Nghiên cứu xác định một số đặc trưng hóa lý của chitosan dạng nano làm polymer mang thuốc

Tuy nhiên gần đây, chitosan nổi lên như một chất mang sinh học có nguồn gốc sinh học và có tính tương thích sinh học, đặc biệt có thể chế tạo chất mang này ở kích thước nano trong các ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠ

Nghiên cứu xác định một số đặc trưng hóa lý của chitosan dạng nano làm

polymer mang thuốc

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THƠ

Nghiên cứu xác định một số đặc trưng hóa

lý của chitosan dạng nano làm polymer

mang thuốc

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VÈ CHITOSAN 3

1.1.1.Nguồn gốc 3

1.1.2 Công thức hóa học 3

1.1.3 Tính chất của chitin/chitosan 3

1.1.4 Một số ứng dụng của chitosan 5

1.2 TỔNG QUAN HỆ THỐNG MANG THUỐC NANO CHITOSAN 5

1.2.1 Giới thiệu 5

1.2.2 Một số phương pháp tạo hệ mang thuốc nano chitosan 6

1.2.3 Các phương pháp đưa thuốc lên hệ mang thuốc nano 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ O-CARBOXYMETHYL CHITOSAN 11

1.3.1 Cấu trúc 11

1.3.2 Tổng hợp 12

1.3.3 Tính chất hóa lý 12

1.3.4 Đặc tính sinh học 14

1.3.5 Ứng dụng 15

1.4 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 15

1.4.1 Cấu trúc và tính chất 15

1.4.2 Sử dụng curcumin trong y học 16

1.5 Tổng quan về giải phóng thuốc có kiểm soát 19 1.5.1 Hệ giải phóng thuốc có kiểm soát 19 1.5.2 Cơ chế giải phóng thuốc có kiểm soát từ hệ polymer mang thuốc 20 1.5.3 Mô hình nghiên cứu động học giải phóng thuốc 20 1.5.4 Một số phương pháp đánh giá độ giải phóng thuốc 21 1.6 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM 22

1.6.1 Tổng quan về kính hiển vi điện tử quét 22

1.6.2 Tổng quan phương pháp đo thế zeta 25

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Phượng tiện nghiên cứu 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu 28

2.2.2 Lựa chọn điều kiện xác định kích thước hạt 29

2.2.3 Xác định trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin 29

2.2.4 Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR 29

2.2.5 Xây dựng phương pháp định lượng curcumin bằng HPLC 29

2.2.6 Đánh giá hiệu suất gắn thuốc 31

2.2.7 Khảo sát động học phân giải của curcumin trong 2 môi trường giả dịch tá tràng (pH 4,5) và dịch ruột (pH 6,8) 31

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 GẮN CURCUMIN LÊN O-CMC 33

3.2 XỬ LÝ MẪU 33

3.3 XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA O-CMC, CURCUMIN VÀ O-CMC GẮN CURCUMIN 35

3.3.1 Đo kích thước hạt 35

3.3.2 Xác định trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin 36

3.3.3 Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR 37

3.4 XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT GẮN THUỐC 38

3.4.1 Lựa chọn điều kiện chạy HPLC 40

3.4.2 Thẩm định phương pháp 41

3.4.3 Tiến hành định lương 45

3.5 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC PHÂN GIẢI TRONG 2 MÔI TRƯỜNG 46

3.5.1 Chuẩn bị mẫu và tiến hành 46

3.5.2 Kết quả 46

Chương 4 BÀN LUẬN 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

O-CMC: Oxy-carboxymethyl chitosan

DA: Deacetyl hóa

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

FT-IR: Quang phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 3.1 Đánh giá tính thích hợp hệ thống định lượng curcumin

Bảng 3.2 Kết quả đáp ứng diện tích pic theo nồng độ curcumin

Bảng 3.3 Kết quả định lượng 6 mẫu trong ngày

Bảng 3.4 Kết quả định lượng 6 mẫu khác ngày

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá thống kê độ chính xác của phương pháp phân tích Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Bảng 3.7 Kết quả định lượng curcumin tự do

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ giải phóng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan

Hình 1.2 Phức Ni(II)chitin và Ni(II)chitosan

Hình 1.3 Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa

Hình 1.4 Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt Hình 1.5 Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa

Hình 1.6 Phương pháp kết tinh muối

Hình 1.12 Sơ đồ khối kính hiển vi điện tử quét

Hình 1.13 Một số hình ảnh của phương pháp đo SEM

Hình 1.14 Sự xuất hiện thế zeta

Hình 3.1 Hình ảnh SEM của O-CMC gắn curcumin

Hình 3.2 Phổ FT-IR của O-CMC gắn curcumin

Hình 3.3 Sắc đồ mẫu trắng, placebo và thử

Hình 3.4 Phương trình hồi quy tuyến tính định lượng curcumin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ sản xuất thuốc dạng nano là một trong những công nghệ khá mới mẻ tại Việt Nam và chứa đựng nhiều tiềm năng Đi cùng với công nghệ bào chế hiện đại này, việc kiểm soát các chỉ tiêu kỹ thuật từ nguyên liệu đến sản phẩm cuối cùng trở nên rất quan trọng trong quá trình sản xuất

Chitosan {poly b-(1-4)-D-glucosamin} từ lâu đã được biết đến là một polymer

có nhiều tác dụng sinh học giúp cải thiện sức khỏe con người Tuy nhiên gần đây, chitosan nổi lên như một chất mang sinh học (có nguồn gốc sinh học và có tính tương thích sinh học), đặc biệt có thể chế tạo chất mang này ở kích thước nano trong các chế phẩm thuốc nano, làm cải biến sinh khả dụng của thuốc Chitosan được gắn lên các phân tử thuốc có thể giúp chúng dễ dàng qua được màng sinh học đến đích tác dụng hoặc làm làm thay đổi sinh khả dụng của thuốc (làm chậm, kéo dài hoặc khu trú nơi giải phóng dược chất) Trong sản xuất, chitosan được điều chế bằng cách deacetyl hóa một phần chitin Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên như vỏ tôm cua, nấm,

vi nấm, côn trùng, động vật

Như chúng ta đã biết, 2 hợp chất thiên nhiên được biết nhiều nhất trong điều trị

và hỗ trợ điều trị ung thư là taxon (chế phẩm Paclitaxel của Bristol-Myers Squibb, sáng chế 03/03/1992, U.S Patents) chiết từ cây thông đỏ và curcumin được chiết từ nghệ Gần đây tinh nghệ (gồm curcumin và các curcuminoid) đang được nghiên cứu trong điều trị ung thư Đã có trên một nghìn công trình nghiên cứu trên thế giới về curcumin đối với bệnh ung thư, cho kết quả rất khả quan Tuy vậy, curcumin là chất thực tế không tan trong nước và có sinh khả dụng rất kém, một số nghiên cứu gần đây gợi ý việc gắn curcumin lên chitosan có thể sẽ cải thiện sinh khả dụng của thuốc này

Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu xác định một số đặc trưng

hóa lý của chitosan dạng nano làm polymer mang thuốc, với 2 mục tiêu chính sau:

- Phân tích xác định một số đặc trưng hóa lý của o-carboxymethyl chitosan gắn curcumin

- Xây dựng phương pháp định lượng curcumin, từ đó xác định hiệu suất gắn curcumin

và khảo sát động học phân giải của o-carboxymethyl chitosan gắn curcumin, góp phần

nghiên cứu cải biến sinh khả dụng in vitro của curcumin

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN [5]

1.1.1 Nguồn gốc

Chitosan là sản phẩm đã đề acetyl hóa (DA) của chitin, một polymer tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương ngoài động vật chân đốt như tôm cua, côn trùng, lưỡi bào ở động vật thân mềm, và vòi của động vật chân đầu bao gồm mực và bạch tuộc Chitosan có độ DA >50% và thực tế là một polymer chitin/chitosan, mức độ đề acetyl hóa này có thể thay đổi và được xác định nhờ phương pháp cộng hưởng từ NMR Độ DA của chitosan dùng trong sản xuất thường từ 60-100%

phosphoric

Tính chất tích điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy Chitosan tăng vận chuyển các thuốc phân cực qua bề mặt biểu mô, có tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học

Chitosan có rất nhiều loại khối lượng phân tử và mức độ đề acetyl hóa khác nhau, đây là những yếu tố ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành và kết tập phân tử

- Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamin và nhóm –OH, -NH2 trong các mắt xích D-glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin, vừa là amid Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N

- Mặt khác chitin/chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glycozide; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: acid, base, tác nhân oxy-hóa và các enzym thuỷ phân

• Các phản ứng của nhóm -OH

-Dẫn xuất sulfat

-Dẫn xuất O-acyl cuả chitin/chitosan

-Dẫn xuất O–tosyl hoá chitin/chitosan

• Phản ứng ở vị trí N

-Phản ứng N-acetyl hoá chitosan

-Dẫn xuất N-sulfat chitosan

-Dẫn xuất N-glycochitosan (N-hydroxy-etylchitosan)

-Dẫn xuất acroleylen chitossan

-Dẫn xuất acroleylchitosan

1.1.4 Một số ứng dụng của chitosan

Chitosan là loại polymer không độc thân thiện với môi trường, có hoạt tính sinh học và có khả năng phân hủy sinh học, chống lại một số loại vi khuẩn và độ tương thích sinh học cao nên chitosan từ lâu đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: bảo quản thực phẩm, lọc nước, làm phân bón, mỹ phẩm …Và đặc biệt ngày nay chitosan đang được nghiên cứu ứng dụng rất rộng rãi trong dược học: làm thuốc điều trị vết thương, giảm cholesterol trong máu, giảm cân cho người béo, ức chế khối u và ung thư, làm tá dược trong thuốc viên, như một chất mang thuốc polymer để kiểm soát liều phân giải

Một hướng mới ứng dụng chitosan trong dược học làm chất mang thuốc có kích thước nano để mang các thuốc trị ung thư ít tan trong nước hoặc gắn các hệ gen nhạy cảm lĩnh vực này hứa hẹn có nhiều tiềm năng vì đồng thời làm tăng độ tan của các thuốc khó tan trong nước, kiểm soát được liều phân giải, và giảm lượng thuốc đưa vào trong điều trị

1.2 TỔNG QUAN HỆ THỐNG MANG THUỐC NANO CHITOSAN

1.2.1 Giới thiệu [18]

Hiệu quả của nhiều loại thuốc thường bị giới hạn bởi khả năng đến được đích

tác dụng của chúng Trong hầu hết trường hợp (đối với các dạng bào chế truyền thống), chỉ một phần nhỏ liều dùng tới được đích tác dụng, còn lại phần lớn thuốc được phân

bố khắp cơ thể tùy theo các đặc tính lý hóa và sinh hóa của thuốc Do đó, việc phát triển một hệ thống phân bố thuốc giúp tối ưu tác dụng điều trị, trong khi giảm các tác dụng phụ có hại là một nhiệm vụ không hề đơn giản

Một giải pháp là sử dụng các hệ mang thuốc dạng keo kết hợp khả năng vận chuyển thuốc tới đích tác dụng và khả năng giải phóng thuốc tối ưu Trong số đó, các

hệ liposome và hệ hạt nano/micro được nghiên cứu rộng rãi hơn cả Trong khi các liposome mang nhiều hạn chế về mặt kỹ thuật như khả năng tái sản xuất, độ ổn định và hiệu quả bẫy thuốc thấp, các hạt nano dạng polymer lại có khả năng tái sản xuất và độ

ổn định cao hơn

Các hạt nano là các hạt keo rắn có kích thước từ 10 nm đến 1000 nm Chúng bao gồm những vật liệu đại phân tử trong đó nhân tố chủ động (active principle) (sinh học hay dược phẩm) được hoà tan, bao vỏ, kết bám hay đính kèm vào hạt nano Các hạt nano này có đặc tính quý như độ bền cao, khả năng cho phép thay đổi các đặc tính

bề mặt của chúng một cách dễ dàng Về dược lực học, các hạt nano khi mang thuốc có khả năng xúc tiến sự tiếp xúc sinh học, do đó tăng cường hiệu quả của thuốc, hơn thế chúng còn khả năng thấm vào tế bào thông qua bộ phận tiếp nhận của tế bào hoặc đi vào các mô sau đó nhả thuốc vào đúng tế bào đích mà không cần các thiết bị truyền dẫn cồng kềnh

Nhìn chung, các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phân tử nano của chitosan bao gồm: kích cỡ hạt, điện tích bề mặt, khối lượng phân tử và mức độ đề acetyl hóa Hiệu quả mang thuốc phụ thuộc vào pKa và độ tan của thuốc được mang Thuốc được gắn với phân tử chitosan chủ yếu thông qua liên kết tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết

kỵ nước

1.2.2 Một số phương pháp tạo hệ mang thuốc nano chitosan [1], [4]

Dùng gossypol gây biến tính kỵ nước dẫn xuất glycol chitosan nhằm tạo nên các hạt có cấu trúc nano dạng mixell có cấu trúc lõi vỏ có khả năng mang các thuốc ít tan phân tán vào trong môi trường nước, gọi là các hạt GSG

Đó là các hạt có kích thước nano của thuốc được bao bọc bên ngoài bởi polymer phân huỷ sinh học chitosan Phương pháp chung điều chế các viên nang nano này dựa trên sự hoà tan của polymer và thuốc trong một dung môi thích hợp, và sự kết tủa của chúng khi thêm dung dịch này một dung môi không hoà tan polymer

Polymer được làm lắng trên mặt phân cách giữa pha dầu được phân tán với pha nước Viên nang dạng nano được điều chế theo phương pháp này có kích thước khoảng 200-

500 nm

Tripolyphosphat (TPP) tạo liên kết với chitosan và gây ra hiện tượng cắt mạch polymer để tạo thành các hạt nano

Chitosan có thể tan trong dung dịch acid loãng, nhưng không thể tạo mixell trong dung dịch Do đó, hướng giải quyết chủ yếu là tổng hợp các dẫn xuất của chitosan, rồi từ đó sử dụng để tạo các hệ mixell polymer làm chất mang thuốc Qua tham khảo một số tài liệu, có một số dẫn xuất của chitosan đã được tổng hợp ví dụ như: Carboxymethyl chitosan, N-octyl-O-sulfate chitosan, N-mPEG-N-octyl chitosan,

Nano bạc được tổng hợp bằng phương háp khử hóa, trong đó chitosan đóng vai trò chất khử và chất ổn định Tiến hành: Khử hóa Ag+ trong môi trường chitosan được acid hóa (pH 3-4, không có chất khử nào khác), chitosan là chất khử, quá trình khử Ag+

đi đôi với oxi hóa nhóm hydroxyd của chitosan và/hoặc thủy phân chitosan Khả năng khử của chitosan phụ thuộc nồng độ và nhiệt độ phản ứng

1.2.3 Các phương pháp đưa thuốc lên hệ mang thuốc nano [9]

1.2.3.1 Polymer hóa monomer

- Polymer hóa nhũ tương: Gồm 2 phương pháp

Phương pháp 1: Phân tán monomer vào trong một nhũ tương hoặc vi nhũ tương nghịch đảo, hoặc một nguyên liệu (không dung môi) nào đó mà monomer không tan Quá trình kết tập trong giai đoạn đầu của polymer hóa được ngăn chặn nhờ thêm vào các chất hoạt động bề mặt Phương pháp này hiện ít dùng do dung môi độc, phải thêm các chất hoạt động bề mặt

Phương pháp 2: Monomer được hòa tan vào một dung dịch mà không cần chất hoạt động bề mặt hay chất tạo nhũ tương Thay vào đó, các phân tử khởi đầu cho quá trình polymer này có thể là một ion hoặc một gốc tự do Ngoài ra, phân tử monomer có thể được chuyển thành gốc nhờ tia xạ năng lượng cao như tia γ, tia tử ngoại hoặc ánh sáng khả kiến mạnh Theo cách này, chuỗi polymer được hình thành khi gốc hoặc ion monomer va chạm với phân tử monomer theo cơ chế polymer hóa anionic Việc tách pha và hình thành các phân tử rắn có thể xảy ra trước hoặc sau khi kết thúc phản ứng polymer hóa

Trong 2 phương pháp này, thuốc được phân tán vào môi trường polymer hóa nhờ đó được đưa lên hệ mang thuốc nano

- Polymer hóa ở bề mặt phân cách:

Monomer và thuốc được hòa tan trong một hỗn hợp gồm dầu và ethanol tuyệt đối Sau đó nén chậm hỗn hợp qua một ống vào một dung dịch lỏng được khuấy kỹ, có thể cho thêm hoặc không cho thêm một ít ethanol hoặc aceton chứa chất hoạt động bề mặt Phân tử nano mang thuốc được hình thành ngẫu nhiên do quá trình polymer hóa monomer sau khi tiếp xúc với các ion khởi đầu có mặt trong dung dịch Hỗn dịch keo này có thể được cô đặc bằng cách bốc hơi chân không

Ưu điểm của phương pháp là nhanh và hiệu quả bẫy thuốc cao Nhược điểm là

sử dụng dung môi hữu cơ độc, tốn thời gian và khó làm

Các thuốc sử dụng phương pháp này như insulin, calcitonin,…

1.2.3.2 Tạo phân tử nano từ polymer có sẵn

Nhược điểm của phương pháp polymer hóa monomer là có thể tạo ra các polymer chậm phân hủy hoặc không có khả năng phân hủy sinh học, tồn lưu các chất hoạt động bề mặt, monomer,… đòi hỏi phải loại bỏ Do vậy, phương pháp dùng polymer có sẵn ra đời

- Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa:

Polymer và thuốc được phân tán vào một dung môi không đồng tan với nước, sau đó hỗn hợp này được phân tán thành các vi giọt nhờ một chất phân tán và máy khuấy trộn năng lượng cao, trong môi trường hỗn dịch hoặc dung môi như chloroform, ethyl acetate Các polymer kết tủa lại dạng nano và thuốc được phân tán đều vào mạng lưới matrix của polymer đó Cuối cùng dung môi được bốc hơi bằng nhiệt độ cao ở áp lực lớn hoặc tiếp tục khuấy Kích thước hạt nano phụ thuộc vào tốc độ khuấy, chất phân tán, độ nhớt pha hữu cơ – pha nước và nhiệt độ

Hình 1.2 Bốc hơi dung môi-nhũ tương hóa

- Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt:

Hai phương pháp này tương tự nhau, khác nhau là phương pháp dịch chuyển dung môi có thể tạo ra siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules), còn phương pháp kết tủa bề mặt chỉ tạo ra siêu vi nang

Thuốc và polymer được hòa vào một dung môi hữu cơ, sau đó hỗn hợp được nhũ tương hóa vào pha lỏng tạo nên hiện tượng kết tủa các phân tử nano Có thể sử dụng hay không sử dụng chất hoạt động bề mặt

Hình 1.3 Phương pháp chuyển dịch dung môi và kết tủa bề mặt

- Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa:

Trong phương pháp này, polymer được hòa tan trong một dung môi tan trong nước một phần như propylene carbonate và bão hòa với nước để đạt cân bằng nhiệt động ban đầu ở cả hai chất lỏng (nhằm kết tủa polymer và hình thành hạt nano, cần phải thúc đẩy qua trình khuếch tán dung môi pha phân tán bằng cách pha loãng với lượng thừa nước nếu dung môi hữu cơ pha phân tán tan trong nước một phần hoặc với một dung môi hữu cơ khác trong trường hợp ngược lại) Sau đó, pha dung môi bão hòa polymer-nước này được nhũ tương hóa trong một dung dịch lỏng chứa chất ổn định, làm cho dung môi khuếch tán vào pha ngoại hình thành các siêu cầu hoặc siêu vi nang, tùy theo tỷ lệ dầu/polymer Cuối cùng dung môi được loại bỏ bằng cách bốc hơi hoặc lọc, tùy theo điểm sôi

Hình 1.4 Khuếch tán dung môi – nhũ tương hóa

Ưu điểm phương pháp này là hiệu quả bẫy thuốc cao (thường >70%), không cần khuấy trộn, có thể sản suất quy mô lớn, đơn giản, phân bố kích thước hạt trong khoảng hẹp Nhược điểm là trong quá trình nhũ tương hóa, một lượng lớn nước bị loại khỏi

hỗn dịch và rò rỉ thuốc tan trong nước theo pha ngoại lỏng bão hòa, dẫn đến giảm hiệu suất

- Phương pháp kết tinh muối:

Cơ sở của phương pháp là tách dung môi tan trong nước khỏi dung dịch lỏng thông qua hiệu ứng kết tinh muối Ban đầu polymer và thuốc được hòa tan trong một dung môi chẳng hạn aceton, sau đó được nhũ tương hóa vào một gel lỏng có chứa chất tạo kết tinh (chất điện phân như muối calci, magnesi, hoặc chất không điện phân như sacarose) và một chất ổn định keo như polyvinylpyrrolidon hoặc hydroxyethylcel-lulose Nhũ tương dầu/nước này được pha loãng với một lượng nước hoặc dịch lỏng để tăng khuếch tán aceton vào pha lỏng, hình thành nên các siêu vi cầu

Hình 1.5 Phương pháp kết tinh muối

Ưu điểm của phương pháp là giảm thiểu áp lực với các chất bẫy thuốc bản chất protein và không yêu cầu nhiệt độ cao nên phù hợp với các thuốc nhạy cảm với nhiệt

độ Nhược điểm là chỉ áp dụng với các thuốc thân dầu và kéo dài thêm quy trình rửa phân tử nano

1.3 TỔNG QUAN VỀ O-CARBOXYMETHYL CHITOSAN (O-CMC) [17]

1.3.1 Cấu trúc

Hình 1.6 O - Carboxymethyl chitosan

1.3.2 Tổng hợp

Chitosan được ngâm vào dung dịch kiềm ở nhiệt độ từ 0-30oC trong khoảng thời gian

từ 2 – 24 giờ để hoạt hóa chitosan Nồng độ chitosan sử dụng thường từ 4% - 20% (khối lượng/thể tích) và dung dịch kiềm là NaOH 40 – 50% (khối lượng/thể tích) Sau khi hoạt hóa chitosan, cho chitosan phản ứng với acid monochloroacetic pha trong isopropanol hoặc ethanol với tỷ lệ acid/dung môi là 1:4 (theo khối lượng) Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng aceton hoặc ethanol và khử muối bằng cách điều chỉnh pH hoặc thẩm phân

Có nghiên cứu cho rằng khả năng lưu giữ, hấp thụ ẩm của CMC có lien quan tới cấu trúc polymer của chất này

Khả năng lưu giữ ẩm được tính bằng phần trăm lượng nước còn lại của mẫu ẩm được chuẩn bị bằng cách thêm 10% nước vào mẫu đã được làm khô trước với P2O5

trong bình hút ẩm trong 24 giờ:

Rh (%) = 100 x (Hn/Ho) Trong đó, Ho và Hn là khối lượng nước trong mẫu trước và sau khi đặt mẫu trong bình hút ẩm chứa K2CO3 bão hòa (độ ẩm tương đối 43%) và silicagel ở 20oC trong 48 giờ

Khả năng hấp thụ ẩm Ra được tính bằng phần trăm độ tăng khối lượng mẫu đã được làm khô trước với P2O5 trong bình hút ẩm trong 24 giờ:

Ra (%) = 100 x (Wn – Wo)/Wo

Trong đó, Wo và Wn là khối lượng mẫu trước và sau khi đặt vào bình hút ẩm chứa (NH4)2SO4 bão hòa (độ ẩm tương đối 81%) và bình hút ẩm chứa bão hòa (độ ẩm tương đối 43%) ở 20oC trong 48 giờ

Khả năng giữ và hấp thụ ẩm của CMC có liên quan đến cấu trúc và trọng lượng phân tử Nhóm 6-carboxymethyl giữ vai trò chính cho khả năng này Trọng lượng phân

tử càng cao, khả năng giữ ẩm càng tốt

CMC có khả năng hấp thụ tốt là do:

- Độ thân nước cao do chứa nhiều nhóm hydroxyl

- Nhiếu nhóm amin bậc 1 giữ vai trò làm nơi hấp thụ

- Cấu trúc chuỗi polymer linh hoạt giúp tạo cấu hình phù hợp để tạo phức với ion kim loại

Các nguyên tử N của CMC có chứa các cặp electron tự do có thể kết hợp với cation kim loại và hấp thụ chúng theo cơ chế tạo phức Tuy nhiên các nhóm amin này

dễ dàng bị proton hóa trong môi trường acid, tạo lực hút tĩnh điện với các anion, gồm

các anion kim loại (CrO2-4, SeO-4, VO3-4, SO2-4, MoO-4, HAsO-4,…)

1.3.4 Đặc tính sinh học

Nguyên cứu chỉ ra rằng việc gắn chitosan vào thành phần proteoglycan dường như sẽ làm thay đổi hình thái, sinh sản và biệt hóa tế bào CMC vẫn giữ nguyên đặc tính này của chitosan

Chitosan được sử dụng trong kỹ thuật mô dưới dạng một matrix tổng hợp ngoài

tế bào, phát tín hiệu tới tế bào và điểu khiển sự tăng trưởng mô mới Điều này đòi hỏi tốc độ phân hủy của chitosan phải phù hợp với tốc độ hình thành mô mới Tuy nhiên tốc độ phân hủy thường là chậm và khó kiểm soát, do nó diễn ra theo quá trình hòa tan chậm không thể đoán trước, chủ yếu do chitosan khó tan trong pH sinh lý Nhược điểm này có thể khắc phục được nhờ carboxymethyl hóa Tốc độ phân hủy của CMC liên kết ngang đồng hóa trị có thể được kiểm soát tốt hơn nhờ sự phân bố trọng lượng của CMC (thay đổi tỷ lệ trọng lượng phân tử cao hay thấp)

1.3.4.2 Chống oxi hóa

Các nhóm hydroxyl và amin hoạt hóa của CMC có thể tham gia dọn dẹp các gốc

tự do nhờ đó có tác dụng chống oxi hóa Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng này của CMC là thành phần các nhóm hydroxyl, amin, amid trong chuỗi và trọng lượng phân

tử

Chitosan có tác dụng ức chế một lượng lớn vi khuẩn và nấm theo nhiều cơ chế khác nhau Chẳng hạn, cation của chitosan gắn vào ADN làm ức chế tổng hợp ARN,… Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình này gồm trọng lượng phân tử, mức độ deacetyl hóa, nồng độ dung dịch và pH môi trường CMC bảo toàn đặc tính này của chitosan

1.3.4.4 Ức chế quá trình tự hoại tử tế bào

CMC can thiệp vào quá trình tự hoại tử tế bào có thể bắt đầu bằng việc tương tác với màng tế bào, có thể là bảo vệ chức năng của ty thể, giảm nồng độ nitric oxid và

các nhóm oxy hoạt tính

1.3.5 Ứng dụng

CMC được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học nhờ khả năng tự phân giải và không có độc tính

Nhờ vào đặc tính độ tan và độ kết tập, CMC được dùng làm chất mang giúp tăng độ tan và giải phóng có kiểm soát một số thuốc

CMC trương nở ở pH < 2 và từ 4 – 13, ở pH từ 2 – 4, CMC mất trương nở Lý

do cho điều này nằm ở các nhóm –NH2 và –COOH có thể ion hóa thành các nhóm tích điện dương hay âm tùy theo pH môi trường, do đó làm thay đổi trạng thái tích điện của phân tử Sự thay đổi độ trương nở này sẽ ảnh hưởng lên quá trình giải phóng thuốc

CMC có khả năng tương tác mạnh mẽ với DPPC, một thành phần quan trọng của màng sinh học, do đó CMC còn được ứng dụng trong vận chuyển gen

Các phân tử nano CMC được dùng làm chất mang đưa thuốc tới đích tác dụng

1.3.5.4 Tăng tính thấm

Chitosan làm tăng tính thấm của niêm mạc ruột, mũi, miệng, biểu mô trước giác mạc bằng cách mở các khớp nối chặt chẽ giữa các tế bào, do vậy nó thường ứng dụng cho vận chuyển thuốc cận bào Trên phân tử CMC, một số phần monomer của chitosan vẫn duy trì cấu trúc proton hóa, do vậy vẫn giữ được tác dụng tăng tính thấm của chitosan

Dùng trong hóa mỹ phẩm (do giữ ẩm), làm màng bao,…

1.4 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

1.4.1 Cấu trúc và tính chất

<=>

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của Curcumin dạng ceton và enol

Cảm quan Bột màu vàng nghệ, thực tế không tan trong nước và trong ether IUPAC (1E,6E)-1,7-bis heptadiene-3,5-dione (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1,6- Tên khác Curcumin, diferuloylmethan; C.I.75300; Natural Yellow 3 Công thức phân tử C21H20O6

Phân tử gam 368,38 g/mol

Điểm nóng chảy 183 °C (361 K)

Curcumin có thể tồn tại ít nhất ở 2 dạng đồng phân là ceton và enol Cấu trúc dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch [12] Các hệ thống vòng thơm, là các polyphenol được nối bởi 2 nhóm cacbonyl α,β-chưa bão hòa Hai nhóm cacbonyl tạo thành diceton Diceton tạo thành các enol ổn định hay dễ dàng khử proton và tạo thành các enolat, trong khi cacbonyl α,β-chưa bão hòa là tác nhân nhận hydro tốt và có phản ứng cộng ái lực hạt nhân Cấu trúc của curcumin được xác định lần đầu tiên vào năm 1910 (Kazimierz Kostanecki, J Miłobędzka and Wiktor Lampe)

1.4.2 Sử dụng curcumin trong y học

Củ nghệ bắt đầu được sử dụng trong y học Ayurveda tại Ấn Độ từ khoảng năm

1900 TCN để chữa trị một loạt các loại bệnh tật Nghiên cứu của các nhà khoa học vào cuối thế kỷ 20 đã xác định curcumin đóng vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh

học của củ nghệ [6] Dựa trên những nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và trên

động vật, các nhà khoa học đưa ra giả thuyết khả năng chữa bệnh hoặc ngăn ngừa bệnh của curcumin Hiện tại, các tác động này chưa được xác nhận trên người Tuy nhiên, cho tới năm 2008, rất nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đang được thử nghiệm để nghiên cứu về tác dụng của curcumin trong việc điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer [11]

Theo nghiên cứu cũng cho thấy curcumin có tính chất chống ung thư [7], [10], chống ôxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ [14] và kháng viêm[15] Khả năng kháng viêm có thể là do sự ngăn chặn tổng hợp sinh học của eicosanoit [16]

Curcumin làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới Curcumin giúp cơ thể phòng ngừa và chống ung thư Curcumin là một chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV

Rất nhiều bằng chứng cho thấy curcumin phát triển chức năng tinh thần, một điều tra trên 1010 người châu Á ăn bột cari vàng ở độ tuổi 60-93 cho thấy những người

ăn ít nhất 1 lần trong 6 tháng cho kết quả MMSE cao hơn so với những người không

ăn Theo quan điểm của các nhà khoa học, và một con số rất lớn các nghiên cứu cho thấy curcumin có tác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm, trạng thái lo

âu

Tác dụng chống ung thư

Khả năng chống ung thư do Curcumin làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh Curcumin can thiệp vào hoạt động sao chép của NF-κB là liên kết các bệnh viêm như ung thư Một nghiên cứu về tác dụng của Curcumin đối với ung thư năm 2009 cho thấy Curcumin điều chỉnh sự phát triển của các tế bào u, bướu thông qua quá trình phân chia thường xuyên của tế bào

Những nghiên cứu về curcumin bước đầu đã cho thấy:

* Curcumin ngăn các các tế bào ung thư đi vào pha S (pha tổng hợp của chu kỳ

tế bào)

* Curcumin thúc đẩy các tế bào ung thư đi vào chết tế bào theo chương trình

* Curcumin là chất ức chế tạo mạch máu mới mạnh

* Curcumin làm hạ cholesterol huyết và chống bệnh Alzheimer (mất trí nhớ ở

người già)

Nghiên cứu cũng cho thấy cũng tại Ấn độ, những vùng dân ăn nhiều cary có tỷ

lệ người mắc bệnh Alzheimer rất thấp

Nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm ở các nước trên thế giới đã khẳng định

từ lâu rằng hoạt chất Curcumin có tác dụng huỷ diệt tế bào ung thư vào loại mạnh Tại

Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng Curcumin điều trị ung thư và kết luận: Curcumin có thể kìm hãm sự phát tác của tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang Curcumin còn là chất bổ cho dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương, chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn

có hiệu lực Từ nǎm 1993, các nhà khoa học thuộc ĐH Harvarrd (Mỹ) đã công bố 3 chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và 1 trong 3 chất đó là Curcumin

Sinh khả dụng của curcumin

Một phần rất nhỏ curcumin được hấp thụ sau khi ăn Curcumin không bền vững trong ruột và một lượng rất nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái hóa hoặc liên hợp thành glucuronidation

Nghiên cứu của Shoba G., Joy D., Joseph T và các cộng sự tại khoa Dược, đại học Y St John, Bangalore, Ấn Độ đã cho thấy, hoạt chất piperine chiết xuất từ hạt tiêu đen có tác dụng tăng hấp thu và giảm đào thải của Curcumin trong máu lên rõ rệt Một nghiên cứu của nhóm này được đăng tải trên tạp chí Pubmed của Thư viện y khoa quốc gia và Viện Sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ tháng 5 năm 1998 đã chứng minh được sinh khả dụng của curcumin trên cơ thể người khi được kết hợp với piperine từ hạt tiêu theo

tỷ lệ 1% đã tăng lên tới 2000% so với không dùng piperine [19] Tác dụng này của

piperine lên Curcumin đã được sử dụng để tạo ra dạng Super Curcumin – 1% khối lượng piperine trong Curcumin, với mức độ hấp thụ vượt trội của Curcumin khi đưa vào cơ thể Tại Việt Nam, có rất nhiều các sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm sử dụng curcumin là thành phần chính Tuy nhiên, việc ứng dụng hoạt chất piperine để tăng hấp thụ và giảm đào thải của Curcumin còn khá mới mẻ Tại Việt Nam đã ra đời một vài sản phẩm ứng dụng nghiên cứu này, khai thác sinh khả dụng cao của Super Curcumin trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh Một vài tính chất có lợi của curmin như có khả năng ngăn ngừa ung thư kết tràng có thể không cần sự hấp thụ của cơ thể Hòa tan Curcumin trong nước nóng hoặc dầu ấm sẽ có khả năng làm giảm

độ sinh khả dụng của curcumin Tuy vậy, nấu ăn có sử dụng curcumin và dầu, mỡ có thể làm tăng sự hấp thụ của curcumin

1.5 TỔNG QUAN VỀ GIẢI PHÓNG THUỐC CÓ KIỂM SOÁT

1.5.1 Hệ giải phóng thuốc có kiểm soát [20]

Trong những thập kỷ gần đây, nhiều hệ giải phóng thuốc có kiểm soát đã ra đời với mục đích cải thiện sinh khả dụng của thuốc Những hệ mang thuốc này chứa đựng rất nhiều ưu điểm so với dạng thuốc truyền thống như cải thiện hiệu quả, giảm độc tính của thuốc, cải thiện dạng dùng mang tới sự thoải mái cho bệnh nhân Nhìn chung, giải phóng thuốc có kiểm soát được chia thành hai loại: giải phóng thuốc theo thời gian và giải phóng thuốc khu trú

- Giải phóng thuốc theo thời gian: Mục đích của hệ giải phóng thuốc này là nhằm kéo dài thời gian giải phóng hoặc giải phóng thuốc tại một thời điểm nhất định trong quá trình điều trị Hệ này đặc biệt có lợi đối với những thuốc bị chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ thể sau khi dùng

- Giải phóng thuốc khu trú: Thuốc được giải phóng đến đích tác dụng do đó tăng hiệu quả điều trị và giảm tác dụng không mong muốn, có lợi với những thuốc gây tác dụng phụ khi phân bố tới các phần khác của cơ thể và khi thuốc không đạt được nồng độ điều trị tại đích tác dụng thông qua phân bố thuốc tự nhiên

1.5.2 Cơ chế giải phóng thuốc có kiểm soát từ hệ polymer mang thuốc

Động học giải phóng thuốc có thể được quyết định bởi nhiều yếu tố như độ trương nở polymer, độ ăn mòn, đặc tính hòa tan/khuếch tán, phân bố thuốc bên trong matrix, tỷ lệ thuốc/polymer và hình dạng hệ mang thuốc (hình trụ, hình cầu, ) Trong điều kiện khô ráo, thuốc bên trong matrix tồn tại ở dạng vi tinh thể, tinh thể nano hoặc vô định hình, không thể khuếch tán qua matrix được Chỉ khi các hệ này được tiếp xúc với dung dịch giải phóng (nước hay dịch sinh học), polymer mới trương nở và quá trình hòa tan giải phóng mới xảy ra [21]

Nhìn chung, polymer được chia thành hai loại: polymer không có khả năng phân hủy sinh học và polymer có khả năng phân hủy sinh học Trong đó polymer có khả năng phân hủy sinh học thu hút được nhiều sự chú ý trong việc sử dụng làm hệ mang thuốc, bởi vì các polymer không phân hủy sinh học cần được thu hồi và mất thêm công đoạn khi đưa vào cơ thể

Thuốc được giải phóng từ hệ polymer phân hủy sinh học theo hai cơ chế: ăn mòn bề mặt và ăn mòn khối:

- Ăn mòn bề mặt xuất hiện khi tốc độ ăn mòn vượt quá tốc độ thấm nước vào khối polymer Đây được xem là cơ chế mong muốn trong giải phóng thuốc Trong ăn mòn

bề mặt lý tưởng, tốc độ ăn mòn tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt Do đó ăn mòn bề mặt

có thể tạo ra quá trình giải phóng thuốc zero-order, nghĩa là thuốc giải phóng không phụ thuộc vào nồng độ thuốc còn lại

- Ăn mòn khối xuất hiện khi các phân tử nước có thể thấm vào khối polymer ở tốc độ nhanh hơn ăn mòn Kết quả là các phân tử polymer trong khối bị thủy phân và động học phân giải/ăn mòn của polymer trở nên phức tạp hơn so với ăn mòn bề mặt [20]

1.5.3 Mô hình nghiên cứu động học giải phóng thuốc

Đây là những mô hình toán học nhằm nghiên cứu động học giải phóng thuốc từ hệ mang thuốc Có một vài mô hình mô tả đầy đủ động học giải phóng thuốc Do những thay đổi định tính, định lượng trong công thức có thể làm thay đổi quá trình giải phóng

in-vivo nên việc phát triển những công cụ có thể giảm bớt đòi hỏi khảo sát sinh học trong nghiên cứu bào chế là rất quan trọng Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng

dữ liệu nghiên cứu in-vitro để đoán trước quá trình in-vivo, nhìn chung được chia thành 3 phương pháp sau:

- Phương pháp thống kê (phân tích dữ liệu thăm dò, thiết kế đánh giá lăp lại, tiếp cận

đa biến (MANOVA)

- Phương pháp phụ thuộc mô hình (zero-oder, first-order, mô hình Higuchi, Korsmeyer-Peppas, Hixson Crowell, Baker-Lonsdale, Weibull,…)

- Phương pháp không phụ thuộc mô hình (dựa vào yếu tố khác biệt và yếu tố tương tự) [20]

1.5.4 Một số phương pháp đánh giá độ giải phóng thuốc

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Nhìn chung, các phân tử gắn thuốc được đưa vào bình chứa có chứa môi trường khảo sát, thuốc giải phóng được định lượng theo thời gian Môi trường khảo sát được lựa chọn tùy thuộc vào đặc tính của mẫu, có thể điều chỉnh những thông số như kích cỡ bình chứa, loại, mức độ và kiểu lắc, rung và phương pháp lấy mẫu

- Kích cỡ bình chứa: Được lựa chọn tùy thuộc vào thể tích môi trường giải phóng nhằm duy trì mẫu chìm mà không ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp phân tích Chẳng hạn, các ống hay lọ nhỏ được dùng khi thể tích môi trường <10ml, và dùng chai, lọ to, bình khi thể tích lớn hơn (100-400ml)

- Loại, mức độ và kiểu lắc, rung: Dùng cánh khuấy, dụng cụ khuấy, lắc kiểu cổ tay, lắc cách thủy, lắc từ đầu nọ sang đầu kia hoặc khuấy trộn tốc độ cao Trong một số trường hợp, môi trường được duy trì ổn định ở 37oC

- Phương pháp lấy mẫu: Mẫu được lấy đem định lượng sau các khoảng thời gian bằng cách tách các hạt rắn khỏi môi trường thông qua lọc hoặc ly tâm

Ưu điểm của phương pháp này là đánh giá trực tiếp và khá chính xác độ giải phóng vitro, nhược điểm là các tiểu phân có thể kết tập làm giảm tốc độ giải phóng (được khắc phục bằng thêm chất ổn định và/hoặc rung lắc), thời gian lâu,…

Nhìn chung, môi trường giải phóng được lưu thông qua một cột chứa phân tử gắn thuốc, thuốc giải phóng được định lượng theo thời gian Môi trường khảo sát được lựa chọn tùy thuộc vào đặc tính của mẫu Các yếu tố được thiết lập trong phương pháp này bao gồm bơm, tốc độ dòng và các thông số khác Phương pháp này được dùng cho các thuốc dùng ngoài đường tiêu hóa

Ưu điểm của phương pháp là mô phỏng gần giống môi trường in-vivo, lấy mẫy dễ dàng, tiến trình tự động, nhược điểm là do các polymer phân hủy gây tắc màng lọc do

đó phải điều chỉnh tốc độ nhiều lần, việc thay thế dung môi nhanh khó thực hiện được

Trong phương pháp thẩm tách, các phân tử gắn thuốc được tách ra khỏi môi trường bằng màng thẩm tách, và thuốc giải phóng được định lượng từ khối môi trường bên ngoài theo thời gian Môi trường khảo sát được lựa chọn tùy thuộc vào đặc tính của mẫu Phương pháp thường được áp dụng cho các thuốc dạng dung dịch dầu không dùng đường uống và viên đặt, thuốc tiêm chứa hoạt chất kém tan trong nước và các liposome Gần đây, kỹ thuật này còn được dùng nghiên cứu độ giải phóng cho các chế phẩm tại chỗ, hỗn dịch uống, nhũ tương hạt siêu nhỏ, và dạng dùng qua mũi Ngoài ra

có thể dùng để phân tích các thuốc dạng nano, dạng cấy ghép và dạng mixen Ưu điểm của phương pháp là dễ lấy mẫu và thay thế môi trường, nhược điểm là khó đoán trước quá trình trên in-vivo và khó khăn trong quá trình lắp đặt, xử lý các túi thẩm tách và màng thẩm tách [22]

1.6 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

1.6.1 Tổng quan về kính hiển vi điện tử quét [2]

1.6.1.1 Khái niệm

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, thường viết tắt là

SEM), là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật

Hình 1.9 Sơ đồ khối kính hiển vi điện tử quét 1.6.1.2 Cấu tạo

Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được cấu tạo từ một số khối chức năng khác nhau (hình 1.6) gồm:

- Hệ thống quang điện dùng để hội tụ và điều khiển chùm tia điện tử: bao gồm súng điện tử, hệ thống thấu kính hội tụ, cuộn dây quét

- Buồng mẫu: là nơi đặt mẫu, các đầu dò điện tử, đầu dò tia X và được duy trì ở chế độ chân không

- Các đầu dò: dùng để thu ghi các loại bức xạ Các tín hiệu thu được này sẽ được

xử lý tiếp qua hệ thống các mạch điện tử để hiển thị thành ảnh

- Hệ thống chân không

Kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát các vật nhỏ, do

đó độ phân giải của kính hiển vi quang học bị giới hạn bởi bước sóng ánh sáng khả kiến và không thể cho phép nhìn thấy các vật có kích thước nhỏ hơn Bước sóng của điện tử nhỏ hơn rất nhiều so với bước sóng ánh sáng khả kiến nên việc sử dụng sóng điện tử thay cho sóng ánh sáng sẽ tạo ra thiết bị có độ phân giải tốt hơn nhiều kính hiển

vi quang học

Đối tượng sử dụng của SEM là chùm điện tử, điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử Có hai cách để tạo ra chùm điện tử: Sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử hoặc sử dụng súng phát xạ trường Sau khi thoát ra khỏi catốt, điện tử di truyển đến anốt rỗng và được tăng tốc dưới thế tăng tốc Thế tăng tốc của SEM thường chỉ từ 10

kV đến 50 kV Điện tử được phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này Các bức xạ chủ yếu gồm:

- Điện tử thứ cấp (Secondary electrons): Đây là chế độ ghi ảnh thông dụng nhất của kính hiển vi điện tử quét, chùm điện tử thứ cấp có năng lượng thấp (thường nhỏ hơn 50 eV) được ghi nhận bằng ống nhân quang nhấp nháy Vì chúng có năng lượng thấp nên chủ yếu là các điện tử phát ra từ bề mặt mẫu với độ sâu chỉ vài nanomet, do vậy chúng tạo ra ảnh hai chiều của bề mặt mẫu

- Điện tử tán xạ ngược (Backscattered electrons): Điện tử tán xạ ngược là chùm điện tử ban đầu khi tương tác với bề mặt mẫu bị bật ngược trở lại, do đó chúng thường

có năng lượng cao Sự tán xạ này phụ thuộc rất nhiều vào vào thành phần hóa học ở bề

mặt mẫu, do đó ảnh điện tử tán xạ ngược rất hữu ích cho phân tích về độ tương phản thành phần hóa học Ngoài ra, điện tử tán xạ ngược có thể dùng để ghi nhận ảnh nhiễu

xạ điện tử tán xạ ngược, giúp cho việc phân tích cấu trúc tinh thể (chế độ phân cực điện tử)

a) b)

Hình 1.10 Một số hình ảnh của phương pháp đo SEM

a) Các tinh thể ZnO b) Các hạt SiO 2

1.6.1.4 Ưu điểm

- Phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp

- Các thao tác điều khiển đơn giản, dễ sử dụng

- Giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với thiết bị cũng đo kích thước tiểu phân như TEM

1.6.2 Tổng quan phương pháp đo thế zeta [13]

1.6.2.1 Sự xuất hiện thế zeta

Khi cho phân tử rắn tiếp xúc với chất lỏng thì giữa bề mặt hai pha lỏng-rắn có

sự phân bố lại điện tích giữa các pha Trên bề mặt phân cách pha sẽ tạo nên một lớp điện tích kép (Electrical double layer) Hay nói cách khác, xung quanh phân tử rắn này

sẽ tồn tại một lớp điện tích kép

Lớp chất lỏng xung quanh phân tử chia thành hai phần:

- Khu vực bên trong (gọi là Stern layer), nơi các ion bám chặt

- Khu vực khuếch tán bên ngoài (Diffuse layer), nơi các ion này gắn kết lỏng lẻo hơn Bên trong lớp khuếch tán có một ranh giới lý thuyết mà trong đó các ion và phân

tử hình thành trạng thái ổn định Khi phân tử di chuyển (chẳng hạn do trọng lực), các ion bên trong ranh giới đó di chuyển theo, trong khi các ion bên ngoài ranh giới đó không di chuyển theo phân tử Ranh giới này được gọi là dịch chuyển thủy động lực học (slipping plane) Điện thế xuất hiện tại ranh giới này được gọi là Thế zeta (zeta potential)

Hình 1.11 Sự xuất hiện thế zeta

Thế zeta cho biết độ ổn định của một hệ keo (rắn trong lỏng, lỏng trong lỏng,…) Thế zeta càng lớn thì các phân tử càng có xu hướng đẩy nhau và không kết tụ lại, hệ keo sẽ bền vững Khi phân tử có thế zeta > +30 mV hoặc < -30 mV thì được coi

là ổn định, và ngược lại Thế zeta của một phân tử là toàn bộ điện tích mà phân tử đó

có được trong một môi trường nào đó

Yếu tố ảnh hưởng lớn nhất tới thế zeta là pH Chẳng hạn một phân tử trong hỗn dịch có thế zeta âm, nếu cho thêm kiềm vào, phân tử sẽ có thế zeta âm hơn, nếu thêm

acid, đến một lúc nào đó thế âm sẽ bị trung hòa rồi chuyển sang dương Điểm mà thế zeta bằng 0 gọi là điểm đẳng điện, đó là khi hệ keo kém ổn định nhất

1.6.2.3 Nguyên tắc đo thế zeta

Dựa trên đo linh độ điện di (Electrophoretic Mobility), sau đó tính toán theo công thức Henry:

: Hàm Henry, nhận hai giá trị xấp xỉ là 1,5 hoặc 1

Đo linh độ điện di: Dùng một pin gồm 2 điện cực ở 2 đầu, mỗi đầu đặt một điện thế Các phân tử di chuyển tới điện cực có điện tích ngược với chúng, khi đó tốc độ của chúng sẽ được đo và biểu diễn dưới dạng linh độ (µep):

Trong đó, là tốc độ đo được, là cường độ điện trường

Zetasizer Nano ZS bao gồm các bộ phận sau:

Nguồn ánh sáng tia

laser đỏ Bộ điều chỉnh năng lượng ánh sáng

Các đầu dò ở góc 90o và 173o

Hệ thống xử lý tín

hiệu

Cell đựng mẫu

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Curcumin có độ tinh khiết ≥ 95 % (Viện Dược liệu cung cấp)

- Nguyên liệu o-carboxymethyl chitosan (O-CMC) (Phòng Vật liệu y sinh, Viện công nghệ Vật liệu chế tạo và cung cấp)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Chất chuẩn

- Curcumin 99,1% (Viện Hóa Học Công Nghiệp cung cấp)

2.1.2.2 Dung môi, hoá chất

- Acetonitril tinh khiết (Merck)

- Acid acetic băng (Merck)

- Aceton tinh khiết (Merck)

- Đệm phosphat, đệm acetat

- Nước cất, Ethanol

2.1.2.3 Máy móc, dụng cụ

- Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S – 4800

- Máy đo thế zeta Zetasizer Nano ZS

- Máy quang phổ hồng ngoại Nicolet Nexus 6700

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao AGILENT TECHNOLOGIES 1200

- Máy khuấy từ, cân phân tích Mettler AB204 có độ chính xác ± 0,1 mg

- Tủ ấm CO2, thiết bị đông khô

- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: bình định mức, pipet chính xác, ống đong

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu

Sau khi gắn thuốc lên O-CMC, chúng tôi lựa chọn cách xử lý mẫu cho định lượng curcumin và khảo sát động học phân giải

2.2.2 Lựa chọn điều kiện xác định kích thước hạt

Tiến hành trên kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S – 4800 có độ phóng đại 20 – 800000 lần, độ phân giải 1 - 5nm

2.2.3 Xác định trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin

Trạng thái bề mặt của O-CMC gắn curcumin được xác định trên máy đo thế zeta Zetasizer Nano ZS của Anh sử dụng công nghệ M3-PALS:

- Khoảng đo: 3,8nm – 100 µm

- Thể tích mẫu tối thiểu: 150µL

- Độ chính xác: 0.12µm.cm/V.s cho hế thống lỏng sử dụng nguyên liệu chuẩn NIST SRM1980

2.2.4 Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR

Phổ FT-IR của O-CMC, Curcumin và O-CMC gắn curcumin được xác định trên máy đo quang phổ hồng ngoại Nicolet Nexus 6700:

- Giao thoa kế: Kiểu Michelson với góc tới là 30o

2.2.5.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Lựa chọn điều kiện sắc ký gồm cột, pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm nhằm định lượng curcumin tự do và curcumin gắn lên O-CMC

Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, thường chọn khoảng nồng

độ có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích

Triển khai sắc ký 5-7 nồng độ của chất phân tích Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích được biểu diễn bằng phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy

Yêu cầu của đường hồi quy thu được là: phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ

số tương quan xấp xỉ 1

- Độ chính xác của phương pháp

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%)

Tiến hành phân tích ở một mức nồng độ thích hợp nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành 6 thí nghiệm song song, đánh giá độ lặp lại của kết quả thu được thông qua

độ lệch chuẩn tương đối RSD%

Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần phân tích, biểu thị bằng chỉ số RSD không được lớn hơn 2,8%

- Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết

2.2.6 Đánh giá hiệu suất gắn thuốc

Sử dụng phương pháp định lượng curcumin đã xây dựng để định lượng curcumin tự do trong dung dịch sau bào chế, từ đó tính toán hiệu suất gắn thuốc:

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu

- Tính toán và xác định các đại lượng đặc trưng của các mẫu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel:

Giá trị trung bình:

X X

n

i i

n

i i

Hàm STDEV(dãy số) cho độ lệch chuẩn của dãy số đó

Độ lệch chuẩn tương đối:

Phương trình hồi quy, các thông số khác

- So sánh giá trị trung bình hai mẫu bằng phần mềm S-plus 8.0