Báo cáo hoá sinh emzyme

Enzim là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng,sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.Có rất nhiều phức hệ enzim.Ta sẽ nghiên cứu 2 phức hệ cellulase và pectinase.

Enzim chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa cho trình sinh trưởng,sinh sản sinh vật mà đóng vai trò quan trọng cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong cơng nghệ gen bảo vệ mơi trường.Có nhiều phức hệ enzim.Ta nghiên cứu phức hệ cellulase pectinase Pectinase Pectinase laø hệ enzym có tác dụng lên pectin dạng hoà tan, làm giải phóng nhóm metoxy (CH3O-) phần polysaccarit lại gọi axit pectic (hay polygalacturonic) I-PECTIN: (thuộc nhóm chất xơ hoà tan ) Một đoạn phân tử pectin Pectin polysaccarit có nhiều ,củ, thân Ở thực vật ,pectin tồn hai dạng :dạng protopectin không tan dạng pectin hoà tan +Tên gọi pectin dùng để chuỗi polygalacturonic metyl hoá 100% +Axit pectinic dùng để chuỗi polygalacturonic metyl hoáthấp 100% + Axit pectic dùng để chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm metyl Tuy nhiên thực tiễn pectin đựoc dùng pectin va axit pectinic Protoprectin không tan: chủ yếu thành tế bào, kết hợp với polysaccharide araban Pectin hoà tan: chủ yếu dòch bào Pectin hoà tan polysaccharide cấu tạo gốc acid galaturonic, số gốc acid có chứa nhóm methoxy Dạng không tan chuyển hoá thành pectin hoà tan môi trường acid, nhiệt độ sôi, hay có mặt enzim protopectinase II-HỆ ENZYM PECTINASE: Pectinase có thực vật vi sinh vật.Ở ta xét việc thu nhận ứng dụng pectinase từ vi sinh vật  Đặc điểm hệ enzym pectinase vi sinh vật : Theo quan điểm đại ,trong phức hệ enzym pectinase có enzym :pectinesterase;polygalacturonase;protopectinase;transeliminase 1/.Pectinesterase: (pectase-3.1.1.11) -Enzym thu đïc từ canh trường nấm mốc A.niger trạng thái đồng thể ,N-axit amin cuối phân tử phenylalanin -Pectinesterase thuỷ phân liên kết este pectin axít pectic để tạo thành metanol axít pectinic pectin + nH2O  CH3OH + axit pectinic - Pectinesterase nấm mốc tham gia thuỷ phân sâu sắc so với pectinesterase thực vật - Pectinesterase co ùnguồn gốc khác có pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu khác - Các ion Ca2+ ,Na+ ;các clorua Na ,Ca,K hoạt hoá pectinesterase ; cation hoá trò kìm hãm tác dụng 2/.Polygalacturonase:(pectinase-3.2.1.15) (tên hệ thống : polygalacturonitglucanhdrolase ) Dựa vào chế tác dụng có the åchia thành : -Endopolygalacturonase (còn gọi polygalacturonase dòch hoá ) : phân cắt liên kết α-1,4 phía phân tử pectin phía phân tử axit polygalacturonic -Exopolygalacturonase (còn gọi polygalacturonase đường hoá ) : phân cắt phân tử acid galacturonic ,bắt đầ từ đầu không khử mạch pH tối ưu phụ thuộc vào nguồn thu va chất ; đa số polygalacturonase bền vững pH từ 4,0 đến 6,0 ;nhiệt độ tối ưu khoảng 40-50oC bò vô hoạt 55-65oC Polygalacturonase hoạt hoá cation kim loai kiềm NH4+ 3/Protopectinase: tách araban galactan khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất metyl axit polygalacturonic (tức pectin hoà tan ) 4/.Transeliminase: phân huỷ pectin đường phi thuỷ phân tạo đơn phân galacturonic có chứa nối đôi (4deoxy-5-xetogalacturonic) Transeliminase có tính đặc hiệu cao nên ngfưòi ta chia thành : +endopectintranseliminase +exopectintranseliminase +endopectinc-transeliminase +exopectinic-transeliminase Transeliminase có nguồn gốc khác có chế tác dụng thuộctính khác III.Ứng dụng: Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinaza dưới dạng tinh khiết Pectinaza thường được sử dụng các ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang - - Sản xuất nước quả và nước uống không rượu - Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt - Sản xuất nước giải khát - Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan Trong sản xuất rượu vang,nước quả và các nước uống không rượu dều co thể sử dụng pectinaza một cách hiệu quà Co pectinaza các quá trình ép làm và lọc d ịch quả rất dễ dàng làm tăng hiệu xuất của sản phẩm ví dụ dưa pectinaza vào khâu nghiền quả sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau ép 15-25 Khi co pectin thì khối quả nghiền sẽ co trạng thái keo, do ép dịch quả không thoát dược nhừ pectinaza phân giải các chất pectin di mà dịch quả suốt không bị vẩn dục và lọc rất dễ dàng Pectinaza còn gop phần chiết rút dược các chất màu, tanin và những chất hòa tan, làm tăng thêm chất lượng của sản phẩm Trong sản xuất các mặt hàng từ quả nhờ pectinaza co thể thu dược dịch quả co nồng dộ dậm dặc Ví dụ: dịch táo cô dặc dến 72 dộ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên thì sãn phẩm sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô dặc thêm nữa Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinaza dể tách lớp keo ở bề mặt hạt cà phê CELLULASE Cellulase phức hệ enzym có tác dụng quan trong việc thuỷ phân cellulose.Đây enzym thuộc nhóm enzym hydrolase thøng thấy vi sinh vật I-CELLULOSE: polysaccarit chủ yếu thành tế bào thực vật ; chiếm khoảng 90% ,còn gỗ chiếm 50%.;Hằng năm cellulose thực vật tởng hợp khoảng 1011 Sự tạo cellulase chủ yếu thực vật phân huỷ chủ yếu vi sinh vật Cellulose có nhiều tất hợp chất hữu khác thể sống nguyên liệu thành tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền học tính đàn hồi Cellulose chất trùng hợp từ đơn phân tử glucose, mạch thẳng tạo -D- glucose liên kết -1,4 glucoside Cellulose chất rắn, trắng , không mùi vò, không tan nước đem đun nóng, không tan dung môi hữu thông thường (rượu, ether, benzen) Trong tế bào thành xanh, vi sợi cellulose xếp dạng lớp xen phủ, thể tạo nên cấu trúc dai, Đôi thành tế bào củng cố nguyên liệu gọi lignin, chất chèn vào khoảng không vi sợi cellulose Được ứng dụng chất tẩy rửa, chủ ́u đễ làm mềm vải VỊ TRÍ TÁCH NƯỚC CỦA LIÊN KẾT  LIÊN KẾT -1,4- GLUCOSIDE đuodu ình – Liên kết -1,4- glucoside Cellulose ý nghóa mặt dinh dưỡng người thể người enzim phân huỷ cellulose Động vật nhai lại tiêu hoá dễ dàng cellulose dày chúng có chứa vi khuẩn có khả tiết enzym cellulase có tác dụng thuỷ phân cellulose Thành tế bào thực vật Cellulose polysaccharide chủ yếu thành tế bào thực vật Các đơn vò cấu tạo cellulose gắn với nhờ liên kết glucoside Trật tự xếp Fibril, Microfibril Cellulose tế bào thực vật THÀNH TẾ BÀO TẾ BÀO THỰC VẬT Mỗi đơn vò cấu trúc nên cellulose anhydride dglucose Mỗi gốc glucose chứa ba nhóm – OH nguyên tử Carbon thứ hai, thứ ba thứ sáu (trong nhóm – OH đính C6 nhóm rượu bậc I, lại nhóm rượu bậc II) Gốc anhydride d-glucose có vòng cạnh piranose (nhờ nguyên tử C nguyên tử O) liên kết 1-4 glucoside Phân tử cellulose chứa từ 1.400 – 10.000 gốc glucose không xoắn mà duỗi thẳng Phân tử lượng cellulose thu từ nguồn khác xê dòch giới hạn rộng (từ 5.104 – 106 cao hơn) Chuỗi phân tử Cellulose Dùng phương pháp phân tích tia Rontgen, người ta xác đònh phân tử cellulose có dạng sợi Chuỗi phân tử Cellulose Các dạng sợi cellulose lại gắn vào nhờ liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen cellulose Liên kết Hydro phân tử Cellulose tạo cấu trúc Micelle sợi celluose liên kết lại với tạo thành bó sợi, bó sợi lại liên kết với tạo thành đại phân tử cellulose II-CELLULASE: phức hệ hydrolase bao gồm từ C1 đến Cx βglucozidase , có vai trò thuỷ phân cellulose thành sản phẩm cuối glucose Chế phẩm cellulase Mô hình phân tử cellulase *Cơ chế tác dụng cellulase sau: Ở giai đoạn đầu ảnh hưởng enzym C1 ,những mảnh polyanhydroglucose có kích thước lớn tách khỏi cellulose không hoà tan ban đầu ; sau dưói tác dụng enzym Cx mảnh vừa tạo thành bò phân ly thành oligosaccarit cellobiose Như , cellulase C1 tác dụng cellulose nguyên thủy ,cellulase C2 tácdụng cellulose biến hình không hoà tan ,cellulase Cx tác dụng cellodextrin hoà tan dẫn xuất hoà tan ,còn cellobiase tác dụng disaccaritcellobiose để tạo glucose Sơ dồ minh hoạ tổng quát chế tácdụng cùa cellulase: Mô hình cellulase tác dụng lên chất cellulose *Phức hệ cellulase nhiều cấu tử tách từ số loại nấm Ví dụ :nấm Morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử ;Polyporus versicolor tạo cellulase cấu tử ;… *Tính đặc hiệu cellulase liên kết glucoside rộng rãi :chúng thuỷ phân xilan (β -1,4);glucomanan(β -1,4);lichenin (β -1,3 va β –1,4);polysaccarit mật (α-1,2) ;laminarin (β -1,3);lutean(β -1,6) III ỨNG DỤNG: Các chế phẩm cellulaza thường dùng để:  Tăng chất lượng sản phẩm thực phẩm thức ăn gia súc chúng ta đều biết, celluloza là hợp phần quaon trọng của vỏ tế bào thục vật các nguyên liệu thực phẩm co nguồn gốc thực vật nếu được gia công chế phẩm celluloza sẽ được mềm ra, sẽ ăng hệ số đồng hoa và noi chung chất lượng được tăng lên O đo rất bổ ích chuẩn bị các thức ăn đặc hiệu cho trẻ con, cho người ăn kie6g chế biến thức ăn gia súc  Tăng hiệu suất trích ly chất khác từ nguyê liệu thực vật Protein, acid amin, vitamin từ đậu tương, thạch từ rong, tinh bột từ bã, chất thơm và chất hòa tan sản xuất chè xanh và cà phê hòa tan Chẳng hạn sản xuất bia dưới ảnh hưởng của phức hệ enzym xitaza (chủ yếu gồm ezym cellulaza, hemicellulaza, ezym thủy phân chất gôm và ezymcellobiaza,…) thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy khiến cho các ezym proteaza và amilaza tác dụng dễ dàng với protein và tinh bột chứa hạt đại mạch Khi đo, lượng đường, dextrin và các chất hòa tan khác tăng lên, tạo điều kiện để để gia sau này hình thành nên các phẩm vật co màu và co mùi thơm đặc trưng của malt và bia Rong biển nếu được gia công từ chế phẩm cellulaza thì hiệu suất thạch sẽ được tăng lên Người ta thấy, ảnh hưởng của ezym hemicellulaza mà các chất mật, gôm,… vốn không bị tác dụng của pectinaza bị phân hủy một cách mạnh mẽ, nên kết quả là ngăn cản được sự gelatin hoa chế biến các loại cà phê cô đặc  Thủy phân gỗ phế liệu gỗ Các phế liệu này rẻ tiền và co thể dùng chế phẩm cellulaza để thủy phân thành các đường đơn giản co thể chế biến làm thức ăn gia súc ezym cellulaza phổ biến rộng rãi các nấm hiển vi và vi khuẩn Trong đa số trường hợp, người ta thu chế phẩm cellulaza từ canh trường bề mặt của nấm mốc A oryzae và A awamori Nấm mốc A.oryzae Được ứng dụng chất tẩy rửa, chủ yếu đễ làm mềm vải Thu nhận phức hệ enzym pectinaza va cenlulaza: I/Thu nhận pectinase: 1.Nguồn thu nhận: Vi sinh vật tổng hợp pectinase: Nguồn giàu enzym pectinase là nấm mốc nấm men và vi khuẩn Nấm mốc:penicillium glaucum, P ehrlichii, P chrysogenum, P.expanam, P cilrimim, Aspergillus awamori, A foetidus, A niger, A terrus, A saitoi, Fusarium moniliforme,… Nấm men: Saccharomyces fragilis Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pentinovorum, Klebsiella aerogenes,… Các loài vi sinh vật này thường co bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật quả bị hư hỏng hoặc thực vật chết chúng sẽ cùng các loài VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật Bên cạnh Pectinesterase (PE) VSV, hầu hết các loại cho trái đều chứa enzym PE như: cà chua, đậu nành, thịt quả chuối, quả cam, táo… Polygalacturonase thường được tìm thấy các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh Ví dụ như: Saccharomyces fragilis, aspergillus niger,…PG còn được tìm thấy ở cà chua 2.Thu nhận: Hiện người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Co hai phương pháp sản xuất: A/ Thu nhận từ canh trường bề mặt: môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thoc mầm nguồn dinh dưỡng bổ sung thường lá các muối ammonium, phosphoric…độ ẩm môi trường phải nằm khoảng 60 độ C nấm mốc A awamori thường được nuôi cấy ở 30 độ C thời gian 40 giờ, sau đo giảm xuống 24 độ C và nuô 48-52 giờ Sản phẩm sau lên men được sấy khô thàng chế phẩm enzym thô và đem tinh chế Để thu pectinase tinh khiết thì enzym thô phải được trích ly phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu (etanol 72,5-75% hoặc iso-propanol 55-57%) hay muối amoni sunfat co độ bão hòa 0,79% Nếu dùng etanol đô tinh khiết của chế phẩm enzym khoảng 90%, nế dùng muối thì khoảng 75% Nhiệt độ tối ưu của rượu là 2-5 độ C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ít càng tốt sau đo ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa ri62i nghiề nhỏ và đem bảo quản B/Thu nhận từ canh trường bề sâu: a/phương pháp hiếu khí sự tích tụ enzym môi trường được bắt đầu sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, môi trường bị acid hoa mạnh và lượng ohospho vô được sử dụng hoàn toàn pH thích hợp từ 6-7,2, pH kiềm kìm hãm, pH = ức chế hoàn toàn Vật liệu gieo cấy co thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10% Trong quá trình nuôi cấy hàm lượng các chất hòa tan môi trường thường giảm từ xuống còn 1,5-1,8% Để thu chế phẩm khô cần tách sợi nấm khỏi canh trường lỏng đến hàm lượng chất khô đạt 5-8% rối sấy khô thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt vào phải đạt 165-180 độ C và đạt 60-70 độ C thời gian lưu của chế phẩm enzym thiết bị sấy phải không quá giây và nhiệt độ chế phẩm sau sấy phải không quá 40 độ C chế phẩm thu được cần phải được đong goi kín để tránh hút ẩm Co thể thu cách kết tủa enzym dịch lọc canh trường với etanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammoniumsulfate(50-80%) Nếu kết tủa etanol, hoạt độ pectinase kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu nếu kết tủa muối ammonium silfate, cần tách muối khỏi enzym phương pháp thẩm tích, sau đo sấy khô b/Phương pháp yếm khí: Môi trường :bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0,75% KH2PO4: 0,1%; CaCO3 0,3%; nước chiết ngô: 0,5% Clostridium pectinofermentants 15 co khả tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối.sự tích lũy ezym tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 5-60h pH ban dầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0 vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 độ C cl.felsineum co thể được nuôi cấy yếm khí để thu được pectinase thành phần môi trường co: lactose 2%, pectin củ cải 1%, (NH4)HPO4 0,4%,K2HPO4 0,7%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,1%, MgSO4 0,025%, FeSO4dạng vết, CaCO4 0,5%, dịch nấm men tự phân, 0,05%, ascorbis acid 0,5% Co thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường cách kết tủa enzym với dung môi hữu hoặc với muố amomium sulfat Nếu kết tủa dung môi hữu cơ, Ph của dung dịch đã xử lý là 6,5- 6,8 nếu kết tủa 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzim kết tủa đạt 93-95 % so với hoạt đọ ban đầu Phương pháp hiện đại chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường theo các bước bản sau; -khử muối phương pháp lọc gel -tách protein phương pháp trao đổi ion _tách enzym pectinase alginate liên kết ngang _Tinh sạch FPLC II/THU NHẬN CELLULASE TỪ VSV Cellulose là thành thành phần bản của thực vật và chúng được thực vật tổng hợp với số lượng nhieuf nhất tự nhiên Cellulose là mọt những chất hữu co tự nhiên bị VSV phân giải thực hiện quá trình phân giải celluosa diều kiện tự nhiên là các loại enzym cellulase VSV tổng hợp celluase Trong điều kiện tự nhiên, celluose bị phân hủy bởi VSV cả điều kiện hiếu khí lẫn hiếm khí Các loài VSv thay phiên phân hỷ celluose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, thiên nhiên, không co một VSV nào co khả cùng một lúc tổng hợp tất cả các loại enzym co phức hệ enzym celluase Co loài này co khả sinh tổng hợp mạnh loại enzym này, loài khác lại tổng hợp mạnh loại enzym khác, Chính vì thế, sự phân giải glucose điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzym co tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khẩn, vi khuẩn, và một số trường hợp còn co cả nấm men tham gia quá trình phân giải này Trong đo, nhuwgx VSV sau được nghiên cứu kĩ nhất: Altenaria tenuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Celluvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Trichoderma koningi… Enzym celluase là một những enzym co vai trò rất quan trọng quá trình chuyển hoa các vật chất hữu co thiên nhiên và co ý nghĩa lớn công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường 2.Phương pháp thu nhận: VSV co khả tổng hợp celluase thuộc ba nhom: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn công nghiệp sản xuật enzym cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn Để thu nhận enzym cellulase từn nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt môi trường xốp( môi trường bán rắn) độ ẩm tốt nhất là 6065%, co chất là cellulose Thành phần môi trường phải: đủ chất dinh dưỡng, co cellulose, co đủ độ xốp để không khí lưu thông Phải cung cấp oxy vì cà hai đều là VSV hiếu khí Xạ khuẩn phát triển mạnh môi trường kiềm và môi trường axit yếu.Nấn sợi phát triển mạnh môi trường axit.PH môi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6.2-7.6.PH môi trường ban đầu cho nấm sợi là 4.5-5.5 Xạ khuẩn thưởng co thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài nấm sợi thông thường,nấm sợi phát triển từ 36-48h cho hoạt tính enzim rất cao.Xạ khuẩn phải mất ít nhất 72h mới tổng hợp cellulase nhiều Xạ khuẩn chịu nhiệt tốt nấm sợi Enzim của xạ khuẩn hoạt động ở nhiệt độ cao enzim của nấm sợi Sau nuôi cấy ở những điều kiện kĩ thuật tối ưu,người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô.Chế phẩm này chứa nước,sinh khối vi sinh vật,thành phần môi trường và enzim Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hoa lý tách nước,sinh khối VSV sẽ thu được enzim dạng bán tinh khiết.Enzim bán tinh khiết còn chứa nước,protein kh6ng hoạt động và enzim.Bằng những phương pháp hoa lý ta sẽ loại được nước,protein không hoạt động đo ta thu được chế phẩm enzim tinh khiết ...Pectinase có thực vật vi sinh vật.Ở ta xét việc thu nhận ứng dụng pectinase từ vi sinh vật  Đặc điểm hệ enzym pectinase vi sinh vật : Theo quan điểm đại ,trong phức hệ enzym... pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối.sự tích lũy ezym tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 5-60h pH ban dầu... thô.Chế phẩm này chứa nước ,sinh khối vi sinh vật,thành phần môi trường và enzim Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hoa lý tách nước ,sinh khối VSV sẽ thu được enzim