đặc tính của chế phẩm chitinase từ penicillium oxalicum 20b ứng dụng cho sản xuất n acetyl d glucosamin

Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG THANH ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE TỪ PENICILLIUM OXALICUM 20B ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT N-ACETYL-D-GLUCOSAMIN Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2017 Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG THANH ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE TỪ PENICILLIUM OXALICUM 20B ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT N-ACETYL-D-GLUCOSAMIN Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội - Năm 2017 Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Phương Thanh Đề tài luận văn: Đặc tính chế phẩm chitinase từ Penicillium oxalicum 20B ứng dụng cho sản xuất N-acetyl-D-glucosamin Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB 140381 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 29/4/2017 với nội dung sau: Mục sửa chữa Bản cũ Bản 350 350C 11 Chlorophiceae Chlorophiceae 12 bên bền 39 nông nồng Trang Chỉnh sửa lỗi 10 tả Chỉnh sửa 4,11,15 Chưa có trích dẫn Đã trích dẫn thích hình bảng nguồn Viết lại tổng quan - Chưa có cho sát với nghiên Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Thêm mục 1.1.3.5 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà cứu 1.1.3.6 Chưa có Viết thêm vào mục 1.1.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 13 - 14 Chưa có Bổ sung bảng nội dung phần 1.2.3 Ứng dụng Viết lại kết luận 41 cho cụ thể xác Chế phẩm chitinase kỹ thuật thu phương pháp kết tủa muối amoni sunphate có hiệu suất thu hồi cao nồng độ 80% bão hòa cho hiệu suất thủy phân cao nồng độ muối bão hòa tối ưu 70% - Chế phẩm chitinase kỹ thuật thu phương pháp kết tủa muối amoni sunphate nồng độ muối bão hòa 70% với hiệu suất thu hồi 68,1% cho hiệu suất thủy phân chitin thành đường khử cao - Tỷ lệ H/E có ảnh - Tỷ lệ H/E thay hưởng đến hoạt đổi nhiệt độ tính chitinase pH thay đổi có ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase, tỷ lệ H/E tăng cao Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà làm giảm hoạt tính chitinase Bổ sung tài liệu 45 Chưa có Thêm số 29 Chưa có Bổ sung phương tham khảo Bổ sung phương 29 pháp thiếu pháp bradford Ngày 28 tháng năm 2017 Giáo viên hƣớng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tơi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè ủng hộ giúp đỡ tơi tồn thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên NGUYỄN THỊ PHƢƠNG THANH Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH 10 DANH MỤC BẢNG 11 MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Chitinase 1.1.1 Phân loại enzym Chitinase 1.1.2 Cơ chế thủy phân chitin Chitinase 1.1.3 Đặc tính enzym Chitinase 1.1.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 1.1.5 Phương pháp thu nhận chế phẩm chitinase từ vi sinh vật 1.2 Chitin 11 1.2.1 Chitin tự nhiên 11 1.2.2 Tính chất 12 1.2.3 Ứng dụng 13 1.3 N-axetyl-D-glucosamine (NAG) 14 1.3.1 Cấu tạo tính chất 14 1.3.2 Các phương pháp sản xuất NAG 16 1.3.3 Ứng dụng NAG 18 2.1 Nguyên liệu 19 2.2 Môi trƣờng 19 2.3 Hóa chất 21 2.4 Thiết bị 22 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù 23 2.5.2 Phương pháp ni cấy chìm 23 2.5.3 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym từ dịch lên men kết tủa muối (NH4)2SO4 24 2.5.4 Phương pháp xác định đặc tính chế phẩm 25 2.5.5 Phương pháp thủy phân chitin Chitinase 26 2.6 Phƣơng pháp phân tích 26 2.6.1 Xác định hoạt độ Chitinase 26 2.6.2 Xác định hoạt độ N-acetylhexosaminidase NAHase 27 2.6,3 Xác định hoạt độ Endochitinase 27 2.6.4 Phương pháp TLC xác định phổ sản phẩm trình thủy phân 28 2.6.5 Xác định nồng độ protein phương pháp Bradford 29 Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Thu nhận chế phẩm chitinase phƣơng pháp kết tủa muối sunphat amoni 30 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ sunphat amoni bão hòa đến hiệu suất thu hồi 30 3.1.2.Hiệu suất thủy phân chế phẩm cô đặc sunphat amoni bão hòa 30 3.2 Đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật 32 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 32 3.2.2 Ảnh hưởng pH 35 3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng NAG thu 38 3.3 Kiểm tra phổ sản phẩm chế phẩm chitinase 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46 Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAG, GlcNAc N-axetyl-D-glucosamine DJD Bệnh thoái hóa khớp IBD Bệnh viêm ruột Neu5Ac Axit N-axetylneuraminic LD50 Liều gây độc làm chết 50% vật thí nghiệm E0 Enzym ban đầu E60 Enzym kết tủa nồng độ muối bão hòa 60% E70 Enzym kết tủa nồng độ muối bão hòa 70% E80 Enzym kết tủa nồng độ muối bão hòa 80% E90 Enzym kết tủa nồng độ muối bão hòa 90% NAHase β-N-axetylhexosaminidase Endo Endochitinase H/E Tỷ lệ hoạt độ enzyme NAHase/Endochitinase E/S Tỷ lệ Enzyme/cơ chất Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cơ chế hoạt động Chitinase Trichoderma (Ảnh: Nguồn internet) Hình 1.2 Khuẩn lạc chủng 20B mơi trường MS-chitosan [31] Hình 1.3 Ảnh bào tử (A) cuống sinh bào tử trần (B) [31] (Ảnh: Nguồn internet) 11 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo NAG 15 (Ảnh: Nguồn internet) 15 Hình 3.1 Hàm lượng đường khử dịch thủy phân bới chế phẩm chitinase kết tủa nồng độ amoni sunphat khác 31 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase, NAHase endochitinase chế phẩm chitinase 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzym 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chitinase(A); NAHase (B); endochitinase (C) 36 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH tới độ bền enzym 37 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến lượng NAG thu 38 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến lượng NAG thu 39 Hình 3.8 Ảnh hưởng hoạt độ chitinase đến lượng NAG thu 40 Hình 3.9 Sắc ký đồ phổ sản phẩm thủy phân cua chế phẩm chitinase kết tủa muối nhiệt độ 40°C pH5, E/S 2,58 U/g (1) Mẫu NAG chuẩn, (2) Mẫu kiểm chứng dịch enzym, (3) Mẫu dịch sau thủy phân 40 Nguyễn Thị Phương Thanh - CB140381 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà lại 50°C gần gấp lần hoạt tính Endochitinase (32% so với 15%) Như chitinase bền nhiệt độ thấp nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase Tại nhiệt độ tối ưu 40°C, hoạt tính chitinase lại 33% sau 24 ủ Xét ảnh hưởng tỉ lệ H/E đến hoạt tính chitinase lại sau ủ (Bảng 3.4) lần cho ảnh hưởng tỷ lệ H/E đến hoạt tính chitinase Tại nhiệt độ ủ 30°C hoạt tính NAHase Endochitinase giảm mạnh 42% 52% tương ứng (Hình 3.4) hoạt tính chitinase đến gần 90% giảm tương đối tương đương chúng dẫn đến tỷ lệ H/E thay đổi Trong nhiệt độ 40°C 50°C hoạt tính Endochitinase giảm nhiều NAHase dẫn đến tỷ lệ H/E tăng mạnh hoạt tính chitinase giảm nhiều (Bảng 3.4) Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng enzym đến tỷ lệ H/E hoạt độ chitinase lại Nhiệt độ ủ Tỷ lệ H/E Hoạt độ chitinase lại (%) 30°C 0.217 87.88 40°C 0.397 33.08 50°C 0.461 23.50 3.2.2 Ảnh hưởng pH 3.2.2.1 pH tối ưu cho phản ứng enzym Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym điều kiện pH khác thu kết thể Hình 3.5 Có thể dễ nhận thấy rằng, so với nhiệt độ, thay đổi pH có ảnh hưởng đến hoạt độ enzym Ảnh hưởng pH khác loại enzym khác Chitinase Endochitinase có hoạt tính cao pH NAHase Mặt khác, Chitinase Endochitinase hoạt động pH NAHase lại pH4 35 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Trong khoảng pH 4,5 - 5,5, tất lại enzym hoạt động tốt ổn định (trên 90% hoạt tính) Endochitinase bị ảnh hưởng pH lớn NAHase hoạt độ giảm pH 40% hoạt độ NAHase giảm nhiều gần 20% pH4 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chitinase(A); NAHase (B); endochitinase (C) Xét ảnh hưởng tỷ lệ H/E đến hoạt độ chitinase tương đối (Bảng 3.5) thấy tỷ lệ H/E thay đổi khơng lớn, dao động từ 0,094 đến 0,164 dẫn đến hoạt tính chitinase bị ảnh hưởng pH Tại pH hoạt độ chitinase giảm nhiều 28% tương ứng với tỷ lệ H/E tăng nhiều Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH phản ứng enzym đến tỷ lệ H/E hoạt độ chitinase tương đối pH phản ứng enzym Tỷ lệ H/E Hoạt độ chitinase tƣơng đối (U/ml) 4.0 0.122 86.41 4.5 0.099 96.72 5.0 0.094 100.00 5.5 0.108 93.79 6.0 0.164 72.15 36 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà 3.2.2.2 Ảnh hưởng pH đến độ bền enzym Tiến hành ủ enzym 24h điều kiện pH - 6, nhiệt độ 40°C, khảo sát hoạt độ enzym so sánh với giá trị trước ủ thu kết biểu thị Hình 3.5 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH tới độ bền enzym Kết Hình 3.5 cho thấy pH có ảnh hưởng khác đến độ bền loại enzym Trong NAHase bền pH Endochitinase lại bền pH hoạt tính Chitinase bền pH Tuy nhiên nhìn chung NAHase bền với pH Endochitinase Hoạt tính NAHase giữ 100% pH trường hợp bền pH tới 82% Trong Endochitinase bền pH giữ 57% hoạt tính ban đầu Đối với Chitinase pH tăng hoạt tính giảm Hoạt tính chitinase tới 62% pH 4, 44% pH lại 46% pH tối ưu cho hoạt tính chitinase Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH ủ enzym đến tỷ lệ H/E hoạt độ chitinase lại pH Tỷ lệ H/E Hoạt tính chitinase tƣơng đối (%) pH 0.183 64.13 pH 0.218 46.34 pH 0.245 43.79 37 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Kết biểu diễn Bảng 3.5 cho thấy độ bền chitinase giảm pH tăng tương ứng với tỷ lệ H/E tăng 3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng NAG thu 3.2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến lượng NAG thu Tiến hành thủy phân dịch chitin keo 50% mô tả phần phương pháp Kết biểu diễn Hình 3.6 cho thấy lượng NAG thu cao 40°C thấp 50°C Theo kết nghiên cứu trước, hoạt tính chitinase tối ưu 40°C 30°C 50°C (Hình 3.2) chitinase bền 50°C, bền nhiệt độ 40°C bền 30°C (Hình 3.3) Tuy nhiên kết thủy phân cho thấy lượng NAG điều kiện 50°C thấp gần 40% so với 40°C thấp gần 20% so với 30°C kết nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzym bền nhiệt Kết cho thấy dùng chế phẩm chitinase để thủy phân chitin thu NAG nhiệt độ 40°C 24 3.2.3.2 Ảnh hưởng pH Tiến hành thủy phân với lượng enzyme 40°C điều kiện pH khác 24 Kết biểu diễn Hình 3.7 Có thể dễ dàng nhận thấy rằng, Lượng NAG đạt cao pH dịch thủy phân Ở điều kiện pH 6, lượng NAG thu thấp nhất, khoảng 70% so với pH Điều phù hợp với kết nêu khảo sát pH tối ưu bền pH cho enzym Chitinase (Hình 3.4 Hình 3.5) 38 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến lượng NAG thu 3.2.3.3 Ảnh hưởng nồng độ chitinase đến hiệu suất thủy phân Kết khảo sát trình thủy phân độ pha lỗng chế phẩm Enzym thể Hình 3.8 Từ biểu đồ, dễ dàng nhận thấy rằng, độ pha loãng chế phẩm enzym lớn lượng NAG tạo thành giảm Theo lý thuyết, giới hạn định, nồng độ enzym lớn lượng chất bị biến đổi nhiều nhiêu Khi pha loãng chế phẩm, nồng độ enzym giảm, lượng đường tạo thành giảm Tuy nhiên nhận thấy lượng NAG tạo thành tăng tuyến tính từ 2,79 mg/ml lên đến 10,63 mg/ml nồng độ enzyme sử dụng tăng từ 0,514 U/g đến 2,58 U/g chất Nồng độ enzyme/cơ chất tăng làm tăng tốc độ phản ứng chừng lượng chất dư thừa so với lượng enzyme Sau nồng độ enzyme có tăng đến 10,28 U/g chất lượng NAG tạo thành tăng không đáng kể lên tối đa 11,49 mg/ml Nếu tính lượng NAG tổng thu pha lỗng enzyme thủy phân lượng NAG thu cao nồng độ enzyme 1,03 U/g chất Tại nồng độ enzyme cho nồng độ NAG cao lượng NAG tổng giảm khoảng 17 mg tương ứng giảm khoảng 28% Do cần tìm nồng độ E/S hợp lý vừa đảm bảo thỏa mãn nồng độ NAG cao đồng thời tổng NAG giảm không nhiều 39 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Hình 3.8 Ảnh hưởng hoạt độ chitinase đến lượng NAG thu 3.3 Kiểm tra phổ sản phẩm chế phẩm chitinase Tiến hành chạy sắc kí để kiểm tra sản phẩm thủy phân mô tả phần phương pháp Kết thể Hình 3.9 cho thấy chế phẩm chitinase thủy phân điều kiện thích hợp nhiệt độ 40°C pH 5, nồng độ E/S 2,58 U/g cho sản phẩm tương ứng với NAG chuẩn Hình 3.9 Sắc ký đồ phổ sản phẩm thủy phân cua chế phẩm chitinase kết tủa muối nhiệt độ 40°C pH5, E/S 2,58 U/g (1) Mẫu NAG chuẩn, (2) Mẫu kiểm chứng dịch enzym, (3) Mẫu dịch sau thủy phân 40 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chế phẩm chitinase kỹ thuật thu phương pháp kết tủa muối amoni sunphate nồng độ muối bão hòa 70% với hiệu suất thu hồi 68,1% cho hiệu suất thủy phân chitin thành đường khử cao - Hoạt tính Chitinase từ P.oxalicum 20B hoạt động tối ưu 40°C pH5, enzym cấu thành nên chitinase NAHase Endochitinase hoạt động tối ưu 40°C pH6 35°C pH5 - Tỷ lệ H/E thay đổi nhiệt độ pH thay đổi có ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase, tỷ lệ H/E tăng cao làm giảm hoạt tính chitinase - Q trình thủy phân chitin chế phẩm chitinase kỹ thuật tốt 40°C pH5, E/S 2,58 U/g chất sau 24 Kiến nghị - Nghiên cứu bảo quản chế phẩm chitinase thu nhận phương pháp kết tủa muối 41 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Anh Boominathan Amutha, Jayant M Khire, M Islam Khan (1998) "Characterization of a novel exo-N-acetyl-β-d-glucosaminidase from the thermotolerant Bacillus sp NCIM 5120" Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1425 (2), 300-310 Parameswaran Binod, Chandran Sandhya, Pradeep Suma, George Szakacs, Ashok Pandey (2007) "Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in solid state fermentation and their application for the production of N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin" Bioresource Technology, 98 (14), 2742-2748 Jeen-Kuan Chen, Chia-Rui Shen, Chao-Lin Liu, Bing-Shiun Fang, Tung-Li Huang, Chao-Lin Liu (2011) "N-Acetyl Glucosamine Obtained from Chitin by Chitin Degrading Factors in Chitinbacter tainanesis " Int J Mol Sci., 12 (2), 1187-1195 Jeen Kuan Chen, Chia Rui Shen, Chao Lin Liu (2010) "Nacetylglucosamine:production and applications" Mar Drugs , (9), 2493–2516 Sanjeev Kumar, Rohit Sharma, Rupinder Tewari (2011) "Production of NAcetyl glucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes" Indian J Microbiol 51 (3), 319–325 Yoon Gyo Lee, Ki-Chul Chung, Seung Gon Wi, Jae Chang Lee, HyeunJong Bae (2009) "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704" Protein Expression and Purification, 65 (2), 244-250 J Rodriguez, J L Copa-Patino, M I Pérez-Leblic (1995) "Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolysates" Letters in Applied Microbiology, 20 (1), 46-49 J Rodriguez, J L Copa-Patino, F Reyes, M I Pérez-Leblic (1994) "A βN-acetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum implicated in its cell-wall degradation" Letters in Applied Microbiology, 19 (4), 217-220 42 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Wi SG Chung K-C Lee YG, Lee JC, and Bae H-J, (2009) "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704" Protein Expression and Purification, 65 (2), 244-250 10 F.J Alvarez., Molecules (2014) "The Effect of Chitin Size, Shape, Source and Purification Method on Immune Recognition" 19: , p 44334451 11 B and G.S Hoondal Bhushan (1998) "Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp BG-11 " Biotechnology Letters 20(2):, pp 157-159 12 P Binod, S Chandran, S Pradeep, S George, and P Asok (2007) "Fungal biosynthesis of endo-chitinase and chitobiase in solid state fermentation and their application for the production of N-acetyl-Dglucosamine from colloidal chitin" Bioresour Technol 98: , pp 27422748 13 M Fenice, R.D Giambattista, E Raetz, J.L Leuba, and F Federici (1998) "Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically modifies macroporous cellulose" Journal of biotechnology 62(2):, pp 119-131 14 U and A.S Jonsson Frenander (1996) "Cell harvesting by cross-flow microfiltration using a shear-ăenhanced module" Biotechnol Bioeng 52(3): , pp 397-403 15 J.H Huang, C.J Chen, and Y.C Su (1996) "Production of chitinolytic enzymes from a novel species of Aeromonas." J Ind Microbiol 17:, pp 89-95 16 C R Shen J K Chen, C L Liu (2010) "N-acetylglucosamine: production and applications" Mar Drugs, số 8(9), tr 2493-516 17 C.-R.S Jeen-Kuan Chen, and Chao-Lin Liu (2010) "NAcetylglucosamine: Production and Applications." Marine Drugs, 8: , p 2493-2516 18 S.L Lee, A Burt, and G Russotti (1995) "Microfiltration of recombinant yeast cells using a rotating disk dynamic filtration system" Biotechnol Bioeng 48(4):, , pp 386-400 43 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà 19 Y.G Lee, K C Chung, S.G Wic, J.C Lee, and H.J Bae (2009) "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein Expresion and Purification 65:" pp 244-250 20 R.A.A Muzzarelli (1977) "Chitin" Pergamon Press, Oxford Great Britain:, pp -309 21 J Rodriguez, J.L Copa-Patlfio, and M.L Pbtez-Leblic (1995) "Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicurn autolysates" Letters in Applied Microbiology 20:, pp.48-49 22 J Rodriguez, M.J Stantos, J.L Copa-Patino, and M.I.P Leblic (1994) "A β-Nacetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum implicated in its cell-wall degradation" Letters in Applied Microbiology 19:, pp 217 220 23 H Sashiwa, S Fujishima, N Yamano, N Kawasaki, A Nakayama, E Muraki, K Hiraga, K.Oda, and S Aiba (2002) "Production oF N-AcetylD-glucosamine from α-chitin by Crude Enzymes from Aeromonas hydrophila H2330" Carbohydr Res 337:, pp 557-559 24 P.V and M Chandrasekaran Suresh (1999) "Impact of process parameters on chitinase production by an alkalophilic marine Beauveria bassiana in solid state fermentation" Process Biochem 34: , pp 257-267 25 I Tsujibo, I Orikoshi, H Tanno, K Fujimoto, I MIyamoto, and C Imada, (1993) "Cloning, sequence and expression of a chitinase gene from a marine bacterium" Alteromonas sp strain O-7 J Bacteriol 175:, pp 176-181 26 Q.L Xu, J, (2006) Use of N-Acetyl D-glucosamine in Treatment of Organ Lesion Related to Toxicosis of Drugs or Chemicals IN 6693176B2, U P N (Ed.) 27 P.E Yuli, M.T Suhartono, Y Rukayadi, J.K Hwang, and Y.R Pyunb (2004) "Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the Indonesian Bacillus sp.13.26" Enzyme Microb Technol 35:, pp 147153 Tài liệu tham khảo tiếng Việt 28 Dương Thị Ngọc Quỳnh, Đồng Thị Hương Trầm, Lê Thanh Hà (2013) Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin keo thu N- axetyl- D- glucosamine chitinase thô từ Penicillium oxalicum 20B, Hội nghị khoa học công 44 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà nghệ sinh học toàn quốc 2013., Viện công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, 29 Đặng Thị Hường (2017) "Nghiên cứu thu nhận N-acetylglucosamine (NAG) chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng" Luận án tiến sĩ kỹ thuật 30 L.T Hà (2012) Chương trình: Đề án ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực thủy sản đến năm 2020 Mã số: 1144/HD-BNN-KHCN IN thôn, B N n v P t n (Ed.) 31 L.T Hà (2016) Báo cáo tổng kết đề tài Xây dựng qui trình thu nhận Naxetyl-D-glucosamin từ chitin sử dụng enzym endochitinase hexosaminidase, Bộ Giáo dục Đào tạo 32 N.T Hà (2013) "Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Penicillium citrinum sinh tổng hợp chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ" Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 27, pp 32-39 45 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn NAG Hình PL1 Đƣờng chuẩn NAG Xây dựng đƣờng chuẩn pNP Hình PL2 Đƣờng chuẩn pNP 46 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Kết khảo sát pH tối ƣu Bảng pH tối ưu 4.5 5.5 Chitinase 1.0 1.1 1.2 1.1 0.09 NAHase 1.73 1.95 2.02 2.10 2.17 Endochitinase 14.26 19.64 21.44 19.50 13.21 Kết khảo sát nhiệt độ tối ưu Bảng nhiệt độ tối ưu Chitinase NAHase Endochitinase 30 0.380 0.534 14.430 35 0.660 1.412 17.010 40 0.707 2.861 16.094 45 0.370 2.886 8.845 50 0.156 2.881 6.25 Bảng bền nhiệt: Hoạt độ (U/ml) Chitinase NAHase Endochitinase 0h 0.057 0.270 1.244 30°C 0.050 0.119 0.660 40°C 0.0191 0.090 0.227 50°C 0.013 0.088 0.191 47 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Bảng bền pH Mẫu Chitinase NAHase Endo pH 4, 0h 1.030 1.734 14.262 pH 5, 0h 1.192 2.010 21.441 pH 6, 0h 0.860 2.172 13.218 pH 4, 24h 0.661 1.502 8.219 pH 5, 24h 0.552 2.210 10.144 pH 6, 24h 0.376 1.788 7.294 Ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến hiệu thủy phân Hoạt độ (U/ml) NAG(mg) Yếu tố pH4 12.76 pH5 12.77 pH6 8.83 30°C 9.33 40°C 11.53 50°C 7.24 48 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Lê Thanh Hà Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu thủy phân Độ pha loãng Lượng Enzyme sử dụng (U/g chất chitin keo) Lượng NAG (mg/ml) Tổng khối lượng NAG thu với lượng enzyme (mg) 10.28 11.49 11.49 5.14 11.08 22.16 2.58 10.63 42.51 10 1.028 5.92 59.15 20 0.514 2.79 55.78 49 ... giả lu n v n : Nguy n Thị Phương Thanh Đề tài lu n v n: Đặc tính chế phẩm chitinase từ Penicillium oxalicum 20B ứng d ng cho s n xuất N- acetyl- D- glucosamin Chuy n ngành: Công nghệ sinh học Mã... nghi n cứu: Đặc tính chế phẩm chitinase từ Penicillium oxalicum 20B ứng d ng cho s n xuất N- acetyl- D- glucosamin Đề tài thực với mục đích n i dung sau: Mục đích đề tài:  Thu nh n chế phẩm chitinase. .. đường uống, tạo điều ki n cho việc sử d ng tiêu thụ hàng ngày ưu điểm l n GlcNAc khơng có tác d ng phụ Vì tác d ng n n N -acetyl- D- glucosamine ứng d ng nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, y học, thực phẩm,