Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa GP41 của HIV và thu nhận protein GP41 tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN BẮC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ GP41 CỦA HIV VÀ THU NHẬN PROTEIN GP41 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN BẮC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ GP41 CỦA HIV VÀ THU NHẬN PROTEIN GP41 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : HOÁ SINH DƯỢC MÃ SỐ : 60 73 25 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Duy Kháng TS Phùng Thanh Hương HÀ NỘI - 2011 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin nói lời cảm ơn PGS.TS Đinh Duy Kháng TS Phùng Thanh Hương – người Thầy, người Cơ trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Xin nói lời cảm ơn chân thành tập thể Thầy, Cô trường Đại học Dược Hà Nội giúp em trang bị kiến thức cần thiết để hồn thành khóa học Thạc sỹ Cảm ơn Phòng ban, đặc biệt Phòng sau đại học, giúp đỡ em nhiệt tình trình học tập Xin cảm ơn đồng nghiệp Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà Nội, người gánh vác giúp em nhiều công việc ln cổ vũ em q trình học tập, tạo điều kiện cho em có thời gian để hồn thành khóa học Xin cảm ơn anh, chị, em cơng tác Phòng Vi sinh học phân tử - Viện Cơng nghệ sinh học Việt Nam hết lòng giúp đỡ em trình thực đề tài tốt nghiệp Xin cảm ơn gia đình, bạn bè luôn động lực, nguồn cổ vũ giúp em hồn thành khóa học khóa luận tốt nghiệp Học viên Nguyễn Xuân Bắc MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………… PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan HIV/AIDS…………………… ………………………… 1.1.1 Dịch tễ HIV/AIDS…………………………………………………… 1.1.2 Đặc điểm HIV…………………………………………………… 1.1.3 Chẩn đoán HIV/AIDS………………………………………………… 1.1.4 Điều trị HIV/AIDS…………………………………………………… 1.2 Tổng quan gp41 HIV……… ………………………………… 1.2.1 Cấu trúc vai trò gp41………………………………………… 1.2.2 Gen mã hố gp41…………………………………………………… 11 1.2.3 Nghiên cứu gp41 chẩn đoán điều trị HIV/AIDS ………… 11 1.2.4 Nghiên cứu biểu gp41…………………………………………… 13 Phần NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu…………………………………………… 15 2.1.1 Hoá chất, sinh phẩm………………………………………………… 15 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu…………………………………………… 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 16 2.2.1 Phương pháp khuếch đại gen gp41…………………………………… 17 2.2.2 Phương pháp tinh ADN từ điện di agarose……… ……… 18 2.2.3 Phương pháp giải trình tự ADN……………………………………… 18 2.2.4 Phương pháp so sánh trình tự ADN…………………… 20 2.2.5 Phương pháp cắt ADN enzym giới hạn…………………… 20 2.2.6 Phương pháp tích hợp gen gp41 vào vector pCR2.1………………… 21 2.2.7 Phương pháp tích hợp gen gp41 vào vector pET32a(+)……………… 22 2.2.8 Phương pháp tách plasmid từ E coli………………………………… 22 2.2.9 Phương pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli……………… 23 2.2.10 Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pCR2.1 tích hợp gen gp41…………………… …………………… …………………………… 24 2.2.11 Phương pháp điện di ADN gel agarose………………………… 25 2.2.12 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamid……………… 25 2.2.13 Phương pháp xác định trạng thái tồn protein gp41 tái tổ hợp 25 2.2.14 Phương pháp xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên mức độ biểu gp41…………………… …………………… …………………………… 26 2.2.15 Phương pháp xác định ảnh hưởng nồng độ IPTG lên mức độ biểu gp41…………………… …………………… ………………… 26 2.2.16 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy E coli lên mức độ biểu gp41…………………… ……………………………… 27 2.2.17 Phương pháp biểu gen mã hoá gp41 E coli …………… 28 2.2.18 Phương pháp thu nhận tinh gp41 tái tổ hợp………………… 28 2.2.19 Phương pháp đánh giá khả phản ứng gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV………………………………………… 29 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………… 31 3.1 Kết biểu gen mã hoá gp41 HIV phân typ CRF01_AE … 31 3.1.1 Nhân dòng gen FNgp41…………………… ……………………… 31 3.1.2 Khuếch đại gen gp41…………………… ……………………… 34 3.1.3 Tạo plasmid tái tổ hợp dòng trung gian…………………………… 34 3.1.4 Tích hợp gen gp41 vào vector biểu pET32a(+)………………… 36 3.1.5 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố lên q trình biểu gp41…………………… …………………… ……………………… 3.1.6 Xác định trạng thái tồn gp41 sinh tổng hợp E coli chủng 38 40 BL21(DE3) …………………… …………………… …………………… 3.2 Kết tinh gp41 tái tổ hợp đánh giá khả phản ứng gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV …………………… 3.2.1 Kết tinh gp41 tái tổ hợp …………………………………… 41 41 3.2.2 Kết đánh giá khả phản ứng gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV…………………… …………………… 42 Phần BÀN LUẬN……… ……………………………………………… 44 4.1 Biểu gen mã hoá gp41 HIV phân typ CRF01_AE……… … 44 4.1.1 Lựa chọn đoạn gen gp41 …………………… ……………………… 44 4.1.2 Lựa chọn hệ biểu E coli…………………… ………………… 46 4.1.3 Điều kiện biểu …………………… …………………………… 47 4.2 Tinh protein gp41 tái tổ hợp đánh giá khả phản ứng protein gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV … 4.2.1 Tinh protein gp41 tái tổ hợp…………………………………… 49 49 4.2.2 Đánh giá khả phản ứng protein gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV …………………… ………………………… 51 KẾT LUẬN…………………………………….…………………………… 52 ĐỀ XUẤT…………………………………………………………………… 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn Syndrome dịch mắc phải APS Ammonium persulfate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent Định lượng miễn dịch liên kết enzym assay HIV Human Immunodeficiency Virus Virus gây suy giảm miễn dịch người HR1 Heptad repeat Đoạn lặp HR2 Heptad repeat Đoạn lặp IN Integrase Enzym tích hợp IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside LB Luria Bertani PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi RT Reverse transcriptase Enzym phiên mã ngược SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris – Acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus UNAIDS United Nations Programme on Chương trình quốc tế HIV and AIDS HIV AIDS v/p Vòng/phút WHO World health organization Tổ chức y tế giới DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc hạt HIV-1 hồn chỉnh Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen HIV-1 Hình 1.3 Chu kỳ phát triển HIV Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc gp41 10 Hình 1.5 Cấu trúc kẹp tóc tạo đoạn lặp gp41 10 Hình 1.6 Quá trình dung hợp HIV vào tế bào chủ 10 Hình 1.7 Trình tự gen gp41 HIV-1 11 Hình 3.1 Điện di plasmid tách từ E coli Top 10F’ gel agarose 1% 31 Hình 3.2 Điện di sản phẩm cắt plasmid pCRgp41 EcoR I gel 32 agarose 1% Hình 3.3 Điện di sản phẩm cắt plasmid pCRgp41 EcoR I gel 33 agarose 1% Hình 3.4 Điện di sản phẩm khuếch đại gen gp41 gel agarose 1% 34 Hình 3.5 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp dòng trung gian 35 BamH I Xho I gel agarose 1% Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt plasmid biểu BamH I Xho I 36 gel agarose 1% Hình 3.7 So sánh trình tự gen gp41 với gen FNgp41 37 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy E coli lên hiệu suất biểu 38 gp41 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên hiệu suất biểu gp41 39 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hiệu suất biểu gp41 40 Hình 3.11 Trạng thái tồn gp41 tái tổ hợp 41 Hình 3.12 Điện di protein gp41 tái tổ hợp sau qua cột sắc ký gel 42 polyacrylamid Hình 3.13 Khả phản ứng protein tái tổ hợp với mẫu huyết người phát kỹ thuật Western blot 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) phát Mỹ vào năm 1981 với nguyên nhân virus HIV (Human immunodeficiency virus) [2] Từ đó, số người phát nhiễm HIV khơng ngừng tăng lên phạm vi tồn cầu Tính đến cuối năm 2009, tồn giới có khoảng 33,3 triệu người nhiễm HIV Năm 2009, số người tử vong AIDS giới khoảng 1,8 triệu [ 46] Trung bình ngày có thêm 14000 trường hợp nhiễm HIV (2000 trẻ em 12000 người lớn) [3] Việt Nam nằm khu vực có tỷ lệ nhiễm HIV cao với số người nhiễm HIV tính đến ngày 31 tháng 03 năm 2011 185623, số bệnh nhân AIDS 44701, số người chết AIDS 49912 [5] AIDS không bệnh gây chết báo trước người mang mà gây gánh nặng kinh tế, xã hội cho quốc gia Hiện nay, việc điều trị HIV/AIDS tốn kém, kéo dài hiệu điều trị khơng cao, chủ yếu nhằm mục đích kéo dài thời gian sống bệnh nhân HIV dễ lây qua đường máu, qua quan hệ tình dục truyền từ mẹ sang Người nhiễm HIV thường xuất triệu chứng bệnh sau thời gian dài nên nguy lây nhiễm HIV lại cao [2],[28] Vì việc chẩn đốn sớm trường hợp nhiễm HIV vô quan trọng công tác ngăn ngừa lây nhiễm HIV cộng đồng Hiện nay, chẩn đoán HIV/AIDS, đặc biệt việc sàng lọc trường hợp nhiễm HIV Việt Nam chưa tiến hành diện rộng Một lý việc chẩn đốn HIV/AIDS có chi phí lớn kit chẩn đốn nhập từ nước ngồi có giá cao Bên cạnh đó, sử dụng kit chẩn đốn HIV nhập từ nước ngồi đặt nghi vấn độ nhạy độ đặc hiệu phân typ HIV nước ta khác với phân typ HIV lưu hành số nước Để chế tạo kit chẩn đốn HIV cần phải có kháng nguyên HIV gp41, gp120, p24 Trong gp41 kháng nguyên bề mặt nghiên cứu biểu nhiều giới chưa nghiên cứu biểu Việt Nam.Vì vậy, nhằm tạo kit chẩn đốn HIV có độ nhạy độ đặc hiệu cao với chủng HIV lưu hành Việt Nam, đồng thời có chi phí thấp, việc nghiên cứu tạo gp41 HIV lưu hành Việt Nam cần thiết Mặt khác giới, gp41 quan tâm nghiên cứu nhằm tạo thuốc vaccin ngăn ngừa HIV [15],[16],[32],[29],[38],[43],[44] Với lí trên, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen mã hoá gp41 HIV thu nhận protein gp41 tái tổ hợp nhằm mục tiêu sau: - Biểu gen mã hoá gp41 HIV phân typ CRF01_AE - Tinh protein gp41 tái tổ hợp bước đầu đánh giá khả phản ứng protein gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV 10 A C B M M kDa M 45 40 ≈37 35 25 Hình 3.13 Khả phản ứng protein tái tổ hợp với mẫu huyết người phát kỹ thuật Western blot A Mẫu thử huyết bệnh nhân HIV B Mẫu thử huyết người không nhiễm với protein tái tổ hợp HIV với protein tái tổ hợp Đường chạy M - marker protein Đường chạy M - marker protein Đường chạy - protein tái tổ hợp Đường chạy - protein tái tổ hợp C Mẫu thử huyết bệnh nhân HIV với thioredoxin Đường chạy M - marker protein Đường chạy - thioredoxin Nhận xét: Protein tái tổ hợp gồm gp41 gắn với thioredoxin phản ứng rõ nét với huyết bệnh nhân HIV không phản ứng với huyết người khơng nhiễm HIV Trong thioredoxin không phản ứng với mẫu huyết bệnh nhân HIV Như khẳng định gp41 protein tái tổ hợp có khả gắn đặc hiệu với kháng thể HIV huyết bệnh nhân HIV 51 Phần BÀN LUẬN 4.1 Biểu gen mã hoá gp41 HIV phân typ CRF01_AE 4.1.1 Lựa chọn đoạn gen gp41 Protein toàn phần HIV đoạn peptid ngắn (10-15 acid amin) sử dụng để phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân [23] Tuy nhiên, sử dụng protein toàn phần đoạn peptid ngắn có số nhược điểm Sử dụng protein tồn phần gây phản ứng dương tính giả có tương đồng trình tự acid amin số peptid HIV với số virus khác [10],[23] Sử dụng protein toàn phần gây phản ứng âm tính giả có biến đổi protein HIV trình xử lý để sản xuất protein tồn phần [23] Trong đó, đoạn peptid ngắn có lực với kháng thể kháng HIV khơng cao nên thường có độ nhạy thấp sử dụng để chế tạo kit chẩn đốn HIV Do đó, việc sản xuất đoạn peptid có lực cao với kháng thể kháng HIV để chế tạo kit chẩn đốn HIV có ý nghĩa quan trọng Trong kháng nguyên HIV, gp41 có phản ứng miễn dịch ổn định với huyết bệnh nhân HIV [23] Vì gp41 phù hợp để sử dụng chế tạo kit chẩn đoán HIV Tuy nhiên, theo nghiên cứu Baoguang Han cộng sự, khó biểu tồn gen gp41 hệ biểu E coli [10] Trong trình nghiên cứu, chúng tơi tiến hành biểu thử toàn gen gp41 (FNgp41) chủng HIV1 CRF01_AE hệ biểu E coli không thành công Do đó, đoạn gen ngắn dựa trình tự gen gp41 lựa chọn để biểu Đoạn gen lựa chọn có kích thước khoảng 500 bp, bao gồm trình tự gen mã hóa cho epitop kháng nguyên gp41 Đoạn gen lựa chọn dùng để biểu nghiên cứu có nhiều ưu điểm bật Thứ nhất, có kích thước khơng q lớn nên biểu thành cơng hệ biểu E coli Để biểu tồn gen gp41 cần phải lựa chọn hệ biểu khác biểu tế bào động vật [42] Biểu tế bào động vật phức tạp chưa nghiên cứu Việt Nam Thứ hai, đoạn gen mã hóa cho protein kích thước khoảng 180 acid amin có nhiều 52 epitop nên protein tái tổ hợp thu có lực cao với kháng thể kháng HIV có khả kích thích thể sinh kháng thể Do protein tái tổ hợp thu sử dụng cho mục đích chế tạo kit chẩn đốn vaccin HIV Trong số nghiên cứu giới, đoạn gen dùng để biểu có kích thước nhỏ [10], điều thuận lợi trình biểu làm giảm lực protein tái tổ hợp thu với kháng thể kháng HIV dẫn đến giảm độ nhạy Kit chẩn đoán HIV Hơn nữa, đoạn gen dùng để biểu nghiên cứu thu từ chủng HIV lưu hành phổ biến Việt Nam (chủng CRF01_AE) Trên giới có nhiều nghiên cứu biểu gp41 nghiên cứu chủng HIV khác nên nói nghiên cứu biểu đoạn gen Đoạn gen lựa chọn nghiên cứu gồm trình tự thu từ chủng HIV-1, protein tái tổ hợp thu có lực với kháng thể huyết bệnh nhân nhiễm HIV-2 không cao Baoguang Han cộng nghiên cứu biểu đoạn gen mang hai trình tự mã hóa gp41 HIV-1 HIV-2 [10] Tuy nhiên, kỹ thuật tiến hành biểu phức tạp nhiều so với biểu trình tự riêng lẻ Hơn nữa, có tương đồng định hệ gen HIV-1 HIV-2 nên xảy phản ứng kháng nguyên HIV-1 với kháng thể kháng HIV-2 ngược lại Baoguang Han cộng không so sánh lực protein tái tổ hợp gp41 thu từ chủng HIV riêng lẻ protein tái tổ hợp thu từ chủng HIV với kháng thể có huyết bệnh nhân HIV Do đó, chưa có chứng để khẳng định lực protein tái tổ hợp thu có lực với kháng thể kháng HIV-2 khơng cao Thực tế, kit chẩn đốn HIV-1 phát trường hợp bệnh nhân nhiễm HIV-2 Như vậy, đoạn gen lựa chọn vừa đảm bảo thuận lợi cho trình biểu hiện, vừa đảm bảo protein tái tổ hợp thu có đặc điểm đáp ứng yêu cầu dùng để sản xuất kit chẩn đoán HIV 53 4.1.2 Lựa chọn hệ biểu E coli Trong cơng nghệ sinh học, có nhiều hệ biểu gen khác gồm vi khuẩn, nấm, tế bào côn trùng, tế bào thực vật, tế bào động vật Trong E coli sinh vật nghiên cứu sớm sử dụng phổ biến nghiên cứu biểu gen nhiều loại protein nhờ khả sinh sản nhanh điều kiện nuôi cấy đơn giản Hơn nữa, có nhiều chủng E coli đột biến khác nên thuận lợi cho việc lựa chọn chủng phù hợp với mục đích nghiên cứu [1] Hệ biểu E coli có nhược điểm E coli khơng có hệ thống biến đổi protein sau dịch mã gấp cuộn glycosyl hóa [1], gp41 màng HIV tồn dạng glycosyl hóa cao [33] Vì cấu trúc tính kháng nguyên gp41 tái tổ hợp sinh tổng hợp từ hệ biểu khơng hồn tồn giống với gp41 tự nhiên Thực tế, số trình tự gen gp41 HIV biểu thành công hệ biểu E coli protein tái tổ hợp thu có khả gắn đặc hiệu với kháng thể kháng HIV [10],[36] Do đó, việc lựa chọn E coli làm hệ biểu nghiên cứu có sở khoa học phù hợp với mục đích nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp có khả gắn đặc hiệu với kháng thể kháng HIV nhằm chế tạo kit chẩn đoán HIV Trong nghiên cứu, hai chủng E coli sử dụng gồm chủng Top 10F’ chủng BL21(DE3) E coli chủng Top 10F’ sử dụng để tách dòng đoạn gen cần biểu dòng tế bào có tốc độ sinh sản nhanh đồng thời có nhiều plasmid (10-20) tế bào, phù hợp với mục đích khuếch đại plasmid Trong đó, E coli chủng BL21(DE3) sử dụng để biểu đoạn gen mong muốn chủng vi khuẩn có nhiều ưu điểm làm tăng hiệu suất biểu protein ngoại lai Thứ nhất, chủng mang đột biến gen rne (mã hóa cho enzym Rnase) nên hạn chế phân hủy ARN thông tin Thứ hai, chủng thiếu gen lon (mã hóa cho enzym protease nội bào) gen Omp T (mã hóa cho enzym protease màng tế bào) nên giảm phân hủy protein [47] 54 4.1.3 Điều kiện biểu Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình biểu gp41 gồm: nhiệt độ nuôi cấy E coli, nồng độ IPTG, thời gian nuôi cấy E coli sau cảm ứng IPTG [10], yếu tố khác nồng độ Oxy thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy E coli [1] Điều kiện biểu không ảnh hưởng tới hiệu suất sản xuất mà ảnh hưởng tới đặc tính protein tái tổ hợp thu Vì việc nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu thích hợp để có hiệu suất sản xuất cao giữ đặc tính kháng nguyên gp41 có ý nghĩa quan trọng tiến tới sản xuất gp41 quy mô lớn Nhiệt độ nuôi cấy E coli: Lựa chọn 30oC để nuôi cấy E coli lý sau: Thứ nhất, nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy E coli nhằm biểu protein ngoại lai từ 20oC tới 37oC [40] Do đề tài tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng số điểm (22oC, 25oC, 30oC, 37oC) khoảng nhiệt độ hiệu suất biểu protein tái tổ hợp Kết hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp 30oC 37oC cao so với 22oC 25oC Điều giải thích 30oC 37oC hoạt tính enzym có vai trò sinh tổng hợp protein (RNA polymerase, aminoacyl – RNAt synthetase, peptidyltransferase …) tốc độ sinh trưởng E coli cao so với nhiệt độ 22oC 25oC [47] Như chọn điều kiện 30oC 37oC để đạt hiệu suất sản xuất gp41 cao Thứ hai, kết nghiên 30oC 37oC nhiệt độ 37oC protein tái tổ hợp thu chủ yếu dạng khơng hòa tan, nhiệt độ 30oC protein tái tổ hợp thu chủ yếu tồn dạng hòa tan Trong nghiên cứu Jean Edouard Gairin cộng sự, E coli nuôi cấy 37oC thu gp41 dạng hòa tan [23] tác giả biểu đoạn gp41 ngắn (52 acid amin) đoạn gp41 nghiên cứu có kích thước lớn (khoảng 180 acid amin) Dạng gp41 tái tổ hợp hòa tan vừa có ưu điểm thuận lợi cho q trình tinh sạch, vừa có cấu trúc gần với cấu trúc tự nhiên gp41 so 55 với dạng khơng hòa tan [36] Do đó, 30oC điều kiện thích hợp để biểu gp41 tái tổ hợp với chủng E coli BL21(DE3) Thời gian nuôi cấy E coli sau cảm ứng ITPG: Thời điểm thu nhận protein tái tổ hợp ảnh hưởng tới hiệu suất sản xuất protein tế bào E coli sinh trưởng tới sinh khối định Sau đạt tới pha cân bằng, môi trường nuôi cấy cạn kiệt nguồn dinh dưỡng nên E coli sinh nhiều protease để tăng cường thoái hóa protein để cung cấp lượng cho tế bào làm giảm lượng protein tái tổ hợp [47] Thời điểm thích hợp thu nhận protein tái tổ hợp sau ni cấy E coli từ đến [40] Trong nghiên cứu này, sau cảm ứng IPTG giờ, hiệu suất thu hồi gp41 lớn thời gian thích hợp để ni cấy E coli quy mô lớn nhằm sản xuất gp41 tái tổ hợp Nồng độ IPTG: E coli BL21 Star™ (DE3) có chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase hệ gen Gen đặt kiểm soát lacUV5 promoter lac operator Đồng thời, hệ plasmid pET, biểu gen ngoại lai điều khiển T7 promoter lac operator Khi môi trường chất cảm ứng, gen lacI nằm hệ gen vi khuẩn phiên mã sinh tổng hợp protein LacI LacI gắn vào vị trí lac operator gây ức chế trình phiên mã gen ngoại lai Khi cảm ứng với IPTG, IPTG gắn với LacI làm cho LacI không gắn với lac operator nên không ức chế trình phiên mã gen ngoại lai (gp41) Lượng IPTG bổ sung vào môi thường tới nồng độ cuối mM [40] Tuy nhiên, kết nghiên cứu nồng độ nồng độ IPTG thay đổi từ mM tới 0,5 mM, hiệu suất sản xuất gp41 không thay đổi đáng kể Tuy nhiên, nồng độ IPTG thấp 0,5 mM, hiệu suất sinh tổng hợp IPTG thay đổi đáng kể Hơn IPTG chất đắt tiền, sử dụng lượng lớn làm tăng chi phí sản xuất gp41 tái tổ hợp Vì vậy, để đảm bảo hiệu suất sản xuất gp41 giảm chi phí, lượng IPTG thích hợp bổ xung vào môi trường 0,5 mM 56 4.2 Tinh protein gp41 tái tổ hợp đánh giá khả phản ứng protein gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV 4.2.1 Tinh protein gp41 tái tổ hợp Phương pháp tinh gp41 tái tổ hợp Sau thu nhận gp41 theo phương pháp 2.2.16, dung dịch gp41 thu có nhiều tạp chất khác nhau, có nhiều protein E coli Các tạp chất protein gây phản ứng miễn dịch với kháng thể kháng E coli số vi khuẩn virus khác tạp chất protein không loại bỏ khơng thể dùng protein thu để chế tạo kit chẩn đốn HIV gây kết dương tính giả Mặc khác, tạp chất protein, đặc biệt nội độc tố E coli gây shock phản vệ [1] nên cần phải loại bỏ để tiến hành nghiên cứu (ví dụ nghiên cứu khả kích thích sinh kháng thể gp41 động vật thực nghiệm) Protein tinh nhiều phương pháp khác nhau: sắc ký trao đổi ion, sắc ký điểm, sắc ký lực, sắc ký pha đảo, sắc ký lực miễn dịch, sắc ký lực cố định kim loại, sắc ký lọc gel, điện di điểm, điện di polyacrylamid khơng biến tính, điện di polyacrylamid biến tính (SDS-PAGE) [13] Lựa chọn phương pháp để tinh protein cần vào đặc điểm để đảm bảo hiệu suất thu hồi protein cao protein thu đáp ứng mục đích sử dụng Paul T Wingfiel cộng biểu đoạn gp41(27-154) tế bào E coli kết hợp phương pháp sắc ký lọc gel sắc ký pha đảo để tinh protein tái tổ hợp thu [36] Trong đó, Baoguang Han cộng sử dụng phương pháp SDS-PAGE để tinh gp41 tái tổ hợp [10] Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp sắc ký lực kim loại cố định (sử dụng cột lực ProBond Nickel-Chelating Resin) Phương pháp dựa vào đặc điểm gp41 tái tổ hợp thu có His (6 phân tử histidin) Đây đặc điểm riêng gp41 tái tổ hợp, sử dụng sắc ký cột lực Ni2+ phương pháp đặc hiệu để tinh gp41 Phương pháp có ưu điểm khơng gây biến tính protein phương pháp SDS-PAGE (là phương pháp sử dụng phổ biến để tinh protein 57 [13]) Kết thu protein tái tổ hợp có độ tinh khiết cao phản ứng miễn dịch đặc hiệu với huyết bệnh nhân nhiễm HIV Như vậy, phương pháp sử dụng nghiên cứu vừa đảm bảo hiệu suất thu hồi cao, vừa giữ tính kháng nguyên gp41 Đặc tính gp41 tái tổ hợp Protein tái tổ hợp thu sau tinh có kích thước khoảng 37 kDa Protein tái tổ hợp có kích thước lớn protein mã hóa đoạn gen gp41 sử dụng để biểu (khoảng 20 kDa) ngồi acid amin mã hóa gen gp41, protein tái tổ hợp tích hợp thêm thioredoxin acid amin Histidin (đi His) Thioredoxin làm tăng tính ổn định protein tái tổ hợp, hạn chế bị thủy phân enzym protease có tế bào Trong đó, His có lực cao với số ion kim loại Nikel Cobal nên protein tái tổ hợp dễ dàng tinh cột sắc ký lực có gắn Nikel Cobal [13] Protein tái tổ hợp có phản ứng với kháng thể HIV huyết bệnh nhân HIV chứng tỏ thioredoxin đuôi His khơng làm tính kháng ngun gp41 khơng cần loại bỏ thành phần khỏi protein tái tổ hợp chế tạo kit chẩn đoán HIV gp41 màng tế bào virus thường tồn dạng phức hợp ba phân tử [8] Một số nghiên cứu biểu gp41 thu hỗn hợp dạng đơn phân tử, dạng phức hợp hai phân tử dạng phức hợp phân tử [36] Tuy nhiên, với việc thu protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 37 kDa chứng tỏ dạng protein tái tổ hợp dạng đơn phân tử (thioredoxin + gp41 + đuôi His) Lý phân tử protein tái tổ hợp khơng kết hợp với là: Thứ nhất, E coli khơng có hệ thống biến đổi protein sau dịch mã nên protein không gấp cuộn trường hợp HIV phát triển tế bào người; thứ hai, thioredoxin đuôi His cản trở liên kết kỵ nước phân tử gp41 nên phân tử protein tái tổ hợp không kết hợp với 58 4.2.2 Đánh giá khả phản ứng protein gp41 tái tổ hợp với huyết bệnh nhân nhiễm HIV Để đánh giá khả phản ứng kháng nguyên với kháng thể sử dụng kỹ thuật ELISA Western blot [23] Trong Western blot kỹ thuật có độ nhạy đặc hiệu cao [2] Do vậy, kết đánh giá khả phản ứng gp41 với huyết bệnh nhân HIV thu từ nghiên cứu hoàn toàn tin cậy Kết cho thấy protein tái tổ hợp thu có phản ứng miễn dịch với huyết bệnh nhân HIV, đồng thời không phản ứng miễn dịch với huyết người không nhiễm HIV Khi sử dụng thioredoxin làm chứng, thioredoxin không phản ứng với mẫu huyết bệnh nhân HIV nên loại trừ khả thioredoxin protein tái tổ hợp phản ứng với huyết bệnh nhân HIV, chứng tỏ gp41 protein tái tổ hợp có phản ứng đặc hiệu với huyết bệnh nhân HIV Do đó, protein tái tổ hợp thu đáp ứng yêu cầu để chế tạo kit chẩn đốn HIV Tóm lại, sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp HIV để chế tạo kit chẩn đoán lĩnh vực Việt Nam Đây nghiên cứu biểu kháng nguyên gp41 HIV Kết đề tài ý nghĩa mặt nghiên cứu mà có ý nghĩa thực tiễn cao, sở khoa học để chuyển giao công nghệ nhằm sản xuất gp41 tái tổ hợp quy mô lớn, tạo nguyên liệu chế tạo kit chẩn đoán HIV 59 KẾT LUẬN Đã biểu thành công đoạn gen gp41 HIV-1 CRF01_AE hệ biểu E coli với điều kiện thích hợp sau: Nhiệt độ: 30oC Thời gian nuôi cấy E coli sau cảm ứng: Nồng độ IPTG: 0,5 mM Đã tinh protein tái tổ hợp, gp41 tái tổ hợp thu có kích thước khoảng 37 kDa có phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân nhiễm HIV ĐỀ XUẤT Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán HIV từ protein gp41 tái tổ hợp Đánh giá tính sinh kháng thể protein gp41 tái tổ hợp động vật thực nghiệm 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bernard R Glick, Jack J Pasternak (2007), Công nghệ sinh học phân tử, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Bộ môn Vi sinh vật, trường đại học Y Hà Nội (2001), Vi sinh y học, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2005), Quyết định việc phê duyệt Chương trình hành động quốc gia chăm sóc, hỗ trợ điều trị cho người nhiễm HIV đến năm 2010, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị HIV/AIDS, Hà Nội Bộ Y tế (2011), Báo cáo tình hình nhiễm HIV/AIDS quý I năm 2011, Hà Nội Trịnh Đình Đạt (2009), Cơng nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội Bạch Thị Như Quỳnh, Lê Phương Hằng, Hoàng Thị Thanh Huyền, Lê Huy Tuấn, Đinh Duy Kháng (2009), “Xác định phân typ HIV lưu hành số địa phương Việt Nam”, Tạp chí y học Việt Nam, 360(2), tr.41-44 Tiếng Anh: Ahmad (2006), “Characterization of HIV-1 envelope gp41 genetic diversity and functional domains following perinatal ransmission”, Retrovirology, 3, pp.1-18 Baneyx F (1999), “Recombinant protein expression in Escherichia coli”, Current Opinion in Biotechnology, 10, pp.411-421 10 Baoguang Han et al (1998), “The use of a chimera HIV-1/HIV-2 envelope protein for immunodiagnosis of HIV infection: its expression and purification in E.coli by use of a translation site within HIV-1 env gene”, Biochemistry and molecular biology international, 46 (3) pp.607-617 11 Bernard N Fields et al (1996), Fundamental Virology, Lippincott Williams & Wilkins 12 Bianchi E., Joyce J.G., Miller M.D., Finnefrock A.C., Liang X., Finotto M., Ingallinella P., McKenna P., Citron M., Ottinger E., Hepler R.W., Hrin R., Nahas D., Wu C., Montefiori D., Shiver J.W., Pessi A., Kim P.S (2010), “Vaccination 61 with peptide mimetics of the gp41 prehairpin fusion intermediate yields neutralizing antisera against HIV-1 isolates”, Proc Natl Acad Sci U S A, 7(23), pp.10655-10660 13 Bonner Philip L R., Protein purification, Taylor & Francis 14 Buzon V., Natrajan G., Schibli D., Campelo F., Kozlov M.M., Weissenhorn W (2010), “Crystal structure of HIV-1 gp41 including both fusion peptide and membrane proximal external regions”, PLoS Pathog, 6(5), pp 120-125 15 Chen X., Lu L., Qi Z., Lu H., Wang J., Yu X., Chen Y., Jiang S (2010), “Novel recombinant engineered gp41 N-terminal heptad-repeat trimers: potential as antiHIV-1 therapeutics or microbicides”, J Biol Chem (Epub ahead of print) 16 Christina M.R Kitchen et al (2008), “Enfuvirtide antiretroviral therapy in HIV1 infection”, Therapeutics and Clinical Risk Management, 4(2), pp.433-439 17 Cobas - Roche (2010), HIV Ag confirmatory Test, Switzerland 18 Erik De Clercq (2002), “New anti-HIV agents and targets”, Medical Reserch Review, 22(6), pp.531-565 19 Fauci S Anthony et al (1998), Principles of interal medicine, McGraw-Hill, New York 20 Gavin Brooks (2002), Gene Therapy, Pharmaceutical Press 21 Hoffmann Christian, Rockstroh K Jurgen, Kamps Bernd Sebastian (2007), HIV Medicine 2007, Flying Publisher 22 Jean Christophe Plantier et al (2009), “A new human immunodeficiency virus derived from gorillas”, Nature medicine, advance online publication 23 Jean Edouard Gairin et al (1991), “Expression in yeast of a cDNA clone encoding a transmembrane glycoprotein gp41 fragment (a.a 591 – 642) bearing the major immunodominant of human immunodeficency virus”, FEMS Microbiology Immunology, 76, pp.109-120 62 24 Kenealy W., Reed D., Cybulsky R (1987), “Analysis of human serum antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) using recombinant ENV and GAG antigens”, AIDS Res Human Retrovir, 3, pp 95-105 25 Lodge Julia, Lund Pete, Minchin Steve (2007), Gene cloning, Taylor & Francis 26 Makrides S.C (1996), “Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli”, Microbiological Reviews, 60(3), pp 512-538 27.Margottin Florence, Transy Catherine (2005), “Virus-Cell molecular interferences”, Institue Cochine, L’Université Paris Descartes 28 Marie Anne Rey Cuille et al (2006), “HIV-1 neutralizing antibodies elicited by the candidate CBD1 epitope vaccine react with the conserved caveoline-1 binding motif of viral glycoprotein gp41”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58, pp.759-767 29 Martoglio B., Graf R., Dobberstein B (1997), “Human immunodeficiency virus complete genome”, EMBO J, 16(22), pp.6636-6645 30 Michael D Miller et al (2005), “A human monoclonal antibody neutralizes diverse HIV-1 isolates by binding a critical gp41 epitope”, PNAS, 102 (41), pp.14759–14764 31 Moselio Schaecheter et al (2000), Microbial Disease, Lippincott Williams & Wilkins 32 Nath A (2009), “HIV/AIDS and Indian youth-a review of the literature (19802008)”, SAHARA J 6(1), pp.2-8 33 Nigel J Dimmock (2005), “The complex antigenicity of a small external region of the C-terminal tail of the HIV-1 gp41 envelope protein: a lesson in epitope analysis”, Medical Virology, 15, pp.365-381 34 Pancera M., Majeed S., Ban Y.E., Chen L., Huang C.C., Kong L., Kwon Y.D., Pan C., Liu S., Jiang S (2009), “HIV-1 gp41 fusion intermediate: a target for HIV therapeutics”, J Formos Med Assoc , 109(2), pp.94-105 63 35 Paul R Bohjanen, Yi Liu, Mariano A Garcia-Blanco (1997), “TAR RNA decoys inhibit Tat-activated HIV-1”, Nucleic Acids Research, 25(22), pp.4481– 4486 36 Paul T Wingfiel et al (1997), “The extracellular domain of immunodeficiency virus gp41 protein: Expression in Escherichia coli, purification, and crystallization’, Protein science, 6, pp.1653-1660 37 University of Pennsylvania school of medicine (2010), “Phase II HIV Gene Therapy Trial Has Encouraging Results”, Science daily, Feb 19th 38 Qadir M.A., S A Malik (2010), “HIV fusion inhibitors”, Medical Virology, 20, pp.23–33 39 Rajes Ramakrishnan, Roshni Mehta, Vasudha Sundaravaradan, Tiffany Davis, Nafees Robert G Webster, Allan Granoff (1995), Encyclopedia of Virology, Academic Press 40 Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press & Cold Spring Harbor 41 Sen J., Yan T., Wang J., Rong L., Tao L., Caffrey M (2008), “Alanine scanning mutagenesis of HIV-1 gp41 heptad repeat 1: insight into the gp120-gp41 interaction”, Biochemistry, 49(24), pp.5057-5065 42 Simon Beddows et al (2006), “Construction and Characterization of Soluble, Cleaved, and Stabilized Trimeric Env Proteins Based on HIV Type Env Subtype A”, AIDS Research and Human Retroviruses, 22(6), pp.569 – 579 43 Soonthornsata B et al (2010), “Design and evaluation of antiretroviral peptides corresponding to the C-terminal heptad repeat region (C-HR) of human immunodeficiency virus type envelope glycoprotein gp41”,Virology Jun 25 Epub ahead of print 44 Stephen E Schneider et al (2005), “Development of HIV fusion inhibitors”, Journal of Peptide Science, 11, pp.744-753 64 45 Stuckey J., Zhou T., Robinson J.E., Schief W.R., Sodroski J., Wyatt R., Kwong P.D (2010), “Structure of HIV-1 gp120 with gp41-interactive region reveals layered envelope architecture and basis of conformational mobility”, Proc Natl Acad Sci U S A,107(3), pp.66-71 46 UNAIDS (2011), AIDS epidemic update, WHO library 47 Vaillancourt Peter E (2002), E coli Gene Expression Protocols, HUMANA PRESS 48 Xiaobin Lu et al (2004), “Antisense-Mediated Inhibition of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Replication by Use of an HIV Type 1-Based Vector Results in Severely Attenuated Mutants Incapable of Developing Resistance”, J Virol, 78(13), pp.7079–7088 65 ... tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen mã hoá gp41 HIV thu nhận protein gp41 tái tổ hợp nhằm mục tiêu sau: - Biểu gen mã hoá gp41 HIV phân typ CRF01_AE - Tinh protein gp41 tái tổ hợp bước đầu đánh...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN BẮC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ GP41 CỦA HIV VÀ THU NHẬN PROTEIN GP41 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC... nguyên tái tổ hợp HIV, có kháng nguyên gp41 tái tổ hợp Các kháng nguyên tái tổ hợp tạo dựa nguồn gen số chủng HIV lưu hành phổ biến số nước [24] Nghiên cứu gp41 điều trị HIV/ AIDS Những thành tựu nghiên