding protein NaOAC Sodium acetate OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction Phe Phenylalanin RT Reverse transcriptase SDS Sodium dodecyl sulfat Ser Serin TAE Tris- acid acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TEV Tobacco etch virus TEVp TEV protease TEVSH TEVp có acid amin thay T17 thay D, N68 thay D, I77 thay V Trx Thioredoxin Tyr Tyrosin Val Valin vòng/phút v/p DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ phân loại protease Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian TEVp Hình 1.3 Cấu trúc vùng TEVp Hình 1.4.Cấu trúc trình tự nhận biết TEVp Hình 2.1 Sơ đồ minh họa bước nghiên cứu 19 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi TEV-FP TEV-RP 36 Hình 3.2 Điện di đồ kiểm tra plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng 37 xanh gel agarose 1% Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp EcoRI gel agarose 38 1% Hình 3.4 Trình tự nucleotid trình tự acid amin suy diễn tương ứng 39 đoạn gen mã hóa TEVp Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp NdeI XhoI 40 gel agarose 1% Hình 3.6 Điện di đồ kết biểu TEVp 41 Hình 3.7 Điện di đồ kết biểu TEVp nhiệt độ khác 42 Hình 3.8 Điện di đồ kết biểu TEVp nồng độ IPTG khác 43 Hình 3.9 Điện di đồ kết biểu TEVp thời gian khác 44 Hình 3.10 Điện di đồ kết tinh TEVp tái tổ hợp 45 Hình 3.11 Đường chuẩn BSA 46 Hình 3.12 Điện di đồ kết thử hoạt tính TEVp 47 Hình 4.1 Sơ đồ vector biểu pET21a(+) 51 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi khuếch đại gen mã hoá TEVp 20 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự ADN 22 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự ADN 22 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa TEVp vào vector 23 pCR2.1 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pCR-TEVp 24 enzym EcoRI Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pCR-TEVp 24 enzym NdeI XhoI Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt vector pET21a(+) enzym 25 NdeI XhoI Bảng 2.10 Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa TEVp vào 25 vector biểu pET21a(+) Bảng 2.11 Thành phần đổ gel polyacrylamid 30 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng cắt gp120 tái tổ hợp TEVp 35 Bảng 3.1 Kết đo mật độ quang dung dịch BSA chuẩn 46 protein tái tổ hợp Khi tiến hành biểu gen TEVp vi khuẩn E coli có bổ sung IPTG, sau chạy điện di gel polyacrylamid ngồi băng protein với kích thước 27kDa tương đương với kích thước TEVp, chúng tơi nhận thấy sau cảm ứng xuất băng protein có kích thước nhỏ (khoảng 25 kDa) Có thể TEVp tái tổ hợp bị cắt bỏ phần đầu C tận hoạt tính protease chúng Kết phù hợp với kết cơng bố trước TEVp sau biểu hệ thống tái tổ hợp cắt thân để tạo protein có kích thước nhỏ có hoạt tính so với protein kiểu dại [31] Nhiệt độ nuôi cấy E coli Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp, mặt khác ảnh hưởng đến tính ổn định plasmid tế bào qua ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng protein tái tổ hợp Nhiệt độ cao khả đào thải plasmid chủng chủ lớn, đồng thời làm cho mARN dễ bị phá hủy Một số protein ngoại lai tổng hợp tốt 370C tốc độ sinh trưởng chủng chủ đạt tối đa, số protein khác lại cần phải biểu điều kiện nhiệt độ thấp [49] Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng số nhiệt độ 180C, 300C, 370C hiệu suất biểu trạng thái hay tồn TEVp tái tổ hợp Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 300C 370C, TEVp biểu chủ yếu dạng khơng hòa tan, 180C chủ yếu tạo dạng hòa tan Như nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến trạng thái biểu protein tái tổ hợp Ở nhiệt độ 300C 370C, vi khuẩn sinh trưởng mạnh protein tổng hợp nhanh hệ thống tế bào vật chủ không gấp nếp (folding) để tạo thành protein có cấu trúc với cấu trúc tự nhiên, dẫn đến protein biểu tập trung lại thành dạng thể vùi (inclusion body) Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Kapust cs [23], Parks cs [34] nhiệt độ thấp TEVp chủ yếu biểu dạng hòa 52 tan Vì để đảm bảo hoạt tính enzym, chọn nhiệt độ để biểu TEVp 180C Nồng độ IPTG Chủng E coli BL21 StarTM (DE3) có chứa gen mã hóa T7 ARN polymerase đặt kiểm soát promoter lacUV5 lac operator Trong plasmid pET21a(+), gen ngoại lai đưa vào vị trí đặt kiểm soát promoter T7 lac operator [30] LacI chất ức chế có lực cao với lac operator gắn vào operator làm cho lac promoter điều khiển mã gen T7 ARN polymerase hệ gen chủng chủ promoter T7 điều khiển phiên mã gen ngoại lai plasmid không hoạt động Khi cảm ứng với IPTG, IPTG gắn vào LacI làm cho LacI khơng lực với lac operator rời khỏi phức hợp với operator ADN hệ gen chủng chủ plasmid Khi đó, lac operator hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 ARN polymerase T7 ARN polymerase gắn vào vị trí promoter T7 để khởi đầu trình sinh tổng hợp protein ngoại lai [44] Vì vậy, lượng chất cảm ứng bổ sung vào môi trường không cần nhiều mà cần vừa đủ để trung hòa chất ức chế LacI Ngồi ra, việc sử dụng IPTG cần có giới hạn, IPTG gây độc cho tế bào, nồng độ IPTG môi trường cao ức chế vi khuẩn sinh trưởng Lượng IPTG thường bổ sung vào môi trường tới nồng độ cuối mM [50] Khi tiến hành bổ sung IPTG theo thứ tự nồng độ 0,4 mM; 0,7 mM; mM hiệu suất sản xuất TEVp tái tổ hợp gần tương đương Tuy nhiên xác định trạng thái biểu protein mục tiêu cho thấy nồng độ 0,7 mM IPTG, lượng protein tái tổ hợp hòa tan lớn Do đó, lượng IPTG thích hợp lựa chọn để bổ sung vào môi trường 0,7 mM Thời gian nuôi cấy E coli sau cảm ứng IPTG Thời điểm thu nhận protein tái tổ hợp ảnh hưởng tới hiệu suất sản xuất protein tế bào E coli sinh trưởng tới sinh khối định Sau đạt tới pha cân bằng, môi trường nuôi cấy cạn kiệt nguồn dinh dưỡng nên E coli sinh nhiều protease để tăng cường thối hóa protein nhằm cung cấp 53 lượng cho tế bào làm giảm lượng protein tái tổ hợp [50] Theo Sambrook thời điểm thích hợp thu nhận protein tái tổ hợp sau ni cấy E coli nhiệt độ 180C qua đêm [39] Trong nghiên cứu này, khảo sát biểu TEVp tái tổ hợp khoảng thời gian 17 giờ, 20 giờ, 24 sau cảm ứng IPTG 0,7 mM nuôi 180C Kết cho thấy thời điểm 24 sau cảm ứng, hiệu suất thu hồi TEVp lớn Do chúng tơi lựa chọn thời gian thích hợp để nuôi cấy E coli quy mô lớn nhằm sản xuất TEVp tái tổ hợp 24 sau cảm ứng IPTG 4.2 Tinh TEVp tái tổ hợp Dung dịch TEVp sau thu nhận có nhiều protein tạp nhiễm khác nhau, có nhiều protein E coli Các protein tạp nhiễm ảnh hưởng đến hoạt tính tính đặc hiệu TEVp việc ứng dụng dùng để cắt protein dung hợp khỏi protein đích, cần phải loại bỏ protein tạp nhiễm Protein tinh nhiều phương pháp khác nhau: sắc ký trao đổi ion, sắc ký điểm, sắc ký lực, sắc ký pha đảo, sắc ký lực miễn dịch, sắc ký lực cố định kim loại, sắc ký lọc gel, điện di điểm, điện di polyacrylamid không biến tính, điện di polyacrylamid biến tính (SDS-PAGE) Lựa chọn phương pháp để tinh protein cần vào đặc điểm để đảm bảo hiệu suất thu hồi protein cao protein thu đáp ứng mục đích sử dụng Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp sắc ký lực với kim loại cố định (sử dụng cột lực Probond nickel - chelating resin) Phương pháp dựa vào đặc điểm TEVp tái tổ hợp thu có histidin (6 His) Khi có protein mang histidin qua, vòng imidazol histidin liên kết với ion kim loại cột giữ protein lại cột Các protein khơng có lực có lực yếu với ion kim loại cột bị rửa trơi q trình tinh Căn vào đặc điểm riêng TEVp tái tổ hợp, sắc ký cột lực Ni2+ phương pháp đặc hiệu để tinh TEVp tái tổ hợp Do TEVp tái tổ hợp biểu 54 dạng hòa tan nên chúng tơi lựa chọn phương pháp tinh khơng biến tính (native condition) [9] Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực khơng gây biến tính protein tái tổ hợp Kết thu protein tái tổ hợp có độ tinh cao, vừa đảm bảo hiệu suất thu hồi, vừa giữ hoạt tính TEVp tái tổ hợp 4.3 Về hàm lượng TEVp tái tổ hợp thu Sau tiến hành biểu 180C 24 với nồng độ IPTG cảm ứng 0,7 mM, lượng TEVp tái tổ hợp thu 480 mg/L Lượng TEVp tái tổ hợp thu có tương đồng so với nghiên cứu trước Tuy nhiên yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện thí nghiệm khác như: hóa chất, mơi trường ni cấy, ….nên nghiên cứu có tính chất tham khảo để dựa chúng tơi tìm điều kiện biểu thích hợp TEVp tế bào E coli Năm 2006, Vanden Berg cs biểu TEVp 200C 20 với nồng độ IPTG cảm ứng 1mM, lượng TEVp tái tổ hợp thu đạt 54 mg/L [51] Cùng vào năm 2006, Fang cs biểu TEVp đồng biểu với chaperon 280C, nồng độ IPTG cảm ứng 0,5 mM lượng TEVp tái tổ hợp 65 mg/L [19] Đến năm 2007, Blommel Fox đưa phương pháp tiếp cận mới, nâng lượng TEVp thu thành 400 mg/L dịch nuôi cấy biểu 250C với 0,5 mM IPTG cảm ứng [8] Năm 2009, Xudong Wu cs nghiên cứu protein có khả gấp nếp (folding) mạnh phát huỳnh quang xanh (Superfolder green fluorescent protein, sfGFP) làm tăng khả hòa tan độ gấp cuộn xác TEVp Nhóm nghiên cứu tiến hành biểu E coli với vector biểu pET21a điều kiện 190C 20 sau cảm ứng với mM IPTG, TEVp tái tổ hợp thu 320 mg/L dịch nuôi cấy [54] Năm 2010, Miladi cs nghiên cứu dung hợp TEVp với Streptag II (Streptag II-TEVp) biểu protein dung hợp E coli 250C với nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM 20 giờ, lượng TEVp tái tổ hợp thu 66 mg/L [27] Gần năm 2012, Changsheng Sun cs sử dụng công 55 nghệ SOE PCR để tổng hợp đoạn gen TEVp với kiểu codon tối ưu hóa để phù hợp với codon thường gặp E coli Bằng cách biểu 200C 24 sau cảm ứng với 0,1 mM IPTG họ thu 145 mg/L TEVp tái tổ hợp [46] Có thể thấy nghiên cứu tiến hành biểu TEVp nhiệt độ thấp với nồng độ IPTG cảm ứng không mM Như điều kiện biểu TEVp 180C 24 với nồng độ IPTG cảm ứng 0,7 mM phù hợp 4.4 Về hoạt tính TEVp tái tổ hợp thu Hệ thống vi khuẩn có chế biểu sửa chữa protein tái tổ hợp khác với trình diễn virus tự nhiên, nơi TEVp phân lập, TEVp tái tổ hợp khơng giữ cấu trúc tự nhiên khơng có hoạt tính mong muốn Do đó, sau thu TEVp tái tổ hợp tinh sạch, tiến hành kiểm tra hoạt tính protease Hoạt tính phân cắt dung hợp protein Trx TEVp tái tổ hợp thử nghiệm nghiên cứu trước Năm 2010, Tomala cs tiến hành biểu tinh LIF (Leukemia inhibitory factor), sau thu LIF dạng tái tổ hợp LIF-Trx, nhóm nghiên cứu thử hoạt tính TEVp với chất LIF Kết thu hai tiểu phần protein Trx có trọng lượng phân tử khoảng 14k Da LIF có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa [47] Sau vào năm 2011, Song Yuzhen cs tiến hành thử hoạt tính phân cắt TEVp tái tổ hợp với chất metallothionein type (MT II) MT II biểu E coli dung hợp với TrxA đầu N tận TEVp tái tổ hợp nhận biết cắt đặc hiệu protein liên kết thành hai tiểu phần protein TrxA MT II [42] Trong nghiên cứu này, sử dụng protein tái tổ hợp gp120 HIV làm chất để kiểm tra hoạt tính TEVp tái tổ hợp Protein gp120 tái tổ hợp Phòng vi sinh vật học phân tử - Viện Cơng nghệ sinh học thiết kế biểu E coli dung hợp với Trx đầu N tận Ở điểm tiếp giáp gp120 Trx có vị trí nhận biết TEVp Do đó, có hoạt tính enzym, 56 TEVp tái tổ hợp nhận biết cắt đặc hiệu protein liên kết thành hai tiểu phần protein Trx có trọng lượng phân tử khoảng 14 kDa gp120 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa Kết nghiên cứu bước đầu cho thấy, TEVp tái tổ hợp giữ hoạt tính protease phân cắt đặc hiệu protein liên kết Trxgp120 Các kết nghiên cứu nêu mở triển vọng sản xuất TEVp tái tổ hợp để ứng dụng nghiên cứu y sinh học phân tử Việt Nam Tuy nhiên, để hướng tới mục tiêu đó, cần có thêm nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất biểu hiện, tăng khả thu hồi TEVp tái tổ hợp dạng hòa tan cần xác định điều kiện hoạt động tối ưu cho TEVp tái tổ hợp thu 57 KẾT LUẬN Đã biểu thành cơng đoạn gen mã hóa TEVp hệ biểu E coli với điều kiện thích hợp sau: - Nhiệt độ: 180C - Thời gian nuôi cấy E coli sau cảm ứng: 24 - Nồng độ IPTG cảm ứng: 0,7 mM Đã tinh protein TEVp tái tổ hợp cột sắc ký lực Probond nickel-chelating resin Kiểm tra hàm lượng hoạt tính TEVp tái tổ hợp cho thấy: - Lượng protein tái tổ hợp thu 0,48 mg/mL - Protein tái tổ hợp thu thể hoạt tính protease phản ứng cắt Trx từ protein dung hợp gp120-Trx 58 ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu phương án nâng cao hiệu suất biểu thu hồi độ hòa tan TEVp tái tổ hợp E coli Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động TEVp tái tổ hợp để hướng tới khả ứng dụng thực tế nghiên cứu y- sinh học 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Benard R.Glick, Jack J PasteARNk (2007), Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng ADN tái tổ hợp, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng, tr.3-13, Luận án tiến sĩ, ĐH Dược Hà Nội Lê Ngọc Tú, Lưu Duẩn, Đặng Thị Thu, Đặng Thị Cúc, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thủy (2000), Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt, NXB Khoa học Kỹ thuật TIẾNG ANH Allison R.F., Johnston R.E., Dougherty W.G (1986), “The nucleotide sequence of the coding region of tobacco etch virus genomic ARN : evidence for the synthesis of a single polyprotein”, Virology, 154, pp.920 Barret A.J (1994), “Classification of peptidases.”, Methods Enzymol, 244, pp.1-15 Barret A.J., Rawlings N.D (1991), “Types and families of endopeptidase”, Biochem Soc Trans, 19, pp.707-715 Beynon R., Bond J.S (2001), Proteolytic enzymes edition, pp.1-12, Oxford University Press Blommel P.G., Fox B.G (2007), “A combined approach to improving largescale production of tobacco etch virus protease”, Protein Expression and Purification, 55, pp.53-68 Boner Philip L.R (2007), Protein purification, Taylor & Francis 10 Bornhost J A and Falke J J (2000), “Purification of proteins using polyhistidine affinity tags”, Methods Enzymol, 326, pp.245–254 11 Cabrita L.D., Gilis D., Robertson A.L., Dehouck Y., Rooman M., Bottmomley S.P (2007), “Enhacing the stability and solubility of TEV protease using in silico design”, Protein Science, 16, pp.2360–2367 12 Carrasco P., Daros J.A., Agudelo - Romero P and Elena S.F (2007), “A real-time RT - PCR assay for quantifying the fitness of tobacco etch virus in competition experiments”, J Virol Methods, 139, pp.181-188 13 Carrington J.C., Cary S.M., Parks T.D., Dougherty W.G (1989), “A second proteinase encoded by a plant potyvirus genome”, EMBO JouARNl, 8, pp.365-370 14 Damirdagh I.S., Shepherd R.J (1970), “Some of the chemical properties of the tobacco etch virus and its protein and nucleic acid components”, Virology, 40, pp.84-89 15 Daròs J.A., Schaad M.C., Carrington J.C (1999), “Functional analysis of the interaction between VPg-proteinase (NIa) and ARN polymerase (NIb) of tobacco etch potyvirus, using conditional and suppressor mutants”, JouARNl of virology, 73, pp.8732–8740 16 Dougherty W.G., Carrington J.C (1988), “Expression and function of potyviral gene products”, Ann Rev Phytopathol, 26, pp.123–143 17 Dougherty W.G., Park T.D., Cary S.M., Bazan J.F., Fletterick R.J (1989), “Characterization of the catalytic residues of the tobacco etch virus 49-kDa proteinase”, Virology, 172, pp.302-310 18 Dougherty W.G., SemLer B.L (1993), “Expression of virus-encoded proteinases: functional and structural similarities with cellular enzymes”, Microbiological Reviews, 57, pp.781-822 19 Fang L., Jia K.Z., Tang Y.L., Ma D.Y., Yu M., Hua Z.C., Polayes D.A., Parks T.D., Johnston S.A (2007), “An improved strategy for high-level production of TEV protease in Escherichia coli and its purification and characterization”, Protein Expression and Purification, 51, pp.102–109 20 Kapust R.B., Routzahn K.M., Waugh D.S (2001), “Processive degradation of nascent polypeptides, triggered by tandem AGA codons, limits the accumulation of recombinant tobacco etch virus protease in Escherichia coli BL21(DE3)”, Protein Expression and Purification, 24, pp.61–70 21 Kapust R.B., Tozser J., Copeland T.D., Waugh D.S (2002), “The P1’ specificity of tobacco etch virus protease”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 294, pp.949–955 22 Kapust R.B., Tozser J., Fox J.D., Cherry S., Copeland T.D., Anderson D.E., Waugh D.S (2001), “Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 294, pp.949–955 23 Kapust R.B., Waugh D.S (1999), “Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused”, Protein Science, 8, pp.1668–1674 24 La Vallie E.R., Lu Z.J., Diblasio-Smith E.A., Collins-Racie L.A., McCoy J.M (2000), “Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli”, Methods Enzymol, 326, pp.322– 340 25 Makrides S.C (1996), “Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli”, Microbiological Reviews, 60, pp 512-538 26 Mathews D.A., Smith W.W., Ferre R.A., Condon B., Budahazi G., Sisson W., Villafranca J.E., Janson C.A., Mcelry H.E., Gribskov C.L., Worland S (1994), “Structure of human rhinovirus 3C protease reveals a trypsin like polypeptide fold, ARN – binding site, and means and for cleaving precursor polyprotein”, Cell, 77, pp.761-771 27 Miladi B., Bouallagui H., Dridi C., Marjou A.E., Boeuf G., Martino P.D., Dufour F., Elm’Selm A (2011), “Reprint of: A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity”, Protein Expression and Purification, 75, pp.5-82 28 Mohanty A.K., Simmons C.R., Wiener M.C (2003), “Inhibition of tobacco etch virus protease activity by detergents”, Protein Expression and Purification, 27, pp.109-114 29 Nallamsetty S., Kapust R.B., Tözsér J., Cherry S., Tropea J.E., Copeland T.D., Waugh D.S (2004), “Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro”, Protein Expression and Purification, 38, pp.108-115 30 Novagen (2003), “pET system manual”, TB055 10th Edition Rev.B0403, pp.4-19 31 Nunn C.M., Jeeves M., Cliff M.J., Urquhart G.T., Roger R.G., Luke H.C., Yugo T., Snezana D (2005), “Crystal structure of tobacco etch virus protease shows the protein C terminus bound within the active site”, J Mol Biol, 350, pp.145-155 32 Parks T.D., Dougherty W.G (1991), “Substrate recognition by the Nla proteinase of two potyviruses involves multiple domains characterization using genetically engineered hybrid proteinase molecules”, Virology, 182, pp.17-27 33 Parks T.D., Dougherty W.G., Leuther K.K., Howard E.D., Johnston S.A (1994), “Release of proteins and peptides from fusion proteins using a recombinant plant virus proteinase”, Analytical Biochemistry, 216, pp.413417 34 Parks T.D., Howard E.D., Wolpert T.J., Arp D.J., Dougherty W.G (1995), “Expression and purification of a recombinant tobacco etch virus NIa proteinase: biochemical analyses of the full – length and a naturally occurring truncated protein form”, Virology, 210, pp.194-201 35 Phan J., Zdanov A., Evdokimov A.G., Tropea J.E., Peters H.K., Kapust R.B., Li M., Wlodawer A., Waugh D.S (2002) “Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease”, The jouARNl of biological chemistry, 52, pp.50564-50572 36 Puhl A.C., Giacominit C., Irazoquit G., Batista-Viera F (2009), “Covalent immobilization of tobacco etch virus NIa protease: a useful tool for cleavage of the histidine tag of recombinant proteins”, Biotechnol Appl Biochem, 53, pp.165–174 37 Purcifull D E., Hiebert E (1982) “Tobacco etch virus”, Association of applied biologists, Descriptions of plant viruses, 258 38 Rosenberg A.H., Lade B.N., Chui D., Lin S., Dunn J.J., Studier F.W (1987), “Vectors for selective expression of cloned ADNs by T7 ARN polymerase”, Gene, 56, pp125-135 39 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press & Cold Spring Harbor 40 Shen H., Chou K (2009), “Identification of proteases and their types”, Analytical Biochemistry, 385, pp.153–160 41 Smith D.B (2000), “Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies”, Methods Enzymol, 326, pp.254–270 42 Song Y.Z., Li P.P., Du Y.J (2011), “Overexpression of thioredoxin and metallothionein type from brassica juncea fusion protein in Escherichia coli and in vitro cleavage by TEV protease”, Advanced Materials Research, 183-185, pp.947-951 43 Stols L., Gu M., Dieckman L., Raffen S., Collart F.R., Donnelly M.I (2002), “A new vector for high throughput, ligation independent cloning encoding a tobacco etch virus protease”, Protein Expression and Purification, 25, pp.8–15 44 Studier F.W., Moffatt B.A (1986), “Use of bacteriophage T7 ARN polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes”, J.Mol.Biol., 189, pp.113-130 45 Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W (1990), “ Use of T7 ARN polymerase to direct expression of cloned genes”, Methods in Enzymology, 185, pp.60-89 46 Sun C., Liang J., Shi R., Gao X., Zhang R., Hong F., Yuan Q., Wang S (2012), “Tobacco etch virus protease retains its activity invarious buffers and in the presence of diverse additives”, Protein Expression and Purification, 82, pp.226–231 47 Tomala M., Lavrentieva A., Moretti P., Rinas U., Kasper C., Stahl F., Schambach A., Warlich E., Martin U., Cantz T., Scheper T (2010), “Preparation of bioactive soluble human leukemia inhibitory factor from recombinant Escherichia coli using thioredoxin as fusion partner”, Protein Expression and Purification, 73, pp.51–57 48 Tropea J.E., Cherry S., Waugh D.S (2009), “Expression and purification of soluble His6-tagged TEV protease”, Methods in Molecular Biology: High throughput protein expression and purification, 498, pp.297-307 49 Tsuchudia S., Shigemastu T., Ahara T., Nunome K., Hamue N., Aoki T (2010), “Application of homogeneous assay for fluorescence concentrated on membrane to the analysis of the substrate specificity of protease”, Biosci Biotechnol Biochem., 74, pp.869-871 50 Vaillancourt P.E (2002), E coli gene expression protocols, Humana Press 51 Vanden Berg S., Lofdahl P.A., Hard T., Berglund H (2006), “Improved solubility of TEV protease by directed evolution”, JouARNl of Biotechnology, 121, pp.291-298 52 Waugh D.W., Chief P.D (2010), “TEV Protease FAQ”, Macromolecular Crystallography Laboratory, pp.1-7 53 Wehr M.C., Reinecke L., Botvinnik A., Rossner M.J (2008), “Analysis of transient phosphorylation dependent protein-protein interactions in living mammalian cells using split-TEV”, BMC Biotechnol, 2008, pp.1-15 54 Wu X., Wu D., Lu Z., Chen W., Hu X., Ding Y (2009), “A novel method for high-level production of TEV protease by superfolder GFP tag”, JouARNl of Biomedicine and Biotechnology, 2009, pp.1-8 ... gen mã hóa TEVp thu nhận TEVp tái tổ hợp , thực nhằm mục tiêu: - Biểu gen mã hóa TEVp - Thu nhận tinh TEVp tái tổ hợp - Bước đầu kiểm tra hàm lượng hoạt tính protein tái tổ hợp CHƯƠNG 1: TỔNG... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA TEV PROTEASE VÀ THU NHẬN TEV PROTEASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH... pháp nghiên cứu Từ cDNA TEV Khuếch đại gen mã hóa TEVp phản ứng PCR Tách dòng gen với vector tách dòng pCRTM 2.1 Tích hợp gen mã hóa TEVp vào vector biểu pET21a(+) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào