(Luận án tiến sĩ) Vi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồng

Vi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồngVi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồng

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS TS Võ Hành

2 PGS TS Nông Văn Hải

NGHỆ AN - 2018

Để hoàn thành bản luận án này, tôi xin bảy tỏ lòng tôn kính và biết ơn

về sự giúp đỡ hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu của GS.TS Võ Hành, Khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh; PGS.TS Nông Văn Hải

- Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Xin cảm ơn nhiều tới các Quý thầy, cô giáo nguyên là cán bộ khoa Sinh học, Phòng Sau đại học; các cán bộ, kỹ thuật viên của Trung tâm Thí nghiệm thực hành trường Đại học Vinh; Viện Nông hóa thổ nhưỡng Việt Nam

và Viện Hệ gen Việt Nam

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Đình San

và PGS.TS Mai Văn Chung đã tạo điều kiện để tôi tham gia đề tài cấp tỉnh

và đề tài Nafosted, mã số 106-NN.03-2014.22

Tôi cũng xin cảm ơn TS Nguyễn Lê Ái Vĩnh đã giúp tôi trong quá trình

đi thực địa và các ý kiến đóng góp, thảo luận trong quá trình nghiên cứu

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp thuộc Viện Công nghệ Hóa sinh - Môi trường Trường Đại học Vinh, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất

về mặt thời gian để tôi hoàn thành được công trình nghiên cứu Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ về cả vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành bản luận án này

Xin cảm ơn chân thành và thực sự đến tất cả sự giúp đỡ quý báu đó

Nghệ An, tháng 10 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Đức Diện

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghệ An, tháng 10 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Đức Diện

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiển của luận án 2

4 Đóng góp của luận án 2

5 Bố cục luận án 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Lam 4

1.1.1 Vị trí của vi khuẩn Lam trong sinh giới 4

1.1.2 Đặc điểm cơ bản của vi khuẩn Lam 6

1.2 Phân loại vi khuẩn Lam 8

1.2.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Lam 8

1.2.2 Hệ thống phân loại vi khuẩn Lam của Komárek và cộng sự (2014) 10

1.2.3 Tình hình nghiên cứu thành phần loài vi khuẩn Lam trong đất trồng trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.2.4 Danh lục các loài vi khuẩn Lam ở Việt Nam được sắp xếp theo hệ thống phân loại của Komárek và cộng sự (2014) 18

1.3 Vai trò của vi khuẩn Lam trong nông nghiệp 21

1.3.1 Sự cố định nitơ phân tử của vi khuẩn Lam 21

1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Lam trong sản xuất nông nghiệp 25

1.4 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Nghệ An 30

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.2 Địa điểm và thời gian thu mẫu 33

2.2.1 Địa điểm thu mẫu 33

2.2.2 Thời gian thu mẫu 36

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu đất và mẫu vi khuẩn Lam 36 2.4.2 Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu nông hóa thổ nhưỡng 37 2.4.3 Phương pháp kế thừa và lựa chọn hệ thống phân loại vi khuẩn Lam 37 2.4.4 Phương pháp định loại vi khuẩn Lam 37 2.4.5 Phương pháp phân lập một số chủng vi khuẩn Lam 39

2.4.6 Phương pháp phân tích gen cố định nitơ nifD 40

2.4.7 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của dịch huyền phù vi khuẩn

Lam lên một số chỉ tiêu sinh lý sinh trưởng và năng suất lúa 41 2.4.8 Phương pháp thử nghiệm tác dụng của vi khuẩn Lam lên hệ thống

chống ôxy hóa ở lá cây đậu tương 43 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 46

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Đa dạng vi khuẩn Lam trong một số loại đất trồng ở tỉnh Nghệ An 47 3.1.1 Đa dạng thành phần loài 47 3.1.2 Sự đa dạng taxon vi khuẩn Lam các bậc bộ, họ và chi 55 3.1.3 Sự phân bố vi khuẩn Lam ở trong đất lúa và đất trồng cây

công nghiệp trong mối liên quan với một số chỉ tiêu nông hóa 59 3.1.4 So sánh về sự phân bố của Vi khuẩn Lam ở trong đất trồng ở

tỉnh Nghệ An và đất trồng Việt Nam 64 3.2 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Lam từ đất trồng ở Nghệ An 68 3.2.1 Danh lục các chủng vi khuẩn Lam được phân lập 68 3.2.2 Kết quả phân lập một số chủng thuộc các loài vi khuẩn Lam

bổ sung cho danh lục vi khuẩn Lam ở Việt Nam 69 3.2.3 Kết quả phân lập và mô tả một số loài chưa xác định được tên 83 3.2.4 Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn Lam có tế bào dị hình

và nghiên cứu gen quy định tổng hợp nitrogenase của chúng 89

3.3.1 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn Lam Nostoc calcicola

HN9-1a đối với giống lúa Tám thơm 95

3.3.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Lam Nostoc calcicola HN9-1a lên hệ thống chống oxy hóa ở lá cây đậu tương 98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108

1 Kết luận 108

2 Kiến nghị 109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 PHỤ LỤC

Hình 1.1 Sơ đồ ba lãnh giới của sinh giới (Woese và cs 1990) 5

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống vi khuẩn Lam (theo Komárek và cs 2014) 11

Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu đất và mẫu vi khuẩn Lam tại tỉnh Nghệ An 35

Hình 3.1 Sơ đồ định vị trực tiếp các điểm nghiên cứu theo phương pháp CCA 63

Hình 3.2 Ảnh hiển vi của chủng Chroococcus helveticus DT2-01 72

Hình 3.3 Ảnh hiển vi của chủng Jaaginema minimum DP3-01 74

Hình 3.4 Ảnh hiển vi của chủng Pseudanabaena dictyothalla QV3-11 75

Hình 3.5 Ảnh hiển vi của chủng Leptolyngbya carnea DP3-03 76

Hình 3.6 Ảnh hiển vi của chủng Geitlerinema acutissimum TT3-08 78

Hình 3.7 Hình ảnh hiển vi của loài Westiellopsis prolifica phát triển trong trong đất trồng 80

Hình 3.8 Hình ảnh hiển vi của chủng Westiellopsis prolifica DP1-01 nuôi trong môi trường BG-11 81

Hình 3.9 Hình ảnh hiển vi của chủng Nostoc gelatinosum TT3-05 trong đất (A) và trong môi trường BG11 (B - H) 82

Hình 3.10 Hình ảnh hiển vi của chủng Mastigocladus sp QL3-01 phát triển trong trong môi trường BG-11 85

Hình 3.11 Hình ảnh hiển vi của chủng Isocystis sp DP3-11 phát triển trong trong môi trường tự nhiên 87

Hình 3.12 Hình ảnh hiển vi của chủng Isocystis sp DP3-11 phát triển trong trong môi trường BG-11 88

Hình 3.13 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen nifD của các chủng nghiên cứu 91

Hình 3.14 Sự tương đồng về trình tự gen nifD của chủng Nostoc calcicola HN91a với một số chủng từ ngân hàng gen 92

Hình 3.15 Sự tương đồng về trình tự gen nifD của chủng Nostoc linckia Cam-C1 với một số chủng từ ngân hàng gen 92

Hình 3.17 Sự tương đồng về trình tự gen nifD của chủng Nostoc

paludosum ĐT3-02 với một số chủng từ ngân hàng gen 93

Hình 3.18 Sự tương đồng về trình tự gen nifD của chủng Nostoc

ellipsosporum NH2X7 với một số chủng từ ngân hàng gen 93

Bảng 1.1 Số lượng taxon đã gặp của ngành vi khuẩn Lam trong

đất trồng Việt Nam 18

Bảng 1.2 Số lượng taxon đã gặp của ngành VKL tại Việt Nam 20

Bảng 1.3 Tính đặc hiệu của cặp mồi gen nifD đối với một số chủng vi sinh vật 24

Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu đất và mẫu vi khuẩn Lam 33

Bảng 3.1 Danh lục các taxon VKL phân bố trong một số loại đất trồng ở tỉnh Nghệ An 47

Bảng 3.2 Đa dạng hình thái các loài VKL 54

Bảng 3.3 Sự phân bố các taxon VKL trong các bộ 55

Bảng 3.4 Số lượng taxon trong các họ đã gặp 56

Bảng 3.5 Đa dạng các taxon bậc chi 57

Bảng 3.6 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu nông hóa của đất trồng tỉnh Nghệ An 61

Bảng 3.7 So sánh về sự phân bố của VKL trong đất trồng ở tỉnh Nghệ An và Việt Nam 64

Bảng 3.8 Các chủng VKL đã được phân lập từ đất trồng Nghệ An 68

Bảng 3.9 Danh lục các chi và loài VKL bổ sung cho danh lục thành phần loài VKL ở Việt Nam 70

Bảng 3.10 Kết quả phân lập một số chủng thuộc các chi, loài VKL chưa xác định được tên 83

Bảng 3.11 Kết quả phân lập một số chủng VKL có TBDH và không có TBDH từ đất trồng tỉnh Nghệ An 90

Bảng 3.12 Kết quả phân tích khả năng cố định ni tơ của một số chủng VKL có TBDH và không có TBDH từ đất trồng tỉnh Nghệ An 94

Bảng 3.13 Kích thước trung bình của lá đòng cây lúa giai đoạn trước trổ bông 95

Bảng 3.15 Cường độ quang hợp trung bình của cây lúa ở giai đoạn đẻ

nhánh rộ 97 Bảng 3.16 Các yếu tố cấu thành năng suất giống Tám thơm 98

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của dịch chiết Nostoc calcicola HN91a đến

hàm lượng superoxide (O2-) trong lá đậu tương Nam Đàn 99

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của dịch chiết Nostoc calcicola HN91a đến

hàm lượng hydrogen peroxide trong lá cây đậu tương Nam Đàn 101

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của dịch chiết Nostoc calcicola HN91a đến

hoạt độ superoxide dismutase (SOD) trong lá đậu tương Nam Đàn 104

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của dịch chiết Nostoc calcicola HN91a hoạt độ

catalase (CAT) trong lá đậu tương Nam Đàn 105

APX : Ascorbate peroxidase

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi khuẩn Lam (VKL) là vi sinh vật quang tự dưỡng thải oxy - cố định khí cacbonic để tổng hợp nên chất hữu cơ; một số loài VKL có khả năng cố định nitơ phân tử và chúng có thể phát triển thành những thảm VKL trên bề mặt đất, đặc biệt là đất trồng lúa nước Những đặc điểm nổi trội này của VKL

đã góp phần quan trọng duy trì sự bền vững của các hệ sinh thái nông nghiệp

và cũng là mắt xích quan trọng để duy trì các chu trình sinh - địa - hóa VKL trong đất có khả năng tiết các chất nhầy tạo nên một lớp màng, ngăn cản sự thoát hơi nước cho đất, làm đất luôn có độ ẩm, cải tạo pH của đất và các tính chất lí học của đất VKL còn có vai trò to lớn trong việc bổ sung chất hữu cơ tăng độ phì cho đất, chống xói mòn đất và tạo ra các chất có hoạt tính sinh học kích thích sự sinh trưởng và phát triển của thực vật bậc cao

Nhiều công trình trên thế giới đã nghiên cứu lây nhiễm vi khuẩn Lam

cố định đạm (VKLCĐN) vào ruộng lúa đã khẳng định vai trò tích cực của chúng trong việc tăng năng suất lúa Các nghiên cứu trên cho thấy kết quả trung bình năng suất lúa đã tăng lên 15 - 20% đối với các thí nghiệm trên đồng ruộng Một số nghiên cứu còn chỉ ra rằng năng suất lúa như trên sẽ ổn định nếu việc lây nhiễm VKLCĐN được tiến hành liên tục từ 3 - 4 vụ lúa

Ở nước ta, các công trình nghiên cứu về VKL trong đất trồng đã cho thấy chúng gặp nhiều trong đất trồng và thành phần loài cũng thay đổi theo loại đất các vùng địa lý

Riêng ở Nghệ An, cho đến nay chưa có một công trình nào nghiên cứu

về sự đa dạng VKL trong các loại hình đất trồng một cách đầy đủ và có hệ thống Mặt khác, điều đáng lo ngại hiện nay là việc sử dụng phân bón hóa học

và các loại chế phẩm khác trong nông nghiệp một cách thiếu kiểm soát đang gây ra những tác động tiêu cực đối với chất lượng đất, chất lượng môi trường

và chất lượng nông sản Do đó, việc tìm kiếm các biện pháp, trong đó có việc điều tra, phân lập một số chủng VKLCĐN để cải tạo đất trồng đang là yêu cầu bức thiết của nhiều địa phương, trong đó có tỉnh Nghệ An

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi

tiến hành đề tài “Vi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình

đất trồng ở tỉnh Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồng trọt”

2 Mục tiêu

Mục tiêu của của đề tài nhằm nghiên cứu sự đa dạng VKL trong đất trồng tỉnh Nghệ An, phân lập và thăm dò khả năng cố định nitơ một số chủng đồng thời đánh giá vai trò của chúng đối với một số loại cây trồng (lúa và đậu tương)

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiển của luận án

+ Ý nghĩa thực tiển:

Luận án bước đầu đã đánh giá được vai trò tích cực của chủng VKL

Nostoc calcicola HN91a đối với năng suất giống lúa Tám thơm cũng như khả

năng phòng vệ của giống Đậu tương Nam Đàn

4 Đóng góp của luận án

- Mô tả 1 chi Isocystis và 7 loài bổ sung cho danh lục VKL Việt Nam

- Xây dựng được bộ sưu tập gồm 13 chủng thuộc 13 loài VKL được phân lập từ đất trồng tỉnh Nghệ An đồng thời thăm dò được khả năng cố định

nitơ của 5 chủng thông qua gen nifD

- Bước đầu đánh giá được vai trò của 1 chủng VKL Nostoc calcicola

HN91a lên khả năng thích nghi và phòng vệ của Đậu tương khi stress oxy hóa

5 Bố cục luận án

Luận án bao gồm 130 trang với 24 bảng số liệu, 21 hình và 172 tài liệu tham khảo và được cấu trúc như sau:

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 trang Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 61 trang

Phụ lục: gồm có 4 phụ lục, trong đó có 2 phụ lục danh lục VKL trong đất và VKL trong các loại hình môi trường ở Việt Nam sắp xếp theo hệ thống Komárek và cộng sự, 1 phụ lục trình bày ảnh hiển vi các loài VKL và 1 phụ lục trình tự nucleotit của gen NifD của 5 chủng VKL có TBDH

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Lam

1.1.1 Vị trí của vi khuẩn Lam trong sinh giới

Giới (Regnum) là một bậc trong loại bậc phân loại lớn nhất, bao gồm những sinh vật có chung đặc điểm nhất định Vậy có bao nhiêu giới sinh vật? Đây là câu hỏi thật khó trả lời một cách chính xác

Hệ thống phân loại của Linnaeus (1737, 1753) chia tất cả sinh vật thành 2 giới: Thực vật và Động vật, tác giả đã chọn đặc điểm của cơ quan sinh sản làm tiêu chuẩn phân loại, mặt khác Linnaeus đã đề xuất cách đặt tên kép (Binomial naming system) đối với các loài thực vật bằng tiếng Latin - đó là cách đặt tên hợp lý mà ngày nay chúng ta đang sử dụng Đến năm 1866 Haeckel chia sinh vật làm 3 giới gồm Protista, Thực vật và Động vật Vào năm 1937, Chatton chia sinh vật làm hai trên giới (superkingdoms)

là trên giới Prokaryota và trên giới Eukaryota, trong đó tảo được xếp vào

cả hai trên giới

Hệ thống phân loại 4 giới của Copeland (1956) gồm giới sinh vật phân cắt hoặc Khởi sinh (Monera), giới Nguyên sinh (Protista), giới Thực vật (Plantea), giới Động vật (Animalia), trong đó xếp toàn bộ tảo vào giới Nguyên sinh (Protista) cùng với Nấm và Động vật nguyên sinh

Hệ thống phân loại 4 giới của Gordon (1975) gồm giới tiền nhân (Prokaryota), giới Thực vật (Plantea), giới Nấm (Fungi), giới Động vật (Animalia) ông đã bỏ giới Nguyên sinh (Protista) và xếp nó vào giới Thực vật

Hệ thống phân loại 5 giới của Whittaker (1969) gồm giới Khởi sinh (Monera), giới Nguyên sinh (Protista), giới Nấm (Fungi), giới Thực vật (Plantae) và giới Động vật (Animalia), trong đó thực vật nổi xếp vào giới

Nguyên sinh (Protista), còn tảo đỏ, tảo nâu và một số tảo lục lại được xếp vào giới Thực vật (Plantea)

Hệ thống phân loại 5 giới của Margulis (1978) gồm giới tiền nhân (Prokayota) tức sinh vật phân cắt có Vi khuẩn và Vi khuẩn cổ, 4 giới còn lại gồm giới Nguyên sinh (Protista), giới Nấm (Fungi), giới Thực vật (Plantae), giới Động vật (Animalia), trong đó xếp toàn bộ tảo vào giới Nguyên sinh (Ptotista) [26]

Hình 1.1 Sơ đồ ba lãnh giới của sinh giới

(Woese và cs 1990) [159]

Hệ thống phân loại của Woese và cộng sự (1990) đã chia sinh giới thành 3 lãnh giới: lãnh giới Vi khuẩn (Bacteria), lãnh giới Vi sinh vật cổ (Archaea) và lãnh giới Sinh vật có nhân thật (Eukarya) Trong đó, VKL thuộc lãnh giới Vi khuẩn [159]

Ngày nay, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử dẫn đến sự thay đổi vị trí các ngành trong các giới khác nhau, vì vậy quan điểm trên của Woese (1990) [159] về số lượng các giới có thể ngày càng nhiều hơn

1.1.2 Đặc điểm cơ bản của vi khuẩn Lam

VKL là những cơ thể mà tế bào của chúng chưa có nhân điển hình, không có màng nhân, vật chất di truyền được tập trung trong chất nhân, DNA tạo thành một sợi duy nhất khép lại thành vòng [69]

Khác với vi khuẩn, VKL sống tự dưỡng, có màu xanh lam do chứa diệp lục a, phycoxian màu lam và phycoerytrin màu đỏ (thuộc nhóm biliprotein) Trong quá trình quang hợp, chúng thải O2 ra môi trường ngoài Cùng với Prochlorales, VKL xếp vào nhóm vi sinh vật quang tự dưỡng [141]

Hình dạng tế bào sinh dưỡng của VKL đa dạng: hình cầu, elíp rộng hay hình elíp kéo dài, hình quả lê, hình trứng, dạng hình thoi, hình ống

Màng tế bào VKL có cấu tạo tương tự như màng tế bào vi khuẩn gram

âm (Gram-negative bacteria) Lớp trong cùng là peptidoglycan (murein), lớp ngoài cấu tạo bởi protein và liposacarit Một số loài VKL có màng tế bào hoá nhầy hoặc hình thành bao nhầy chuyên hoá bao quanh tế bào, nhóm tế bào hay toàn bộ dãy tế bào (sợi) Bao có thể đồng nhất hay phân lớp

Chất nguyên sinh của tế bào VKL đậm đặc hơn tế bào thực vật khác, nó không chuyển động và chứa rất ít không bào Trong tế bào của VKL thường

có không bào khí Không bào khí nhằm giúp cho chúng dễ trôi nổi trong nước Đôi khi không bào khí chỉ xuất hiện trong một số tế bào của sợi, có tác dụng phóng xuất tảo đoạn ra khỏi bao Thực nghiệm đã chứng tỏ rằng sự xuất hiện các không bào khí này có liên quan tới sự giảm thiểu lượng dưỡng khí hòa tan trong môi trường và sự bổ sung vào trong môi trường sản phẩm của

sự lên men sinh học [39], [41], [62]

VKL có thể là những dạng đơn bào, tập đoàn hay dạng sợi Dạng đơn bào có thể hình cầu, hình trụ hoặc hình elíp, có hoặc không có màng nhầy

VKL dạng tập đoàn thường có dạng hình cầu, hình trụ, hình elíp đôi khi dạng bản hay dạng khối còn những cơ thể dạng sợi có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh

Dạng sợi đơn giản không phân nhánh gồm một dãy tế bào là đặc điểm

của Lyngbya, Anabaena và Nostoc Ở một số chi trichom không có bao (Oscillatoria, Spirulina), số khác có bao nhưng chỉ chứa một trichom (Phormidium, Lyngbya) hoặc có nhiều trichom (Microcoleus, Schizothrix) Tế

bào đầu ngọn hay gốc của trichom ở một số loài có hình dạng khác nhau, đó

là một trong những đặc điểm giúp ta phân loại về mặt hình thái Dạng sợi phân nhánh gồm có các kiểu: phân nhánh thực và phân nhánh giả Phân nhánh thực là đặc điểm của VKL thuộc họ Hapalosiphonaceae Sự phân nhánh thực được xảy ra từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của trichom, nó phân chia theo chiều dọc, sau đó một trong những tế bào con mới hình thành tạo mấu lồi ở phía bên và tiếp tục phân chia theo hướng đó Kiểu này thường gặp trong các

chi Hapalosiphon, Fischerella, Westiellopsis

Phân nhánh giả thường gặp ở các chi Plectonema, Scytonema,

Tolypothrix… Đó là khi ở trong bao, trichom bị đứt đoạn, sau đó hai đầu đoạn

đứt mới hình thành tế bào phân chia, chọc thủng bao chui ra ngoài cho hai nhánh giả, trường hợp đó là sự phân nhánh đôi; còn nếu một đầu sợi chui ra khỏi bao, đầu kia vẫn ở trong bao thì được gọi là phân nhánh đơn [38], [99]

Nhiều loài VKL dạng sợi có tế bào dị hình (TBDH) (heterocysts) ở đầu tận cùng của sợi hoặc giữa sợi Đó là những tế bào đặc biệt có kích thước lớn hơn tế bào sinh dưỡng Màng của chúng có hai lớp, nội chất màu vàng nhạt chứa rất ít sắc tố, không chứa không bào khí và các hạt dự trữ Nơi tiếp xúc giữa tế bào dị hình với tế bào sinh dưỡng có một hạt gọi là hạt cực (polar granule) có tính chiết quang cao [54] TBDH có thể đơn độc hay nối tiếp nhau thành chuỗi Chức năng của TBHD là nơi diễn ra quá trình cố định N2, sinh sản và là cơ quan liên kết, điều hoà quá trình hình thành bào tử [141] Hầu hết những VKL có khả năng có định N2 đều có TBDH Nhiều loài đơn bào hay dạng sợi không có TBDH cũng có khả năng này [50], [143], [144], [148]

Trong chu trình sống, VKL không có giai đoạn nào mang roi và không có sinh sản hữu tính Hình thức duy nhất là sinh sản vô tính Thông thường là phân chia tế bào làm đôi hoặc nhờ sự hình thành tảo đoạn (hormogonia), nội bào tử (endospore), ngoại bào tử (exospore) hoặc bảo tử nghỉ (ankinete) [67], [101]

1.2 Phân loại vi khuẩn Lam

1.2.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Lam

Phân loại học (Taxonomy) là khoa học về mô tả, phân biệt, đặt tên các sinh vật, góp nhóm thành các taxon, sắp xếp các taxon theo hệ thống tôn ti trật

tự (Hierachy) Phân loại học là cơ sở của các ngành khoa học trong lĩnh vực sinh học, nó đồng thời là một bộ phận của Hệ thống học

Hệ thống học (Systematics) là khoa học về đa dạng sinh vật cùng tất cả

và từng mối quan hệ qua lại giữa chúng với nhau nhằm xây dựng Hệ thống phát sinh chủng loại (Phylogeny) hay Hệ thống tiến hóa (Evolution System) của từng nhóm hay toàn bộ thế giới sinh vật Hệ thống học là khoa học cơ sở đồng thời là khoa học tổng hợp cao nhất về hệ thống tri thức ở mọi mức độ về sinh học [26]

Loài phân loại (Taxonomical species) hay còn gọi là loài hình thái - địa

lý (Geo - morphological species): dựa trên quan điểm về mối quan hệ nhân quả giữa hình thái và địa lý trong quá trình hình thành các đặc điểm của loài

mà Grant (1957, 1963) đã đưa ra khái niệm loài phân loại, thường được gọi là loài hình thái địa lý Theo quan điểm này, loài là một đơn vị phát sinh chủng loại gồm một hay nhiều nhóm sinh vật có nguồn gốc chung, có tổ hợp các đặc điểm giống nhau và phân biệt với các loài khác bởi các đặc điểm, trong đó sự ngắt quãng về hình thái địa lý là tiêu chuẩn đầu tiên có tính quyết định trong việc phân biệt loài [26]

Xuất phát từ những quan điểm khác nhau từ trước đến nay đang tồn tại nhiều hệ thống phân loại VKL tuỳ theo mỗi mức độ nghiên cứu Công trình

nghiên cứu phân loại VKL đầu tiên đã được Agardhi (1824), Kuetzing (1843) tiến hành, và hệ thống phân loại VKL do Thuret (1875) đặt nền móng, về sau được Kirchner (1900) phát triển thêm Sự sửa đổi và bổ sung hệ thống phân loại của Thuret và Kirchner được bắt đầu thực hiện vào đầu thế kỷ XX và tiếp sau đó có nhiều công trình phân loại VKL của các nhà tảo học đã khiến cho tri thức về VKL được tăng tiến rất nhiều [67], [128], [141]

Theo hệ thống của Geitler (1932) theo [95] tảo Lam có một lớp (Cyanophyceae) gồm 4 bộ: Chroococcales, Dermocarpales, Nostocales và Hormogonales

Hệ thống của Desikachary (1959): tảo Lam được chia thành 5 bộ: Chroococcales, Chamaesiphonales, Pleurocapsales, Nostocales và Stigonematales [67]

Hệ thống phân loại của Golerbackh (1977) [168] đã chia Ngành tảo Lam thành 10 bộ, thuộc 3 lớp: Chroococcophyceae, Chamaesiphonophyceae

và Hormogoniophycecae

Stanier và Cohen - Bazire (1977) [141], cho rằng VKL gồm 27 chi của 6 phân nhóm (Subgroup): Chroococcocean, Pleurocapsalean, Oscillatorian, Nostocalean, Rivularean và Stigonematalean Cơ sở của sự phân chia này chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái ở các giai đoạn phát triển cá thể của các chủng VKL trong nuôi trồng như đơn bào hay đa bào, có TBDH hay không có TBDH,

sự hình thành và vị trí của TBDH, phân nhánh thật hay phân nhánh giả

Rippka và cộng sự (1979) [128] dựa trên các đặc điểm sinh trưởng, kiểu phân chia tế bào, quang dị dưỡng, khả năng tổng hợp nitrogenase trong điều kiện kị khí hay hiếu khí, sự tồn tại của c- phicocyanin, sống ở môi trường nước ngọt hay nước mặn đã chia VKL thành 5 nhóm gồm 22 chi

Trong những năm gần đây, Komárek và cộng sự đã lần lượt xuất bản 3 tập sách phân loại VKL ở miền Trung Châu Âu (Komárek & Anagnostidis

1999, 2005, Komárek 2013) [96], [97], [94] Trong bộ sách này, VKL được chia thành 3 bộ: Chroococcales, Oscillatoriales và Nostocales Đồng thời, các tác giả có chỉnh sửa hoặc gợi ý về phân loại đối với các loài ngoài Châu Âu, bao gồm cả các vùng nhiệt đới Hiện nay, bộ sách này là tài liệu phân loại được biên soạn đầy đủ nhất để phân loại các taxon bậc loài theo phương pháp phân loại hình thái

1.2.2 Hệ thống phân loại vi khuẩn Lam của Komárek và cộng sự (2014)

Gần đây, Komárek và cộng sự (2014) đã tổng hợp tất cả thành tựu nghiên cứu phân loại VKL từ trước tới nay và đặc biệt quan tâm đến các tiêu chí phân loại bằng sinh học phân tử và đã phân chia VKL thành 8 bộ: Gloeobacterales, Synechococcales, Spirulinales, Chroococcales, Pleurocapsales, Chroococcidiopsidales, Oscillatoriales và Nostocales Một số taxa bậc họ và chi cũng được đề xuất sắp xếp hợp lý hơn dựa vào các kết quả nghiên cứu nguồn gốc phát sinh bằng sinh học phân tử [98] (hình 1.2.)

Bộ Gloeobacterales

Các tế bào hình cầu hoặc hình que, có hạt ở 2 cực tế bào, sống đơn độc hoặc tạo thành đám trong khối nhầy Bộ Gloeobacterales chỉ có 1 họ

(Gloeobacteraceae) và 1 chi (Gloeobacter); tạo thành một nhánh riêng trên

cây chủng loại phát sinh

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống vi khuẩn Lam (theo Komárek và cs 2014) [98]

Bộ Spirulinales

Chỉ gồm 1 họ là Spirulinaceae Có cấu tạo dạng sợi xoắn, không có bao, các thylakoid sắp xếp dọc theo thành tế bào Tạo thành một nhánh riêng trên cây chủng loại phát sinh

Bộ Chroococcales

Bộ Chroococcales gồm các loài đơn bào Tế bào có dạng hình cầu; thylakoid sắp xếp theo nhiều kiểu khác nhau So với hệ thống phân loại trước đây, bộ Chroococcales hiện nay không bao gồm các loài đơn bào có sinh nội bào tử Đến nay, nhiều họ của bộ này chưa được phân tích sinh học phân tử

Bộ Pleurocapsales

Bộ Pleurocapsales bao gồm các loài đơn bào hoặc có cấu trúc giả sợi,

có sinh nội bào tử

Bộ Oscillatoriales

Bộ Oscillatoriales bao gồm các loài có cấu trúc sợi, không sinh tế bào

dị hình So với hệ thống phân loại trước đây, bộ Oscillatoriales hiện nay không bao gồm các loài dạng sợi mà chiều rộng của tế bào rất hẹp và thylakoid sắp xếp dọc theo thành tế bào (bộ Synechococcales, và Spirulinales)

Từ lâu phương pháp phân loại tảo nói chung và VKL nói riêng chủ yếu vẫn dựa vào đặc điểm của tản, cấu trúc tế bào, đặc điểm sinh sản, hình thái phát triển cá thể, các sản phẩm dự trữ dưới góc độ bản chất hoá học, thành

phần chất màu với các phổ khác nhau, các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá Từ nửa cuối thế kỷ XX trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã

mở ra phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại tảo và VKL đó là phương pháp phân loại phân tử Phương pháp này đã ứng dụng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử và công nghệ gen vào mục đích nghiên cứu đa dạng sinh học, nghiên cứu về mối quan hệ và tiến hoá giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại Mặc dù mới ra đời nhưng nó đã sớm trở thành một phương pháp nghiên cứu rất có hiệu quả

Ở nước ta, phương pháp phân loại phân tử đã được một số tác giả

áp dụng khi nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau: Hoàng Phương Hà

và cộng sự (2003) [6]; Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2002) [14]; Hồ Sỹ Hạnh, Võ Hành, Đặng Diễm Hồng (2006) [9] sử dụng kỹ thuật RAPD-

PCR để phân loại phân tử 5 loài, dưới loài VKL thuộc chi Calothrix và

Hồ Sỹ Hạnh, Võ Hành, Đặng Diễm Hồng, Dương Đức Tiến (2005) [10] tiến hành đọc trình tự nucleotide đoạn 16S rDNA đối với chi

Westiellopsis phân lập được từ đất trồng của tỉnh Đăk Lăk bước đầu thu

nhận được những kết quả khả quan

Tuy vậy, cần phải nói rằng phương pháp phân loại truyền thống luôn vẫn được sử dụng rộng rãi trong các công trình nghiên cứu phân loại VKL của các tác giả trên thế giới và trong nước từ trước tới nay [20], [22], [36], [39], [40], [45], [67], [78], [166], [171] vì nó phù hợp với điều kiện thực tế

1.2.3 Tình hình nghiên cứu thành phần loài vi khuẩn Lam trong đất trồng trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới

Người đầu tiên đặt nền móng nghiên cứu tảo đất (trong đó có VKL), với nhiều mặt của nó là Bristol-Roach (1920) [theo [170]] Bà đã đề ra phương pháp nghiên cứu tảo đất (định tính cũng như định lượng), đánh giá

về khả năng tồn tại, sinh trưởng và phát triển của chúng cũng như đưa ra những số liệu đầu tiên về vai trò của tảo trong đất Từ những năm đầu của thế kỷ XX, ở Châu Âu, trường phái tảo đất của Liên Xô (cũ) phát triển mạnh mẽ Các công trình tập trung nghiên cứu theo hướng: điều tra thành phần và số lượng tảo trong đất; quy luật phân bố cũng như động thái phát triển của chúng trong các loại đất trồng trọt; đồng thời tìm hiểu mối quan

hệ của chúng với các yếu tố của môi trường và vai trò của tảo đất; nghiên cứu sinh lí, sinh hoá, khả năng cố định nitơ của chúng Các hướng nghiên cứu về tảo đất đều định hướng cho sự phát triển nông nghiệp, nhất là những loài có khả năng bổ sung nguồn đạm cho đất, kích thích sinh trưởng đối với cây trồng [170], [172]

Ở châu Á, Nhật Bản và Ấn Độ là các nước đã đạt được nhiều thành tựu

về nghiên cứu VKL trong đất, nhất là trong các lĩnh vực sinh thái, sinh lý, khả năng cố định N2 và sử dụng chúng làm nguồn phân bón sinh học để cải tạo đất nông nghiệp nhằm tăng năng suất cây trồng [67]

Desikachary (1959) [67] tiến hành nghiên cứu khu hệ VKL ở Ấn Độ trong nhiều năm, kết quả đã xác định được 750 loài thuộc 85 chi, trong đó có

70 loài lần đầu tiên được phát hiện ở nước này (chiếm 22% số loài của khu hệ), 580 loài còn lại thì có 100 loài phân bố toàn cầu (cosmopolitan) và 45 loài phân bố rộng (chiếm gần 20% khu hệ)

Watanabe (1959) [155] đã tiến hành nghiên cứu nhiều vùng khác nhau của Nam và Đông Á Trong số 851 mẫu đất, đã tìm thấy 46 loài có khả năng

cố định nitơ, chúng thuộc các chi: Tolypothrix, Nostoc, Cylindrospermum,

Calothrix, Anabaena, Plectonema, Anabaenopsis và Schizothrix Theo tác

giả, VKL có nhiều ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới như Indonesia, Philippin, Malaixia, Đông Dương, Thái Lan, Hải Nam, Đài Loan và Hoa Nam nhưng ít thấy ở Nhật Bản, Hoa Bắc, đông Bắc Trung Quốc, Triều Tiên và Xakhalin

Gregorio (1963) [78] công bố kết quả nghiên cứu khu hệ VKL tại Philippin với 162 loài và 3 dạng, thuộc 33 chi, 8 họ Ưu thế thành phần loài thuộc về dạng sợi không phân nhánh và không có TBDH

Zhang và cộng sự (2011) khi nghiên cứu VKL trong đất cát sa mạc tại Gurbantunggut, Trung Quốc đã phát hiện ra 51 loài VKL trong đó 75% thuộc

về dạng sợi [164]

Shariatmadari và cộng sự (2013) khi nghiên cứu mẫu thu thập từ 7 tỉnh trồng lúa chính nằm trong vùng đất ẩm ướt và bán khô cằn của Iran đã phát hiện 49 loài và dưới loài VKL có TBDH, trong đó ưu thế thuộc về chi

Anabaena và Nostoc [137]

Vijayan và cộng sự (2015) khi nghiên cứu vùng đất trồng lúa Kuttanad, Kerala, Ấn Độ đã phát hiện ra 64 loài và dưới loài VKL trong đó ưu thế thuộc

về bộ Oscillatoriales (chiếm 38% tổng số loài được phát hiện) [153]

Lin và cộng sự (2013) khi nghiên cứu sự đa dạng của tảo trong 5 loại đất nông nghiệp tại Đài Loan đã phát hiện ra 21 loài và dưới loài VKL trong

đó chi ưu thế thuộc về Oscillatoria đã phát hiện 6 loài và dưới loài [106]

Một số tác giả khác đi sâu nghiên cứu đặc điểm hình thái trong các giai đoạn phát triển cá thể, nhất là các loài VKL dạng sợi phân cực có TBDH (Aziz, 1998 theo [46], Sanchis và cộng sự 2004 [134]) hoặc thăm dò đặc tính chịu nhiệt của VKL ở vùng nhiệt đới (Abed và cộng sự, 2003 theo [47]) và tiến hành phân lập, nuôi trồng chúng (Curdy và cộng sự, 1974 [63]); nghiên cứu sự hình thành và đặc tính vận động của hormogonia ở một số loài VKL (Kozyakov và cộng sự, 1972 [99])

Ở Việt Nam

Các dẫn liệu về VKL trong đất dã được Cao Ngọc Phương (1964 [167] khi nghiên cứu VKL sát mặt đất Sài Gòn và Đà Lạt, tác giả công bố 23 taxon trong đó có 11 chi với 2 chi có TBDH, 9 chi không có TBDH, 2 loài

và dưới loài mới cho khoa học: Phormidium vietnamensis và Gloecapa

punctata var phamhoangii

Kết quả điều tra VKL ở đồng bằng châu thổ sông Mê Kông, Phùng Thị Nguyệt Hồng và cộng sự (1992) [166] đã công bố công trình của mình bằng tiếng

Pháp với 94 taxa bậc loài, trong đó có một loài mới cho khoa học: Tolypothrix

hatienensis, và ba thứ mới: Anabaena variabilis var vietnamensis, Hapalosiphon parvulus var minor và Hapalosiphon welwitschii var vietnamensis

Dương Đức Tiến (1977) [37] đã công bố 13 loài VKL thuộc 6 chi với đặc điểm phân loại và khả năng cố định N2 của chúng Trần Văn Nhị và cộng

sự (1984) [31] đã nâng tổng số VKL cố định N2 ở Việt Nam lên 40 taxon, gồm 17 chi trong đó 16 chi có TBDH và 1 chi dạng sợi không có TBDH

Trên vùng đất mặn huyện Thái Thụy (Thái Bình), Đoàn Đức Lân và cộng sự (1994) [25] đã phân lập được 15 loài VKLCĐN và nghiên cứu thăm

dò khả năng cố định nitơ tự do của chúng So với kết quả khảo sát tại ruộng lúa vùng đất ngọt thì VKL cố định N2 ở vùng đất mặn có phần kém đa dạng

hơn nhưng chi Nostoc vẫn chiếm ưu thế

Nghiên cứu vi tảo và VKL trong đất ngoại thành Hà Nội và vùng phụ cận, Nguyễn Thị Minh Lan và cộng sự (2000, 2001) [23], [24] phát hiện được

50 loài thuộc 19 chi trong 5 bộ Ưu thế thuộc về chi Nostoc và Anabaena,

đồng thời đã phân lập một số chủng VKL nhằm thăm dò khả năng cố định N2của chúng Nguyễn Quốc Hùng (2001) [16] công bố 103 loài và dưới loài vi tảo, trong đó VKL có 80 loài và dưới loài thuộc 20 chi của 4 bộ

Ở khu vực Bắc Trung Bộ, Đỗ Thị Trường và Võ Hành (1999) [44] đã phát hiện được 45 loài và dưới loài VKL, chúng thuộc 16 chi, 6 họ, 2 bộ ở trong đất trồng lúa huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Nghiên cứu tại vùng đất trồng lúa huyện Thạch Hà (Hà Tĩnh), Nguyễn Lê Ái Vĩnh và Võ Hành (2001) [45] ghi nhận 69 loài và dưới loài thuộc 15 chi, 5 họ, trong đó có

3 chi dạng đơn bào, 5 chi dạng sợi có TBDH, 7 chi có TBDH Võ Hành và cộng sự (2012) đã thống kê được 63 loài và 17 dưới loài VKL trong các thủy vực nước ngọt Bắc Trung Bộ [11], Lê Thị Thúy Hà và cộng sự (2016) đã công bố 82 loài và dưới loài khi nghiên cứu đất trồng lúa nước huyện Cẩm Xuyên tỉnh Hà Tĩnh [83]

Kết quả của nhiều năm điều tra quan sát, phân tích môi trường sinh thái

và bằng phương pháp nuôi trồng, Dương Đức Tiến (2000) [40] đã thống kê được 314 loài tảo đất, trong đó có 117 loài VKL (tuy nhiên, ở công trình này, tác giả không đề cập đến danh lục tảo đất cụ thể) Ông cũng cho thấy trong các loại hình đất trồng lúa, đất trồng màu, đất đồi và đất hoang hoá thì số lượng loài trong đất trồng lúa nhiều hơn cả Mặt khác, sự phân bố về thành phần và số lượng loài thay đổi theo độ sâu trong đất

Hồ Sỹ Hạnh (2010) [8] tiến hành điều tra thành phần VKL trong các loại hình đất trồng ở tỉnh Đắk Lắk đã công bố 129 loài và dưới loài: 62 loài và dưới loài trong đất trồng lúa; 46 loài và dưới loài ở đất trồng bông và 23 loài

và dưới loài ở đất trồng cà phê Có thể nói đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu VKL trong các loại hình đất ở Tây Nguyên nói chung và Đắk Lắk nói riêng một cách có hệ thống

Cùng với công tác điều tra, những nghiên cứu chuyên sâu tìm hiểu đặc tính sinh lý, sinh hoá về một số chủng VKL có ý nghĩa thực tiễn ở Việt Nam được tiến hành bởi nhiều tác giả: Nguyễn Đức và cộng sự (1984, 1985) [4], [5]; Trần Văn Nhị, Trần Hài, Đặng Diễm Hồng, Dương Đức Tiến (1984) [31]; Trần Văn Nhị và cộng sự (1986, 1994) [33], [32]; Đặng Đình Kim (1993) [18]; Trần Đăng Kế (1993) [17]; Trần Văn Tựa (1993) [42], Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) [43]; Trần Hài (1996) [7]; Trần Văn Nhị (1998) [30]; Võ Hành, Đỗ Thị Trường (2001) [12] Nghiên cứu VKL trong vùng rễ lúa và lây nhiễm các chủng có khả năng cố định N2 có các tác giả

Dương Đức Tiến (1977) [37]; Nguyễn Thanh Hiền và cs (1994) [13]; Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Hữu Thước (1987) [15]

1.2.4 Danh lục các loài vi khuẩn Lam ở Việt Nam được sắp xếp theo

hệ thống phân loại của Komárek và cộng sự (2014)

Danh lục các loài VKL trong đất trồng ở Việt Nam

Chúng tôi đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về VKL trong đất trồng ở Việt Nam từ 2010 trở về trước và xếp chúng theo hệ thống phân loại của Komárek và cs (2014) (cần phải nói rằng việc tổng hợp các loài VKL trong đất trồng ở Việt Nam đã được công bố là việc làm rất khó khăn vì phần lớn các công trình đã công bố chủ yếu mang tính tổng hợp, ít đưa ra danh lục loài nên chắc chắn số lượng thống kê của chúng tôi chưa được đầy đủ Nhưng với cách tiếp cận về hệ thống phân loại của Komárek như đã nêu ở trên, chúng tôi mạnh dạn tổng hợp để có cơ sở so sánh trong nghiên cứu của mình)

Kết quả tổng hợp cho thấy, trước năm 2010 VKL trong các loại hình đất trồng của Việt Nam đã xác định được 172 loài và dưới loài thuộc 50 chi,

21 họ của 5 bộ (Bảng 1.1, Phụ lục 1)

Bảng 1.1 Số lượng taxon đã gặp của ngành vi khuẩn Lam

trong đất trồng Việt Nam

Họ Chi Loài

Bộ Số

lượng Tỉ lệ %

Số lượng Tỉ lệ %

Số lượng Tỉ lệ % Synechococcales 5 23,81 12 24 28 16,30

Chroococcales 5 23,81 6 12 17 9,88 Oscillatoriales 3 14,29 10 20 50 29,07

Tổng cộng 21 100 50 100 172 100

(Danh lục cụ thể ở Phụ lục 1)

VKL dạng sợi không có TBDH được tìm thấy trong đất trồng ở Việt Nam cho đến năm 2010 xếp theo hệ thống phân loại của Komárek và cs (2014) có 97 loài và dưới loài, chúng thuộc 4 bộ (Synechococcales, Spirulinales, Chrooccocales và Oscillatoriales), 14 họ (Synechococcaceae, Merismopediaceae, Pseudanabaenaceae, Leptolyngbyaceae, Schizotrichaceae, Spirulinaceae, Microcystaceae, Aphanothecaceae, Cyanothrichaceae, Gomphosphaeriaceae, Chroococcaceae, Coleofasciculaceae, Microcoleaceae

và Oscillatoriaceae) và 29 chi (Rhabdogloea, Synechococcus, Aphanocapsa,

Merismopedia, Synechocystis, Jaaginema, Pseudanabaena, Leptolyngbya, Phormidesmis, Planktolyngbya, Trichocoleus, Schizothrix, Spirulina, Microcystis, Gloeothece, Johannesbaptistia, Gomphosphaeria, Chroococcus, Gloeocapsa, Geitlerinema, Arthrospira, Kamptonema, Oxynema, Microcoleus, Planktothrix, Porphyrosiphon, Lyngbya, Oscillatoria và Phormidium) Trong

số 97 loài, có 42 loài được Komárek và cộng sự chỉnh sửa và chuyển sang các chi khác; những chi này chủ yếu được thành lập từ năm 1988 đến nay như là:

Jaaginema (1988), Leptolyngbya (1988), Planktolyngbya (1988), Planktothrix

(1988), Geitlerinema (1989), Trichocoleus (2001), Phormidesmis (2009),

Oxynema (2012), Kamptonema (2014)

Cũng theo hệ thống này, VKL có TBDH tìm thấy trong đất trồng ở Việt Nam đến năm 2010 có 63 loài và 12 dưới loài [3] Chúng thuộc 21 chi, 7 họ, 1 lớp Trong số đó, có 6 loài được gộp vào loài khác bởi có cùng đặc điểm phân loại:

Scytonema julianum gộp vào Scytonema drilosiphon, Hapalosiphon fontinalis gộp

vào Hapalosiphon pumilus, Anabaenopsis raciborskii gộp vào Anabaenopsis

cunningtonii, Nostoc spongiaeforme gộp vào Nostoc carneum, Nostoc entophytum

gộp vào Nostoc paludosum và Nostoc piscinale gộp vào Nostoc linckia

Có 8 loài được chuyển sang chi khác: Tolypothrix byssoidea chuyển sang chi Hassallia, Anabaena ambigua chuyển sang Wollea, Anabaena

fuellebornii chuyển sang Macrospermum, Anabaena volzii chuyển sang Macrospermum, Anabaena variabilis chuyển sang Trichormus, Anabaena doliolum chuyển sang Trichormus, Anabaena khannae chuyển sang Trichormus và Anabaena isocystoides chuyển sang Trichormus

Danh lục thành phần loài VKL trong đất trồng và nước ngọt ở Việt Nam

Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đây, chúng tôi nhận thấy rằng việc phân chia sự phân bố của VKL ở trong đất và trong nước là rất khó khăn

và dường như không có ranh giới rõ ràng Để thuận lợi hơn cho việc so sánh

về thành phần loài VKL được định loại trong đề tài này với thành phần loài VKL đã được tìm thấy trong đất và nước ngọt ở Việt Nam, chúng tôi đã tiếp tục tổng hợp một cách đầy đủ hơn bao gồm cả trong đất trồng và trong nước ngọt Kết quả tổng hợp chi tiết được trình bày ở Phụ lục 2; số liệu tổng hợp được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Số lượng taxon đã gặp của ngành VKL tại Việt Nam

Tỉ lệ

%

Số lượng

So sánh kết quả tổng hợp trong Bảng 1.1 và Bảng 1.2 cho thấy, trong

số 393 loài đã tìm thấy trong cả hai loại môi trường sống thì chỉ có 172 loài tìm thấy trong đất trồng (43,6%) Mặc dù số lượng công trình điều tra về VKL trong đất trồng ít hơn nhiều so với trong môi trường nước nhưng kết quả này phần nào chứng minh rằng đất trồng cũng là môi trường ưa thích của VKL

1.3 Vai trò của vi khuẩn Lam trong nông nghiệp

1.3.1 Sự cố định nitơ phân tử của vi khuẩn Lam

Vai trò nông học của VKL trực tiếp gắn liền với khả năng cố định nitơ, tức là quá trình khử nitơ phân tử khí quyển thành NH4

+ của một số loài VKL,

và sau đó chúng được sử dụng cho quá trình tổng hợp amino acide và protein Sau khi VKL chết thì sự khoáng hoá và nitrat hoá tiếp theo để bổ sung nguồn đạm cho đất và cung cấp cho thực vật bậc cao Chính vì vậy sự màu mỡ tự nhiên của đất ruộng lúa chính nhờ VKL cố định nitơ [22], theo Zenova và cộng sự (1995) [163] đất đai là môi trường sống quan trọng nhất của VKL

VKL là nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng có mặt ở mọi nơi trên trái đất

và chúng là những vi khuẩn sản xuất thứ cấp quan trọng trên toàn cầu VKL tiến hóa cùng với lịch sử của trái đất và chúng đóng vai trò quan trọng trong tiến hóa của sự sống nhờ khả năng tạo oxy Sản phẩm thứ cấp được tạo ra bởi VKL là nhờ khả năng sử dụng và đồng hóa nguồn nitơ phong phú như ammonium, nitrate, ure, các amino acide và đặc biệt là arginin và glutamin (Flores và cộng sự, 2005 [75]) Rất nhiều VKL CĐN và đồng hóa nitơ khí quyển (khí N2), một đặc điểm rất ít thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ, nhờ nitrogenase cố định N2 VKL chỉ là các vi khuẩn quang tự dưỡng kết hợp với

cố định CO2 và N2 Vì vậy, các sinh vật này không chỉ đóng vai trò quan trọng cho chuỗi carbon toàn cầu mà chúng còn đóng góp quan trọng cho chu trình nitơ

Nitrogenase là một phức hợp enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng trong quá trình cố định nitơ gồm hai 2 enzyme: dinitrogenase và dinitrogen reductase Dinitrogenase là một protein cấu trúc bậc 4 với cofactor

molypden- Fe gồm 2 tiểu đơn vị chính do nifD mã hóa (Lammers và cộng sự, 1984[103]) và 2 tiểu đơn vị khác do nifK mã hóa (Mazur và cộng sự, 1982

[110]) Dinitrogen reductase chứa một cofactor Fe và hai tiểu đơn vị mã hóa

bởi nifH (Mevarech và cộng sự, 1980 [112]) Có hai hệ thống nitrogenase xen

kẽ với cofactor khác nhau Vanadin nitrogenase chứa vanadin thay cho

molybden làm cofactor và được mã hóa bởi vnfH/vnfDGK và chỉ có Fe nitrogenase được mã hóa bởi anfHDGK (Bishop và cộng sự, 1990 [57]) Các

nitrogenase khác nhau hiếm khi gặp ở VKL và chỉ có vanadin nitrogeductase được tìm thấy (Boison và cộng sự, 2006 [58])

Gen nifH là một trong những gen chức năng cổ xưa nhất được biết

đến trong lịch sử tiến hóa gen (Raymond và cộng sự, 2004 [126]) và trình

tự của nó có tính bảo thủ cao Phát sinh chủng loại của vi khuẩn dựa trên

sự đồng nhất trình tự gen nifH nói chung tương đồng với cây phát sinh

chủng loại từ trình tự 16S rARN (Falcon và cộng sự, 2002 [74]) Gần đây,

dữ liệu gen nifH là một trong dữ liệu gen ngoài ribosome lớn nhất và

trong đó gồm có một lượng lớn các chủng chưa nhận dạng (Zehr và cộng

sự, 2003 [162])

Những trình tự gen nifD có thể cung cấp thông tin bổ trợ cho đánh giá

phát sinh chủng loại của các vi sinh vật cố định đạm, đồng thời thể hiện chính xác mối tương quan giữa các loài như ở cây phả hệ dựa trên trình tự 16S

rRNA So với gen nifH, tương đối ít trình tự nifD có sẵn gây khó khăn khi phân tích phát sinh di truyền Tuy nhiên, các gen nifD, khi sử dụng làm

marker phát sinh chủng loại, hứa hẹn đem tới sự chính xác hơn trong phân tích đa dạng di truyền của những vi sinh vật cố định đạm và có thể phân biệt

rõ ràng hơn các loài trong hệ gen nif như cách nitroreductase với enzyme

chứa vanadin

Khi sử dụng phản ứng PCR để nhân một phần đoạn gen nifD, những

sinh vật có khả năng cố định N2 đều có đoạn gen này và ngược lại Bảng 1.3

cho thấy tính đặc hiệu của cặp mồi nhân gen nifD (Roselers và cộng sự, 2007 [130]) Cặp mồi nifD552-F và nifD861-R được thiết kế dựa trên trình tự gen

nifD của chủng Anabaena cylindrica PCC 7122 (AF442506; (Henson và cộng

sự, 2002[87]) Đây là chủng đã có trình tự hệ gen và có chứa 1 bản sao (single

copy) của mỗi gen nif, ngoại trừ nifH (có 2 bản sao) Vùng bảo thủ của gen

nifD đã được nhân lên và so sánh với trình tự gen nifD trong ngân hàng gen

Sự khuếch đại đoạn gen này cũng được thử nghiệm trên cả mẫu phân lập và

mẫu vi khuẩn khác Tác giả đã chứng minh được rằng các trình tự gen nifD có

thể được sử dụng để phát hiện và nhận dạng VKLCĐN trong quần thể tự nhiên Các sản phẩm PCR được tạo ra bằng cách sử dụng cặp mồi tương đồng

với cùng bảo thủ trong gen nifD của VKL và cũng đã được phân tích DGGE

và thư viện dòng để xác định sự đa dạng di truyền của của VKL CĐN trong các mẫu môi trường

Xuất phát từ những nghiên cứu trước đây về gen nifD và tính đặc hiệu

của cặp mồi nhân đoạn gen này, trong khuôn khổ có hạn, luận án đã lựa chọn

nifD là đối tượng nghiên cứu để góp phần bổ sung thêm dữ liệu về các chủng

đã phân lập mới ở trên

Bảng 1.3 Tính đặc hiệu của cặp mồi gen nifD đối với một số chủng vi sinh vật [130]

Dạng sinh vật Nguồn Khả năng

cố định N 2

Sản phẩm PCR với

cặp mồi nifD

Vi khuẩn Lam

1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Lam trong sản xuất nông nghiệp

Do khả năng thích ứng hình thái và sinh lý cao với các môi trường khác nhau, VKL thường hoạt động như những vi sinh vật tiên phong trong hệ sinh thái trên cạn (Metting, 1981[111], Hoffmann, 1989 [89]) Ở đất nông nghiệp, VKL đóng một vai trò quan trọng bởi vì chúng có tiềm năng rất lớn để làm nguồn nitơ và cacbon cho các sinh vật khác Độ màu mỡ của đất nói chung được cải thiện bởi các chất hữu cơ được tạo ra bởi các sinh vật (Mishra và Pabbi, 2004 [113]) VKL trong đất bài tiết sự phát triển các chất kích thích tăng trưởng như hormon, vitamin, amino acide, và axit hữu cơ có ảnh hưởng đến các sinh vật khác theo nhiều cách (Roger và Reynaud, 1982 [132], Wilson, 2006 [158]) Sự hiện diện của VKL đất cũng ổn định bề mặt đất và

do đó làm giảm xói mòn (Evans và Johansen, 1999 [73], Hu và cộng sự, 2004 [90]) Các polysaccharides được tạo ra bởi một số loài VKL đất làm tăng độ rỗng, độ kết tụ và khả năng giữ nước của đất (Roger và Reynaud, 1982 [132],

Choudhary và cộng sự, 2007 [66]) VKL đất cũng là ameliorators trong việc

cải tạo tính mặn và kim loại trong đất, do đó cải thiện chất lượng đất (Rai và cộng sự, 1998 [124] , Whitton and Potts, 2000 [156])

Sự tăng trưởng của các vi chất thiết yếu trong đất cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật và sự hấp thu ion thực vật, tăng hàm lượng N trên bề mặt đất, cũng như sản xuất các chất kích thích tăng trưởng thực vật như phytohormones và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật khác như amino acide, đường và vitamin là những yếu tố quan trọng nhất được gợi ý cho các tác động kích thích tăng trưởng thực vật của các vi sinh vật trong các công trình nghiên cứu Whitton (2000) [157], Stirk và cộng sự (2002) [145], Obana cùng cộng sự (2007) [120]

Một số nghiên cứu lưu ý rằng việc cấy đất nông nghiệp bằng tảo làm tăng sản lượng ngũ cốc lên 15-25% (Yanni và cộng sự,1992 [160]; Gurung và

Prasad, 2005[82], Song và cộng sự, 2005 [140]) VKL là phân bón sinh học

ưa thích vì chúng thực hiện hai quá trình sinh học quan trọng: quang hợp oxy

và sự cố định đạm (Relwani, 1963 [127], Ernst và cộng sự, 1992 [72]) Các

loài phổ biến sử dụng nitơ là các loài thuộc các chi Anabaena, Calothrix,

Nostoc, Schizothrix và Scytonema (Kannaiyan, 1990 [93], Rai và cộng sự,

(1988) [139], Arif và cộng sự (1995) [52], Thajuddin và Subramanian (2005) [150], Maqubela và cộng sự (2008) [109], Saadatnia và Riahi (2009) [133]

Những nghiên cứu tại Ấn Độ cho biết ở bang Bihar, khả năng cố định nitơ bởi VKL được xác định là 14 kg N/ha và ở tây Bengar, giá trị này có thể đạt tới 15 - 49 kg N/ha Venkataraman (1982) [152] Trên các cánh đồng mía

và ngô, riêng loài Cylindrospermum licheniforme hàng năm cũng có thể cung

cấp cho đất 88 kg N/ha Bằng phương pháp thực nghiệm trên đồng ruộng, Roger và Kulasooriya (1980) [131] cho hay khả năng cố định N2 của VKL trên đất lúa ở Banglades là 10- 30 kg/ha và có thể đạt tới 80 kg/ha/năm

Ngay ở xứ lạnh, như các miền cực của trái đất, người ta cũng tìm thấy

Nostoc commune sống cộng sinh trong địa y hoặc tự do Hàng năm VKL có

thể cung cấp cho Nam cực băng giá 24 kg N/ha Mặc dù khí hậu ôn đới không

thích hợp cho sự phát triển của VKL nhưng kết quả nghiên cứu trên 1000 mẫu đất ở Thụy Điển cho biết chúng có thể cố định được một lượng N2 hàng năm trên một cánh đồng là 15-51 kg N/ha Ở đó VKLCĐN khá phong phú (Henriksson, 1971)[86]

Tại tỉnh Hồ Bắc (Trung Quốc), năm 1976 diện tích trồng lúa thử nghiệm lây nhiễm VKLCĐN là 173 ha, vào năm 1979 diện tích được mở rộng

23000 ha và trung bình năng suất lúa tăng 15% so với ruộng không lây nhiễm Lee (1992) [104]

Trên đất lúa Ai Cập việc sử dụng Tolypothrix tenuis trong điều kiện

không bón phân đạm và lân, năng suất lúa tăng 4,2% Còn khi sử dụng

Anabaena oryzae (phân lập từ địa phương) dù bón phân đạm hay không, năng

suất lúa tăng 31,6%, đồng thời cây lúa hấp thu N2 cũng được tăng từ 25 đến 42,5% (Hamdi, 1986 [85]).Vai trò đó còn được chứng minh bởi Akhaer và cộng sự (2001, 2002) [49], [48]

VKL là nguồn phân bón sinh học có giá trị, khi sử dụng nó làm tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước, rất có ý nghĩa đối với quá trình hô hấp của

rễ thực vật bậc cao (Lakshamanan và cộng sự, 1994 [102]) Aziz và Hashem (2004) [54] thử nghiệm nhiễm VKLCĐN cho lúa trên nền đất mặn ở Pakistan cho thấy sinh trưởng của lúa, số nhánh, chiều dài bông, số hạt/bông và trọng lượng 1000 hạt tăng rõ rệt

VKL còn có thể tiết vào môi trường đất các chất có hoạt tính sinh học ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của cây trồng Nhiều thí nghiệm tiến hành ngâm hạt lúa với dịch vẩn của VKL đã kích thích sự nảy mầm, sinh trưởng của rễ, tăng trọng lượng hạt và hàm lượng protein của lúa (Đặng Diễm Hồng và Nguyễn Hữu Thước, 1987; Trần Đăng Kế, 1993; Trần Văn Nhị và Đặng Văn Hạnh, 1994) [15], [17], [32] Tại viện lúa Tasken đã tiến hành gieo các hạt được xử lý dịch vẩn VKLCĐN cho thấy năng suất vượt hơn so

với đối chứng là 13,8 tạ/ha Các chất do chúng tiết ra môi trường có thể là hormon, vitamin, amino acide, Roger và Reynaud (1982) [132]; Dương Đức Tiến (1994) [38] Nguyễn Đình San, Nguyễn Thị Kiều Đông (2007) nghiên cứu dịch vẩn VKL đã có tác động tốt lên sự sinh trưởng và phát triển của rễ mần và thân mần giống lúa Khải Phong [34], cũng trong năm đó Nguyễn Đình San và Lê Thanh Tùng nghiên cứu sự tác động của dịch vẩn VKL lên giống lúa Mộc Tuyền tại tỉnh Thanh Hóa và cho thấy năng suất tăng lên rõ rệt [35] Các chất nội sinh trong VKL, ví dụ như vitamin, enzyme, carbohydrate, amino acide, đã được biết đến là tạo ra sự tăng trưởng của cây trồng và tăng năng suất (Shariatmadari và cộng sự, 2013 [137], Prasanna và cộng sự, 2013 [122]) Các sản phẩm tự nhiên khác của VKL như carotenoid, hợp chất phenol có nhiều tác động sinh học như các hoạt động gây độc tế bào, kháng khuẩn và kháng nấm (Kulik, 1995[100], Zulpa và cộng sự, 2003 [165]) VKL không chỉ thúc đẩy sự phát triển của cây trồng mà còn tăng cường phản ứng phòng vệ (Rana và cộng sự, 2012 [125], Prasanna và cộng

Những năm gần đây, một số loài VKL được tập trung nghiên cứu, sản

xuất trên quy mô lớn để khai thác giá trị dinh dưỡng và dược liệu Spirulina

platensis với hàm lượng protein rất cao (chiếm tới 60-70% trọng lượng khô),

ngoài ra còn giàu các vitamin, nguyên tố khoáng, các chất có hoạt tính sinh