Nghiên cứu tiêu chuẩn cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ và đan sâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HOÀ NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC HỖN HỢP HOÀNG KỲ VÀ ĐAN SÂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HOÀ NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC HỖN HỢP HOÀNG KỲ VÀ ĐAN SÂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 73 15 Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Hồng Cường TS Trần Việt Hùng HÀ NỘI, NĂM 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tiêu chuẩn 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Hệ thống tiêu chuẩn ký hiệu tiêu chuẩn 1.1.3 Căn xây dựng tiêu chuẩn 1.1.4 Yêu cầu xây dựng tiêu chuẩn hóa thuốc 1.1.5 Tình hình xây dựng tiều chuẩn dược liệu sản phẩm từ dược liệu 1.1.6 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 1.2 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) 1.2.1 Khái niệm 1.2.1 Pha động 1.2.3 Pha tĩnh 1.2.4 Detector dùng HPLC 1.2.5 Các thông số đặc trưng HPLC 11 1.3 Đan sâm 13 1.3.1 Thông tin chung 13 1.3.2 Thành phần hóa học 13 1.3.3 Tác dụng sinh học Đan sâm tanshinon IIA 17 1.4 Hoàng kỳ 20 1.4.1 Thông tin chung 20 1.4.2 Thành phần hóa học 20 1.4.3 Tác dụng sinh học Hoàng kỳ astragalosid IV 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Phương pháp bào chế cao đặc 28 2.2.2 Phương pháp khảo sát tiêu cao đặc theo quy định DĐVN IV 30 2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng TAS - IIA cao đặc hỗn hợp HPLC – UV 30 2.2.4 Xây dựng phương pháp đinh lượng AGS - IV cao đặc hỗn hợp HPLC – ELSD 33 2.2.5 Thử giới hạn nhiễm khuẩn cao đặc hỗn hợp Hồng kỳ Đan sâm 36 2.2.6.Tính toán kết xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Chế cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm 38 3.1.1 Bào chế cao đặc hỗn hợp 38 3.1.2 Xác định khối lượng làm khô hiệu suất cao 38 3.1.3 Xác định tính chất vật lý cao đặc hỗn hợp 39 3.2 Định tính thành phần hóa học cao đặc hỗn hợp 40 3.2.1 Xác định có mặt TAS - IIA cao đặc hỗn hợp sắc ký lớp mỏng 40 3.2.2 Xác định có mặt AGS - IV cao đặc hỗn hợp sắc ký lớp mỏng 42 3.3 Định lượng định lượng TAS - IIA cao đặc hỗn hợp HK ĐS HPLC – UV 44 3.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng định lượng TAS- IIA HPLC – UV 44 3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng TAS - IIA HPLC – UV cao đặc hỗn hợp 47 3.4 Định lượng AGS - IV cao đặc hỗn hợp HK ĐS HPLC – ELSD 53 3.4.1 Xây dựng phương pháp định lượng AGS - IV HPLC – ELSD 53 3.4.2 Thẩm định phương pháp định lượng AGS - IV HPLC – ELSD 54 3.5 Giới hạn nhiễm khuẩn 62 3.5.1 Chuẩn bị thí nghiệm 62 3.5.2 Đếm số lượng vi khuẩn hiếu khí vi nấm 62 3.5.3 Xác định số lượng Enterobacteria vi khuẩn Gram âm khác 63 3.5.4 Tìm vi khuẩn gây bệnh 64 3.6 Xác định giới hạn kim loại nặng cao 64 3.7 Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm 65 CHƯƠNG BÀN LUẬN 67 4.1 Đối tượng nghiên cứu 67 4.2 Phương pháp nghiên cứu 68 4.2.1 Phương pháp bào chế cao đặc hỗn hợp HK ĐS 68 4.2.2 Phương pháp định lượng TAS - IIA cao đặc hỗn hợp HK ĐS 69 4.2.3 Phương pháp định lượng AGS - IV cao đặc hỗn hợp HK ĐS 70 4.3 Kết nghiên cứu 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao ELSD Detector tán xạ bay UV Detector UV HK Hoàng kỳ ĐS Đan sâm TLTK Tài liệu tham khảo DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV DĐTQ Dược điển Trung Quốc EtOH Ethanol MeOH Methanol CN Cao chiết nước CE30 Cao chiết ethanol 30% CE50 Cao chiết ethanol 50% CE80 Cao chiết ethanol 80% VKNTW Viện kiểm nghiệm thuốc trung Ương SKLM Sắc ky lớp mỏng TAS – IIA Tanshinon IIA AGS – IV Astraglosid IV ĐL Định lượng ĐT Định tính KL Khối lượng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các yếu tố cần đánh giá phương pháp phân tích Bảng 1.2 Thành phần hóa học Đan sâm 14 Bảng 3.1 Khối lượng làm khô hiệu suất mẫu cao đặc hỗn hợp 39 Bảng 3.2 Kết thử tính chất cảm quan 40 Bảng 3.3 Xác định độ tro toàn phần cao đặc hỗn hợp 40 Bảng 3.4 Vết sắc ký mẫu nghiên cứu 42 Bảng 3.5 Vết sắc ký mẫu nghiên cứu 44 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ pha động đến thời gian lưu TAS - IIA 45 Bảng 3.7 Độ thích hợp hệ thống 47 Bảng 3.8 Kết xác định khoảng tuyến tính 49 Bảng 3.9 Khảo sát độ lặp lại phương pháp 50 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ phương pháp 51 Bảng 3.11 Kết xác định giới hạn phát 51 Bảng 3.12.Kết định lượng TAS - IIA mẫu cao nghiên cứu 52 Bảng 3.13 Chương trình chạy dung mơi pha động 54 Bảng 3.14 Độ thích hợp hệ thống 54 Bảng 3.15 Khảo sát độ tuyến tính AGS - IV 57 Bảng 3.16 Kết thử độ lặp lại 58 Bảng 3.17 Khảo sát độ phương pháp 59 Bảng 3.19 Kết định lượng AGS - IV mẫu cao nghiên cứu 60 Bảng 3.20 Kết giới hạn nhiễm khuẩn cao đặc hỗn hợp HK ĐS 63 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo buồng hấp thụ UV 10 Hình 1.2 Cấu tạo buồng tán xạ hệ thống ELSD 10 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao đặc hỗn hợp 29 Hình 2.2.Máy cất quay Buchi 461 30 Hình 2.3 Máy HPLC – UV 31 Hình 2.4 Máy HPLC nối với ELSD 2000 34 Hình 3.1 Sắc ký đồ SKLM TAS - IIA mẫu nghiên cứu 41 Hình 3.2 Sắc ký đồ SKLM AGS - IV mẫu cao 43 Hình 3.3 Sắc đồ TAS - IIA với tỷ lệ dung môi pha động khác 46 Hình 3.4 Sắc ký đồ TAS- IIA 48 Hình 3.5 Đồ thị biểu tương quan nồng độ diện tích pic TAS- IIA 49 Hình 3.6 Sắc ký đồ TAS- IIA mẫu cao nghiên cứu 52 Hình 3.7 Sắc ký đồ astragalosid IV 56 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic AGS- IV 57 Hình 3.9 Sắc ký dung dịch chuẩn AGS - IV có nồng độ 0,25 mg/ml 57 Hình 3.10 Sắc ký dung dịch chuẩn AGS - IV có nồng độ 0,5 mg/ml 58 Hình 3.11 Sắc ký đồ AGS- IV mẫu cao nghiên cứu 62 ĐẶT VẤN ĐỀ Não quan quan trọng bậc thể Khi không đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng, không cung cấp đủ oxy, não không làm việc với suất thấp mà phát sinh nhiều bệnh Một bệnh hệ thần kinh thường gặp chứng thiểu tuần hồn não hay gọi thiếu máu não Thiểu tuần hồn não có hại cho sức khỏe, đặc biệt với tế bào não, khơng điều trị kịp thời dẫn tới biến chứng nguy hiểm nhũn não, xuất huyết não, đột qụy gây liệt tử vong Thiểu tuần hoàn não trạng thái bệnh lý thiếu hụt lượng máu cung cấp cho não, nguy gây tử vong đứng thứ ba sau bệnh tim mạch ung thư Tỷ lệ thường gặp chứng tăng 20 năm qua từ 1,5 đến 5,1 người/ 1.000 người/năm, có 1,5- 1,7/1000 trường hợp chết tai biến mạch máu não; gặp chủ yếu độ tuổi 70-76, độ tuổi từ 40-60 chiếm 4,2 – 15,2%; nam giới bị mắc chiếm 82%, cao nữ giới Theo ước tính Mỹ, thiệt hại đột qụy xảy bệnh nhân tai biến mạch máu não 29 tỷ USD/ năm chi phí điều trị cho bênh nhân bị chứng thiểu tuần hoàn não 100 ngàn USD/ năm [38] Ở nước ta, số người bị thiếu máu não ngày chiếm tỷ lệ cao Theo thống kê năm 2000 nước ta có 15,3% tử vong tai biến mạch máu não [10] Vì vậy, việc ngăn ngừa điều trị bệnh mối quan tâm hàng đầu ngành Y – Dược Thiểu tuần hoàn não hay gặp người cao tuổi, tuổi mà quan thể diễn q trình lão hóa, chức quan giảm dần nên việc lựa chọn thuốc điều trị quan trọng Các thuốc tân dược sử dụng piracetam, cinnarizin, vinpocetin… có tác dụng điều trị tích cực đáng kể bệnh nhân thiểu tuần hoàn Tuy nhiên, bên cạnh tác dụng điều trị, thuốc gây nên tác dụng không mong muốn quan thể hệ tiêu hóa, hệ tim mạch… Để góp phần vào việc điều trị thiểu tuần hoàn não, đặc biệt phát huy thuốc y học cổ truyền, sản phẩm với phối hợp mới, có tương đồng hiệp đồng tác dụng đặc biệt đáp ứng điều trị lâu dài, độc, tích lũy, giá thành thấp vấn đề cấp thiết Xuất phát từ tình hình thực tế trên, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đề xuất tiến hành thực đề tài cấp thành phố:“ Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng hoạt huyết thực nghiệm viên nang bào chế từ dược liệu Bạch quả, Hoàng kỳ, Đan sâm Đương quy” Để đảm bảo cho viên nang mềm Ích Trí Vương (bào chế từ bốn dược liệu trên) đạt tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào quan trọng Đề tài "Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm " phần đề tài thực với mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất cao - Khảo sát hàm lượng hoạt chất cao dược liệu bào chế theo phương pháp chiết xuất khác - Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm AGS - IV hàm lượng TAS - IIA tăng lên không đáng kể hiệu suất bào chế lại tăng lên Khi tăng tỷ lệ EtOH hiệu suất bào chế tăng chứng tỏ có nhiều chất dược liệu tan EtOH bao gồm chất khơng cần thiết gây độc Do để phù hợp với yêu cầu dùng sản xuất với quy mô lớn, lựa chọn sử dụng EtOH 80% vừa làm giảm kinh phí vừa làm giảm tính độc dược liệu (nếu có) Với nghiên cứu này, chứng tỏ chiết với ethanol cao độ làm tăng hàm lượng TAS- IIA AGS –IV có cao đăc, góp phần đưa khuyến cáo số sở dùng dung môi nước để chiết cao từ dược liệu ĐS HK - Dựa hiệu suất bào chế cao đặc hỗn hợp HK ĐS, dựa hàm lượng TAS- IIA có dược liệu ĐS trước bào chế 0,31%, AGS- IV dược liệu HK 0,047%, kết hợp với kết thực nghiệm mẫu CE80 (TAS- IIA 0,559% AGS – IV 0,1172%) đưa dự thảo yêu cầu hàm lượng TAS – IIA cao đặc hỗn hợp không thấp 0,5%, AGS – IV khơng thấp 0,1% Do q trình làm thực nghiệm, chúng tơi gặp số khó khăn nguyên liệu HK, đến tháng thị trường có 90% HK khơng đạt tiêu chuẩn chất lượng Thêm vào đó, thời gian thực nghiệm ngắn, khó khăn chất chuẩn, chúng tơi chưa thể tiến hành xác định hàm lượng TAS – IIA AGS- IV nhiều mẫu cao chiết với ethanol 80% nên chưa đưa tiêu chuẩn hàm lượng xác hai hoạt chất có cao đặc hỗn hợp HK ĐS - Cao đặc hỗn hợp sau bào chế xong đem xác định độ nhiễm khuẩn hàm lượng kim loại nặng cao để đưa yêu cầu tiêu chuẩn cao đặc 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN Khi hồn thành đề tài chúng tơi thực mục tiêu đề ra: - Xây dựng phương pháp định tính định lượng hoạt chất có cao đặc hỗn hợp HK ĐS +) Trong đó, đưa chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC – UV) để định lượng TAS - IIA cao đặc Điều kiện sắc ký sau: Cột RP18, 5µ m (4,6 x 250 mm) Pha động MeOH - nước (80 : 20) Detector UV bước sóng 270nm Thể tích tiêm 5µ l Tốc độ dòng 1,5 ml/ phút Nhiệt độ phân tích nhiệt độ phòng Phương pháp phân tích có độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thời gian phân tích ngắn, phân tích đúng, xác đối tượng cần phân tích Vì áp dụng phương pháp định lượng TAS- IIA cao đặc hỗn hợp phù hợp với điều kiện phòng nghiên cứu có trang bị máy HPLC +) Xây dựng chương trình chạy HPLC – ELSD định lượng AGS - IV cao đặc hỗn hợp với điều kiện: Cột: Phenomenex Luna 5u C18 (150 x 4,6mm; 5µ m) Detector: ELSD 2000 Nhiệt độ detector: 1050C Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Tốc độ dòng khí nitơ: lít/phút Thể tích tiêm: 20 µl Gain: 73 Chương trình chạy dung mơi pha động Thời gian Dung môi A (Nước) Dung môi B (Phút) (%) (Acetonitril) (%) > 10 100 10 > 45 > 60 100 > 40 45 > 65 60 40 Phương pháp phân tích có độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, phân tích xác đối tượng nghiên cứu - Đã áp dụng điều kiện sắc ký để định lượng TAS - IIA AGS- IV mẫu cao đặc hỗn hợp HK ĐS Với mẫu cao chiết EtOH hàm lượng TAS - IIA khoảng 0,381 – 0,559%, AGS - IV 0,0182 – 0,1172% Trong đó, hàm lượng TAS - IIA mẫu CE 80% đạt cao 0,559 % AGS - IV đạt cao mẫu cao với hàm lượng 0,1172 %; từ giúp định hướng lựa chọn phương pháp bào chế cao có hàm lượng TAS - IIA AGS - IV cao - Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc hỗn hợp HK ĐS Chỉ tiêu 1: Hàm lượng nước: từ 10 – 20% Chỉ tiêu 2: Tính chất vật lý STT Tính chất Yêu cầu Thể chất Khối mềm, dẻo đồng Màu sắc Nâu sẫm Mùi Thơm nhẹ Vị Hơi đắng, se Tro tồn phần < 20% Chỉ tiêu 3: Định tính Bằng sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ dung dịch thử có vết giá trị Rf màu hồng đậm với vết đạt sắc ký đồ dung dịch chuẩn TAS - IIA màu tím nhạt với vết đạt sắc ký đồ dung dịch chuẩn AGS - IV 74 Chỉ tiêu 4: Định lượng Trong cao đặc hỗn hợp HK ĐS phải chứa không 0,5% lượng TAS - IIA không 0,1% hàm lượng AGS - IV Chỉ tiêu 5: Giới hạn nhiễm khuẩn Giới hạn nhiễm khuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: khơng q 10000 cfu/g Tổng số nấm mốc: không 100 cfu/g Enterobecteria: không 500 cfu/g Mẫu chế phẩm Escherichia coli, Samonella sp, Pseudomonas aeruginosa, Staphyllococcus aureus Chỉ tiêu 6: Kim loại nặng không 20 ppm * KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện tiêu chất lượng cao đặc hỗn hợp HK ĐS - Nghiên cứu, tác dụng hoạt huyết thực nghiệm cao đặc hỗn hợp đánh giá độc tính an tồn chế phẩm 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Tuấn Anh (2005), Góp phần định tính phân biệt số vị thuốc mang tên Hồng kỳ, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, 5(3), 14-18 Bộ Y tế (2000), Quyết định Bộ trưởng Y tế số 1570 /2000 QĐ-BYT ngày 22 tháng năm 2000 việc triển khai áp dụng ngun tắc "thực hành tốt phòng thí nghiệm thuốc" Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học Bộ Y tế (2006), Kỹ thuật chế sinh dược học dạng thuốc, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tr.84 - 104 Bộ Y tế (2009), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội Bùi Xuân Chương, Nguyễn Phượng Dong, Đỗ Huy Bích - Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam, NXB Y hoc, tập 1, tr 946 – 950 Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, Nhà xuất Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, tr.49 - 234 Hiến pháp nước Cộng hòa XHCN Việt Nam (2006), Luật tiêu chuẩn quy chuẩn kỹ thuật Quốc Hộ nước cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam số 68/2006/QH11 ngày 29 tháng năm 2006 10 Hoàng Khánh (2009), Tai biến mạch máu não từ yếu tố nguy đến dự phòng,NXB Y học, tr 34 - 35 11 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, Hà Nội 12 Nguyễn Thị Minh Phương (2011), Nghiên cứu phương pháp vân tay sắc ký (TCL, HPLC) góp phần đánh giá chất lượng vị thuốc Đan sâm, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Dược Hà Nội 76 13 Thái Duy Thìn (2005), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đo quang phổ UV- VIS để định tính định lượng hoạt chất số thuốc có từ đến thành phần, Đề tài nghiên cứu cấp Bộ, 7-12 14 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2005), Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 230 - 250 Tài liệu tiếng anh 15 Alltech, Improving HPLC performance with Alltech's Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), Appicatipn booklet Pharmaceutical Analyses 16 Pharmacopoeia of the people's republic of China (2005), pp 194 - 197 17 The Korean Pharmacopoeia Ninth Edition (2007) 18 USP - 32 NF 27 (2009) 19 Chiu TL et al (2010), Tanshinone IIA induces apoptosis in human lung cancer A549 cells through the induction of reactive oxygen species and decreasing the mitochondrial membrane potential, Int J Mol Med, 25 (2), pp 231 - 236 20 Dong Tina T.X et al (2006), Chemical and Biological Assessment of a Chinese Herbal Decoction Containing Radix Astragali and Radix Angelicae Sinensis, Dertermination of drug ratio in having optimized properties J Agric Food Chem, 54, pp 2767 - 2774 21 Du M et al (2003), Astragaloside IV and polysaccharide production by hairy roots of Astragalus membranaceus in bioreactors, Biotechnology Letters, 25, pp 1853 - 1856 22 Fan G W et al (2009), The anti-inflammatory activities of Tanshinone II an active component of TCM, are mediated by estrogen receptor activation and inhibition of iNOS, The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 113 (3-5), pp 275-280 77 23 Ganzera M et al (2001), Separation of Astragalus Saponins by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography and Evaporative Light Scattering Detection, Chromatographi, 53, pp 131 - 134 24 Hong H J et al (2010), Tanshinone IIA attenuates angiotensin II-induced apoptosis via Akt pathway in neonatal rat cardiomyocytes, Acta Pharmacologica Sinic, 31, pp 1596-1575 25 Hui Xu et al (2009), Metabolic regulation and genetic engineering of pharmaceutical component tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza, Journal of Medicinal Plants Research, (24), pp 2591-2597 26 James David Adams et al (2006), Preclinical and clinical examinations of Salvia miltiorrhiza and its tanshinones in ischemic conditions, Chinese Medicine, (3) 27 James W R et al, Undergraduate Instrumental Analysis, Sixth Edition, 13, pp 789 – 835 28 Junhui Chen et al (2007), Standardized extracts of Chinese medicinal herb: case study of Danshen (Salvia miltiorrhiza Bunge), Journal of food and drug analysis, 15 (4), pp 347 - 364 29 Klaidman L et al (2003), Nicotinamide offers multiple protective mechanisms in stroke as a precursor for NAD+, as a PARP inhibitor and by partial restoration of mitochondrial function, Pharmacol, 69 (150) 30 Kwon H J et al (2011), Determination of astragalin and astragaloside content in Radix Astragali using high-performance liquid chromatography coupled with pulsed amperometric detection, Journal of Chromatography, pp 1-6 31 Lin T.H et al (2010), Pharmacological effects of Salvia miltiorrhiza (Danshen) on cerebral infarction, Lin and Hsieh Chinese Medicine, 5(22) 32 Liu A H Liu et al (2006), High-performance liquid chromatographic determination of tashinones in the roots of Salvia miltiorrhiza and related traditinal Chinese medicinal preparations, J Pharm Pharmaceut Sci, (1), pp 1-9 78 33 Liu J J et al (2009), Tanshinone IIA inhibits leukemia THP-1 cell growth by induction of apoptosis, Oncol Rep, 21 (4), pp 1075 - 1081 34 Marahatta Anu Marahatta et al (2012), Isolation of tanshinon IIA cryptotanshinon in Salvia Miltiorrhiza using two conventional extraction techniques and quantification by validated HPLC method, International Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, (1), pp 627 - 631 35 Ong E.S et al (2004), Evalution of Pressurized Liquid Extraction and Pressurized Hot Water Extraction for Tanshinone I and IIA in Salvia miltiorrhiza Using LC and LC-ESI-MS, Jounal of Chromatographic Scinece, 4, pp 211 - 216 36 Pan TL et al (2010), Functional proteomic and structural insights into molecular targets related to the growth inhibitory effect of tanshinone IIA on HeLa cells, Proteomics, 10 (5), pp 914 - 929 37 Qi L.W et al (2009), Application of high-performance liquid chromatography–electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry for analysis and quality control of Radix Astragali and its preparations, Journal of Chromatography, 1216, pp 2087 - 2097 38 Shavkat Karimov et al (2011), Diagnostics and treament of the patients with chronic cerebral vascular insufficiency, Medical and Health science Journal MHSJ, 5, pp 19 - 23 39 Shiqi Lu et al (2011), Effects of astragaloside IV on L-type calcium channel currents in adult rat ventricular myocytes, Journal of Medicinal Plants Research, (5), pp 833 - 840 40 Stephen Bullock et al (2004), Evaporative Light Scattering Detection Business briefing: Labtech, pp - 41 Tao L.V et al (2006), Comparion of protocatechuic aldechyde in Radix Salvia miltiorrhiza and corresponding pharmacological sera from normal and fibrotic rats by high performance liquid chromatography, World Journal of Gastroenteology, 12 (14), pp 2195-2200 79 42 Tao Wu et al (2005), Simultaneous determination of six isoflavonoids in commercial Radix Astragali by HPLC – UV, Fitoterapi, 76, pp 157-165 43 Wang XJ et al (2005), Potential anticancer activity of tanshinone IIA against human breast cancer, Int J Cancer, 116, pp 799-807 44 Wu YP et al (2008), Salvianolic acid B inhibits platelet adhesion under conditions of flow by a mechanism involving the collagen receptor alpha beta, Thromb Res, 123 (2), pp 298 - 305 45 Xu X.L et al (2007), Modification of alterations in cardiac function and sarcoplasmic reticulum by astragaloside IV in myocardial injury in vivo, European Journal of Pharmacology, 568, pp 203 - 212 46 Xu Y.Y et al (2007), Recent advence on research and application of Salvia miltiorrhiz, Asian journal of pharmacodynamics and pharmacokinetics, (2), pp 99-130 47 Xuejun Pan et al (2001), Microwave - assisted extraction of tanshinone from Salvia miltiorrhiza bunge with analysis by high - performance liquid chromatography, Journal of Chromatography, 922, pp 371 - 375 48 Yan Wen Lv et al (2011), Identification and Determination of Flavonoids in Astragali Radix by High performance Liquid Chromatography Coupled with DAD and ESI - MS detection, Molecules, 16, pp 2293 - 2303 49 Yan M M et al (2009), Optimisation of the microwave assisted extraction process for four main astragalosides in Radix Astragali, Food chemistry, 10, pp - 50 Yang X F et al (2003), Effects of Ginkgo biloba extract and tanshinone on cytochromeP - 450 isozymes and glutathione transferase in rats, Acta Pharmacol Sinic, 24 (10), pp 1033-1038 51 Ying Tu et al (2006), Simultaneous Determination of Acteoside, astragaloside IV and icariside-I in the Traditional Chinese Medicinal Preparation Shenbao by HPLC – MS, Chromatographi, 64, pp 453-458 80 52 You Yin et al (2010), Anti-Apoptosis Effect of Astragaloside IV on Alzheimer's Disease Rat Model via Enhancing the Expression of Bcl-2 And Bcl-X, Scand J Lab Anim Sci, 37 (2), pp 75 - 83 53 You Zhi Qu et al (2009), Astragaloside IV attenuates cerebral ischemia– reperfusion-induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats, European Journal of Pharmacology, 606, pp137-141 54 Yufei Feng et al (2012), Analysis of Salvia miltiorrhiza (Danshen), African Journal of Microbiology Research, (23), pp 4858 - 4867 55 Yumin Luoa et al (2004), Astragaloside IV protects against ischemic brain injury in a murine model of transient focal ischemia, Neuroscience Letters, 363, pp 218-223 56 Yunfei Li et al (2008), Simultaneous Determination of Seven Bioactive Compounds in Chinese Medicine "QI - SHEN - YI - QI'' Dropping Pill by LCUV and LC – ELSD, Chromatographi, 67, pp 293 - 297 57 Zhang Q et al (2006), Triterpenid inhibition Atherosclerosis and Xanthoma in LDL Receptor Knockout Mice, Cardiovase Drugs Ther, 20 (5), pp 349-357 81 DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC HỖN HỢP HOÀNG KỲ VÀ ĐAN SÂM Chế phẩm cao dược liệu điều chế cách cô đến đậm đặc đến độ ẩm thích hợp từ dịch chiết ethanol 80% rễ phơi hay sấy khô Hoàng kỳ Đan sâm I YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Mô tả: Khối mềm, dẻo đồng nhất, nâu sẫm, thơm nhẹ, đắng, se 1.2 Độ ẩm: Không 20,0% 1.3 Tro toàn phần: Nhỏ 20% 1.4 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính Hồng kỳ Đan sâm 1.5 Định lượng: Chế phẩm phải chứa không 0,5 % tanshinon IIA không 0,1 % hàm lượng astraglosid IV 1.6 Giới hạn nhiễm khuẩn: Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: khơng q 10000 cfu/g Tổng số nấm mốc: không 100 cfu/g Enterobecteria: không 500 cfu/g Mẫu chế phẩm khơng có Escherichia coli, Samonella sp, Pseudomonas aeruginosa, Staphyllococcus aureus 1.7 Giới hạn kim loại nặng: Không 20 ppm II PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Mô tả: Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Độ ẩm: Thử theo DĐVN IV (Phụ lục 9.6, 1g, 1050C, giờ) 2.3 Tro toàn phần: Thử theo DĐVN IV (Phụ lục 9.8) 2.4 Định tính: 2.4.1 Định tính tanshinon IIA Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (19 : 1) 82 Dung dịch thử: Lấy 0,2 g cao dược liệu, thêm ml ether (TT) lắc, để yên giờ, lọc Bốc dịch lọc cách thuỷ đến cắn, hoà tan cắn ml ethyl acetat (TT) dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Hòa tan lượng tanshinon IIA ethylacetat (TT) thu dung dịch đối chiếu chứa mg tanshinon IIA / ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô khơng khí, quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết giá trị Rf màu sắc với vết đạt sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 2.4.2 Định tính astragalosid IV Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 hoạt hóa 110 0C Hệ dung mơi khai triển: Cloroform – methanol - nước (65:35:10) Dung dịch thử: Cân 0,6 g cao dược liệu, thêm 40ml methanol, lắc siêu âm vòng 30phút, lọc Cơ dịch lọc cách thủy đến khơ Hòa tan cắn 10ml dung dịch amoniac 10% Để 10 phút, lắc Chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết với 15, 10, 10 ml n-butanol bão hòa nước Gộp dịch chiết butanol, cô cách thủy đến khô Hòa tan cắn 1ml methanol thu dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu astragalosid IV methanol (TT) để dung dịch đối chiếu có nồng độ mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng rẽ lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng, phun thuốc màu acid sulfuric 10% ethanol Sấy mỏng 105°C đến rõ vết Sắc ký đồ dung dịch thử phải cho vết màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 83 2.5 Định lượng 2.5.1.Định lượng tanshinon IIA theo phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: Cột: RP18 (Số đĩa lý thuyết khơng 2000) Pha động: methanol - nước (80 : 20) Detector: 270 nm Thể tích tiêm: 5µl Dung dịch chuẩn: Cân xác 10 mg tanshinon IIA chuẩn vào bình định mức có màu 50ml, hòa tan pha lỗng methanol tới vạch, trộn Lấy xác 2ml vào bình định mức có màu 25 ml, pha loãng methanol đến vạch, trộn (dung dịch chứa 16µg/ml tanshinon IIA) Dung dịch thử: Cân xác 0,20g cao đặc hỗn hợp vào bình nón nút mài Thêm xác 50ml methanol, cân Đun sơi hồi lưu cách thủy giờ, làm lạnh, cân lại, bổ sung phần khối lượng bị methanol, trộn lọc Cách tiến hành: Tiêm xác µl dung dịch chuẩn dung dịch thử vào cột sắc ký Dựa vào diện tích pic chuẩn thử, lượng cân độ pha lỗng chuẩn, thử tính hàm lượng tanshinon IIA có cao đặc hỗn hợp 2.5.2 Định lượng astraglosid IV theo phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: - Cột pha đảo C18 (150 x 4,6mm; 5µm) - Detector ELSD 2000 - Nhiệt độ detector: 1050C - Chương trình dung mơi : Thời gian Dung mơi A (Nước) Dung môi B (Acetonitril) (Phút) (%) (%) > 10 100 10 > 45 > 60 100 > 40 45 > 65 60 40 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút 84 - Thể tích tiêm: 20 µl - Tốc độ dòng khí nitơ: 2lít/phút Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 5,0 mg astragalosid IV chuẩn cho vào bình định mức 20ml, hòa tan methanol, thêm methanol tới vạch, lắc Dung dịch thử: Cân 2,0 g cao dược liệu, thêm 60 ml methanol, siêu âm 30 phút, lọc, cô dịch lọc đến khơ Hòa cắn 30ml dung dịch ammoniac 10% Để 10 phút, lắc Chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết với 30, 20, 20ml n- butanol bão hòa nước Tập trung dịch chiết n – butanol, cô cách thủy đến cạn Hòa cắn 5ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45µm Cách tiến hành: Tiêm xác 20 µl dung dịch chuẩn dung dịch thử vào hệ thống sắc ký Căn vào diện tích pic chiều cao pic dung dịch chuẩn dung dịch thử, độ pha loãng dung dịch thử dung dịch chuẩn lượng cân chất chuẩn để tính hàm lượng astragalosid IV 2.6 Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN IV (Phụ lục 13.6) 2.7 Giới hạn kim loại nặng - Dung dịch thử: Lấy khoảng 1,0g chế phẩm cho vào chén nung silica, thêm 4ml dung dịch magnesi sulphat 25% acid sulfuric1M, trộn đũa thủy tinh nhỏ, đun nóng cẩn thận Đốt để than hóa (khoảng 6000 C), tiếp tục đốt đến thu cắn màu xám nhạt, để nguội, làm ẩm cắn 0,2ml dung dịch acid sulfuric 1M, bốc đốt lại, sau để nguội Hòa tan cắn, dùng lượng, lượng 5ml dung dịch acid hydrocloric 2M Thêm 0,1ml dung dịch phenolphtalein, cho giọt dung dịch amoniac đậm đặc đến có màu hồng Để nguội, thêm acid acetic băng đến màu dung dịch, thêm 0,5ml nữa, lọc pha loãng dung dịch với nước thành 20ml Lấy 12 ml dung dịch thử theo phương pháp 3, phụ lục 9.4.8, DĐVN IV - Dung dịch chì mẫu 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chì mẫu 100 ppm cho vào chén nung silica, thêm 4ml dung dịch magnesi sulphat 25% acid sulfuric1M, sau tiếp tục xử lý dung dịch thử, câu:”trộn đũa thủy tinh nhỏ ” đến câu:”lọc pha loãng dung dịch với nước thành 20ml” 85 - Tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm giống hệt nhau: + Ống thử: 12ml dung dịch thử + Ống chuẩn: 10 ml dung dịch Pb 1ppm 2ml dung dịch thử + Ống trắng: 10 ml nước cất 2ml dung dịch thử Thêm vào ống: + 2ml dung dịch đệm acetat pH 3,5 + 1,2ml dung dịch Thioacetamid Lắc đều, để yên phút - Yêu cầu: Ống chuẩn có màu nâu nhạt so sánh với ống trắng Ống thử có màu nâu nhạt so với màu nâu ống chuẩn 86 ... đạt tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào quan trọng Đề tài "Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm " phần đề tài thực với mục tiêu. .. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Chế cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm 38 3.1.1 Bào chế cao đặc hỗn hợp 38 3.1.2 Xác định khối lượng làm khô hiệu suất cao 38 3.1.3 Xác... loại nặng cao 64 3.7 Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc hỗn hợp Hoàng kỳ Đan sâm 65 CHƯƠNG BÀN LUẬN 67 4.1 Đối tượng nghiên cứu 67 4.2 Phương pháp nghiên cứu