TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hypoph

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus )

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN QUỐC NAM Ngành : NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành : NGƯ Y

Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 06/2010

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus )

Tác giả

NGUYỄN QUỐC NAM

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Nuôi Trồng Thủy Sản

Chuyên Ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 06/2010

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt thời gian đi học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho con được hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng tất cả quý thầy cô trong khoa Thủy Sản đã truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt, tôi xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến TS.NGUYỄN HỮU THỊNH đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn đến anh Đỗ Viết Phương, chị Đào Thị Thanh Huê cùng các bạn lớp DH06NY đã cùng gắn bó, chia sẽ và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận văn

Với thời gian hạn hẹp và kiến thức hạn chế nên luận văn không tránh khỏi những sai sót.Tôi rất mong được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để

đề tài được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Trong đề tài này chúng tôi tiến hành:

Gây cảm nhiễm cá tra cỡ 15 ± 1,5 g/con với vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng

phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực và xử lý với Bronopol 8 ppm

+ Thí nghiệm 1: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila

bằng phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực Cá được ngâm 1 giờ trong các xô chứa 5 L nước với mật độ vi khuẩn tương ứng với từng nghiệm thức là 5,35 x 108 ;5,35 x 107 ; 5,35 x 106 ; 5,35 x 105 ; 5,35 x 104 CFU/mL

Cá chết có các dấu hiệu bệnh tích rõ ràng và điển hình như : xuất huyết gốc vây, dưới nắp mang, quanh miệng, hậu môn lồi, sưng đỏ, loét da Aeromonas hydrophila gây

chết cá cấp tính từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 số cá chết giảm dần và chết rải rác từng ngày Đến ngày thứ 11 của thí nghiệm thì cá hồi phục hẳn Tỷ lệ chết cao nhất là

NT I (mật độ vi khuẩn là 5,35 x 108 CFU/mL) với 30% và thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng với tỷ lệ 0,67%

+ Thí nghiệm 2: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila

bằng phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn gây bệnh là 3,82 x 108 CFU/mL sau khi gây stress bằng cách xử lý với Bronopol 8 ppm

Sau 14 ngày theo dõi, chúng tôi nhận thấy cá cũng chết vào giai đoạn đầu của thí nghiệm như ở thí nghiệm 1 Ở NT III có tỷ lệ chết cao nhất là 32,7% Chúng tôi thấy rằng việc xử lí cá với Bronopol ở nồng độ 8 ppm trong 24 giờ đã gây stress cho cá và tạo điều

kiện cho vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá

Kết quả nghiên cứu cho thấy Aeromonas hydrophila có độc lực tương đối thấp và

các phương pháp gây stress trên có thể áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra 3

2.1.1 Phân Loại 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Điều kiện môi trường sống 4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 4

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng 4

2.1.7 Đặc điểm sinh sản 5

2.2 Một Số Quan Điểm Về Bệnh 5

2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm 5

2.4 Đặc Điểm Chung Về Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila 6

2.4.1 Sơ lược về bệnh 6

2.4.2 Tác nhân gây bệnh 7

2.4.3 Triệu chứng và bệnh tích 9

2.5 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila Gây Ra Trên Cá Tra

2.6 Sơ Lược Về Bronopol 10

2.6.1 Nguồn gốc và tên gọi 10

2.6.2 Vai trò của Bronopol trong thủy sản 11

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu 12

3.2 Vật Liệu Và Hóa Chất Nghiên Cứu 12

3.4.1 Sơ đồ gây bệnh thực nghiệm 13

3.4.2 Thí nghiệm 1: gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas

hydrophila bằng phương pháp ngâm và gây stress bằng cách rạch vây đuôi,

vây ngực 14

3.4.3 Thí nghiệm 2: gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas

hydrophila bằng phương pháp ngâm và gây stress bằng cách xử lý với Bronopol 17

3.5 Phương Pháp Thực Hiện 19

3.5.1 Phương pháp giải phẫu nghiên cứu ký sinh trùng trên cá 19

3.5.2 Phân lập vi khuẩn trên cá thí nghiệm 20

3.5.3 Định danh sơ bộ vi khuẩn 20

3.5.4 Tăng sinh và xác định mật độ vi khuẩn 23

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết Quả Định Danh Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila 26

4.2 Các Chỉ Tiêu Môi Trường 27

4.3 Kết Quả Kiểm Tra Ký Sinh Trùng 28

4.4 Số Lượng Vi Khuẩn 28

4.4.1 Số lượng vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 1 28

4.4.2 Số lượng vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 2 29

4.5 Kết Quả Gây Cảm Nhiễm Trong Các Đợt Thí Nghiệm 29

4.5.1 Kết quả của thí nghiệm thứ 1 29

4.5.2 Kết quả phân lập và tái định danh vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 1 35

4.5.3 Kết quả của thí nghiệm thứ 2 35

4.5.4 Kết quả phân lập và tái định danh vi khuẩn trong thí nghiệm thứ 2 40

Hình 3.6: Cho khuẩn lạc vi khuẩn vào bình tăng sinh 23

Hình 3.7 và 3.8: Môi trường NB trước và sau khi tăng sinh vi khuẩn 24

Hình 4.1: Kết quả định danh Aeromonas hydrophila bằng bộ test API 20E 27

Hình 4.2:Hình thái vi khuẩn Aeromonas hydrophila Gram (-),trực khuẩn 27

Hình 4.3 và 4.4: Dấu hiệu xuất huyết tại vây hậu môn, vây đuôi của cá ở NTI.1

và NT III.1 (ngày thứ hai của thí nghiệm) 30

Hình 4.5: Nội quan của cá chết ở NT I.1, lách sưng to và sậm màu

(ngày thứ hai của thí nghiệm ) 31

Hình 4.6: Cá ở NT IV.2 có dấu hiệu xuất huyết nặng toàn thân

(ngày thứ tư của thí nghiệm) 31

Hình 4.7: Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh NT III.2 trên NA 35 Hình 4.8:Cấy thuần vi khuẩn trên môi trường Rimler-shott (NT III.3) 35

Hình 4.9: Cá bệnh ở NT I.3 có biễu hiện xuất huyết ở vây hậu môn, vây đuôi,

mắt hơi lồi và xuất huyết (ngày thứ 3 của thí nghiệm) 37

Hình 4.10: Cá ở NT III.3 gan sưng, nhạt màu, có xuất huyết điểm

Lách sưng to, sậm màu Xuất huyết trên thành bụng ( ngày thứ 4 của thí nghiệm)37

DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các Aeromonads 9

Bảng 4.1: Kết quả các phản ứng sinh hóa định danh Aeromonas hydrophila 26

Bảng 4.2:Chất lượng nước trong thí nghiệm thứ nhất 28

Bảng 4.3:Chất lượng nước trong thí nghiệm thứ hai 28

Bảng 4.4:Mật độ Aeromonas hydrophila gây bệnh lần thí nghiệm 1 29

Bảng 4.5:Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức của thí nghiệm 1 34 Bảng 4.6: Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức sau thí nghiệm 2 39

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt Vấn Đề

Ngành nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam đang trên đà phát triển và có vai trò quan

trọng trong nền kinh tế quốc dân Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được

coi là một trong những đối tượng nuôi thủy sản phát triển mạnh và có giá trị xuất khẩu cao Trước đây, cá tra được nuôi được nuôi chủ yếu ở quy mô hộ gia đình với mật độ nuôi thấp và nguồn giống từ tự nhiên là chính

Ngày nay, khi nghề nuôi cá tra phát triển và có giá trị kinh tế cao, để nghề nuôi càng ổn định và phát triển vượt trội nước ta đã chủ động nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất giống nhân tạo trên cá tra Đồng thời để đáp ứng nhu cầu về sản lượng và chất lượng sản phẩm với sự mở rộng thị trường, người nuôi trồng thủy sản đã chủ động từng bước chuyển đổi sang hình thức nuôi thâm canh Do đặc tính chịu được môi trường khắc nghiệt nên cá tra nuôi thâm canh cho năng suất cao

Tuy hình thức nuôi thâm canh đã đem lại thành công và lợi nhuận đáng kể cho người nuôi nhưng do phát triển quá nhanh và không theo quy hoạch, mật độ nuôi cao nên dịch bệnh trên cá tra xảy ra ngày càng nhiều và gây ra thiệt hại lớn Hơn thế nữa, quản lý chất lượng nước kém dẫn đến sự ô nhiễm môi trường tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây

bệnh cơ hội phát triển cao trong môi trường nuôi như Aeromonas hydrophila Khi sức

khỏe cá trong ao yếu đi những vi khuẩn cơ hội sẽ xâm nhập phát triển trong cơ thể gây bệnh cho cá hoặc với mật độ vi khuẩn cao trong ao chúng sẽ làm giảm sức đề kháng của

cá tạo điều kiện cho vi khuẩn nguy hiểm gây bệnh bắt buộc phát triển Đặc biệt, khi cá bị

stress, sây sát, lở loét…thường thấy Aeromonas hydrophila xuất hiện trong cơ thể cá bệnh

với tần số cao

Aeromonas hydrophila là vi khuẩn cơ hội nên khi gây bệnh thực nghiệm thì tỷ lệ

chết rất thấp hoặc độc lực không đủ mạnh để gây bệnh cho cá Do đó, cá phải được gây stress làm suy giảm sức khỏe tạo cơ hội cho vi khuẩn xâm nhập Có thể gây stress bằng cách: bố trí với mật độ cao hoặc tạo vết thương như rạch vây Bên cạnh đó trong nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng một số hóa chất để diệt ký sinh trùng, xử lý nước cũng có thể

gây stress cho cá Từ đó bệnh do A hydrophila có điều kiện bộc phát

Do đó, được sự phân công và tạo điều kiện của khoa Thủy Sản – Đại học Nông

Lâm chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tìm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas

hydrophila trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Tiến hành thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm bằng vi khuẩn Aeromonas hydrophila

trên cá tra bằng phương pháp ngâm kết hợp với gây stress cho cá

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra

2.1.2 Phân bố

Cá tra sống chủ yếu trong môi trường nước ngọt, phân bố ở lưu vực sông Mê Kông (Việt Nam, Lào, Campuchia) và sông Chao Phraya Thái Lan Ở Việt Nam những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột cá Tra và cá Basa giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá tra có đầu rộng và dẹp bằng, mắt to, thân thon, dài, phần sau hơi dẹp bên Thân

có màu hơi xanh và nhạt dần xuống hai bên hông, bụng cá có màu trắng nhạt, phía vây đuôi hơi vàng, vây lưng và vây đuôi có màu xám đen Phần cuối vây đuôi có màu hơi đỏ Vây lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau Cá tra có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vây ngực, râu cằm ngắn hơn Theo Robert và ctv (1991),

số tia vây bụng của cá tra V= 8 – 9 Vây hậu môn A = 31 – 33 Lược mang 28 – 38, bóng

hơi chỉ có một ngăn nằm duỗi thẳng trong xoang bụng (trích bởi Phạm Văn Khánh, 1996)

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

Cá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh, cá sống chủ yếu ở các thủy vực nước ngọt, cũng có thể sống được ở các thủy vực nước lợ với nồng độ muối thấp (khoảng 7 – 10‰) Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng dao động từ 26 đến 300C Nhờ

có cơ quan hô hấp phụ nên cá tra có thể sống trong các môi trường nước có hàm lượng oxy hòa tan thấp pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo, hoạt động chậm chạp, khi pH = 11 cá có biểu hiện mất nhớt (Dương Tấn Lộc, 2004)

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra là loài cá ăn tạp thiên về động vật Cá tra khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống và có thể ăn thịt lẫn nhau nếu không được cho ăn đầy đủ hoặc giữ trong bể

ấp với mật độ dày

Khi lớn lên, cá có tính ăn tạp thiên về động vật và cũng dễ dàng chuyển đổi loại thức ăn Trong ao nuôi, cá tra có khả năng thích nghi với loại thức ăn, kể cả những loại thức ăn bắt buộc như mùn bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, thức ăn hỗn hợp, động vật đáy…

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra sau khi tiêu hết noãn hoàng có chiều dài từ 1,0 – 1,1 cm Cá có thể đạt đến chiều dài 2 – 3 cm và có khối lượng trung bình là 0,52 g sau 14 ngày ương Cá ương năm tuần tuổi có chiều dài từ 5,0 – 6,0 cm và trọng lượng trung bình là 1,28 -1,50 g Sau một năm tuổi, cá có thể đạt trọng lượng từ 1,2 – 1,5 kg Sau 3 - 4 năm tuổi, cá có thể đạt 3 – 4

kg Nhìn chung cá tra có tốc độ sinh trưởng nhanh nhưng tốc độ tăng trưởng của cá tùy thuộc vào mật độ nuôi, chất lượng thức ăn, chế độ chăm sóc và độ tuổi của cá (vì sau khoảng 2-3 năm tuổi thì sự sinh trưởng của cá giảm xuống do cá bắt đầu có sự tích cho quá trình thành thục sinh dục, bắt đầu có sự tạo trứng và tạo tinh (Mai Đình Yên và ctv., 1992))

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 – 4 năm, trọng lượng trung bình từ 5 -6 kg/cá thể với chiều dài tối thiểu là 60 cm Vào mùa thành thục (từ tháng 4 trở đi), cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục và đẻ trứng Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông Mekong của Việt Nam Bãi đẻ của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia trở lên Tại đây, có thể bắt được những cá bố mẹ có trọng lượng 15 kg với buồng trứng đã thành thục Tại bãi đẻ, cá bố mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy sinh ven bờ Sau khi nở, cá bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi theo sông Mekong về phía việt Nam

Sức sinh sản của cá tra khoảng 13900- 15000 trứng/kg cá cái (trích bởi Nguyễn Thị Bảo Ngọc, 2005)

2.2 Một Số Quan Điểm Về Bệnh

Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc bệnh và chết Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc bộ phận cơ quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật được gọi là bệnh

Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia ra 2 loại bệnh: bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm

Bệnh truyền nhiễm thường do vi khuẩn, nấm, virus gây ra Tính chất lây truyền mạnh và có thể thành những ổ dịch lớn gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm độc hóa học Bệnh không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng, độc tố

2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm

- Thời gian cá bệnh ngắn do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu

- Khả năng xâm nhập vi khuẩn gần giống với tự nhiên

- Ít gây stress cho cá hơn so với phương pháp tiêm

Khuyết điểm:

- Có thể gây stress do ngâm trong bể có diện tích nhỏ

- Tỷ lệ cá chết giữa các nồng độ vi khuẩn khác nhau do lượng vi khuẩn xâm nhập khác nhau giữa các cá thể cá khác nhau

Cá yếu: Vi khuẩn nhiều

Cá khỏe: Vi khuẩn ít

Ngoài ra còn có một số trường hợp gây bệnh khác như:

- Nuôi chung: Cá bệnh và cá khỏe nuôi chung bể để chúng lây nhiễm với nhau

- Qua đường miệng: Tẩm vi khuẩn vào thức ăn cho cá ăn

- Sử dụng ống tiêm đưa thức ăn có tẩm vi khuẩn vào dạ dày cá

- Gây mê cá sau đó nhỏ vi khuẩn vào mũi cá

(Theo Nguyễn Hữu Thịnh, 2009)

2.4 Đặc Điểm Chung Về Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila

2.4.2 Tác nhân gây bệnh

Aeromonas hydrophila là trực khuẩn gram âm có khả năng di động nhờ tiêm mao,

lên men glucose có hoặc không có sinh hơi, đề kháng với vibriostatic agent 0/129 diamino,6,7-di-isopropyl pteridine), chuyển nitrate thành nitrite Có thể phân lập vi khuẩn

(2,4-từ cá bệnh trên môi trường Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA) hoặc Brain-heart infusion agar (BHIA) Vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi có màu vàng Khi phát triển trên môi trường chọn lọc Rimler Shotts cho các khuẩn lạc có màu vàng Vi khuẩn có thể phát triển ở 50C, bị tiêu diệt ở 700C trong 5 phút (Huang và ctv 1993)

biệt là khi có sự hiện diện của nồng độ cao các chất hữu cơ (Kaper và ctv, 1981) Ngoài

ra, nó còn là một vi khuẩn bình thường của đường tiêu hóa của cá (Trust và ctv, 1974)

Theo Eisa và ctv (1994), sự hiện diện của A hydrophila trong đường ruột của cá rô phi

nuôi và trong tự nhiên lần lượt là 10% và 2,5%

“mầm bệnh cơ hội” ngụ ý rằng A hydrophila luôn luôn có khả năng gây bệnh nếu có cơ hội Như đã nói ở trên, A hydrophila hiện diện khá phổ biến trong tự nhiên và thậm chí

còn được tìm thấy trong đường ruột của cá khỏe mạnh Do đó trong tự nhiên nhiễm trùng

của cá đối với A hydrophila có lẽ chỉ là một vấn đề nhỏ Tuy nhiên, với các hệ thống nuôi

cá thâm canh với mật độ dày đặc, cho dù các hệ thống này là ao hồ hoặc trong bể thì sự bùng phát của bệnh đối với cá nuôi là vấn đề đáng quan tâm Sự xuất hiện của bệnh này thường liên quan đến yếu tố stress hoặc tình trạng sức khỏe của cá Chẳng hạn như mật độ nuôi dày đặc, tình trạng dinh dưỡng kém, chất lượng nước kém là các nguyên nhân làm

cho dịch bệnh do A hydrophila dễ dàng bùng phát Nhiều nghiên cứu cho thấy cá được

nuôi trong các môi trường có chất lượng nước xấu như nitrite cao, hàm lượng ôxy hòa tan (DO) thấp, hoặc hàm lượng khí CO2 cao thường dễ bị nhiễm trùng do A hydrophila

Theo Ventura và Grizzle (1987) vi khuẩn dễ dàng tấn công gây bệnh cho cá nheo

(Ictalurus punctatus) khi chúng bị các tổn thương trên da Một nghiên cứu khác của Peters và ctv (1988) chỉ ra rằng yếu tố stress khi nuôi cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) nhỏ với các con cá lớn sau đó cho chúng nuôi chung với cá bị nhiễm A hydrophila Sau 1

thời gian nuôi chung thì thấy rằng vi khuẩn phân lập từ cá nhỏ gia tăng nhiều hơn với tỷ

lệ cao hơn so với cá lớn Yếu tố stress của cá nhỏ được căn cứ vào hàm lượng glucose trong huyết tương tăng cao và sự gia tăng về số lượng bạch cầu

Các căn bệnh do vi khuẩn này chủ yếu ảnh hưởng đến loài cá nước ngọt như cá chép, cá rô phi, cá da trơn và nhiều loài cá nhiệt đới hoặc cá cảnh Bên cạnh đó nó cũng

có thể ảnh hưởng đến các loài cá nước lạnh Theo Rahim và ctv (1985) đã phân lập được

A hydrophila từ vết thương của 4 loài cá nước lợ bao gồm: Cá ngát, cá chẽm, cá mú, cá

trôi đen Thampuran và ctv (1995) không chỉ phân lập được A hydrophila từ cá biển tươi

hoặc đã chế biến mà còn phân lập được tại các vùng đánh bắt cá

Đặc điểm huyết thanh và vaccine: aeromonads có tính kháng nguyên đa dạng nhất trong các loài vi khuẩn gây bệnh cho cá Số lượng kháng nguyên đa dạng vốn có trong nhóm này được thể hiện thông qua kháng nguyên H (tiêm mao) và kháng nguyên O (thân) Ewing và ctv (1961) mô tả 12 nhóm kháng nguyên O và 9 nhóm kháng nguyên H Mỗi nhóm lại được chia ra thành 1 số serotype Chdyniecki (1965) cũng đã nhận thấy sự

đa dạng kháng nguyên giữa các chủng aeromonads di động thu được từ cùng một quần thể cá và ngay cả từ các cơ quan khác nhau của cùng một cá Vaccine đơn giá dùng để

chống lại bệnh do A hydrophila thường chỉ cho độ bảo hộ ở mức chấp nhận chống lại các

vi khuẩn tương đồng chứ không tạo được miễn dịch đối với các chủng A hydrophila khác (Schaperclaus, 1967) Do sự đa dạng kháng nguyên giữa các chủng A hydrophila khá

phức tạp do đó các nghiên cứu đều tập trung chú trọng đến việc phát triển vaccine đa giá Hơn nữa việc cấp vaccine bằng các tiểu phần kháng nguyên cho hiệu quả bảo hộ tốt hơn đối với các chủng vi khuẩn khác nhau so với việc cấp vaccine bằng toàn bộ tế bào kháng nguyên

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các Aeromonads

Subsp

salmo nicida

Subsp

achromo enes

Subsp

masou cida

Điển hình

- + +

d

-

d +

- + + + + + + +

- +

d + +

+ +

- + +

- + + +

- +

-

-

d + +

+ +

- + +

- + + + + +

- +

d + +

-

- + + +

- + +

-

d

- + +

-

-

- + + +

-

- +

- + + + +

- + +

-

d

- + +

2.4.3 Triệu chứng và bệnh tích

Khi cá bị bệnh các gốc vây thường bị xuất huyết, xuất huyết dưới nắp mang, quanh miệng, hậu môn lồi, sưng đỏ, loét da Cá bơi lờ đờ, tách đàn, biếng ăn

Cấp tính: Nhiễm trùng gây chết cá Cá chết nhiều, xuất huyết ngoài da, khắp cơ thể

và nội quan Mắt cá bị mờ, lồi, mù, bụng trướng to do tích dịch xoang bụng, gan nhạt màu, thận sưng Ruột sau sưng đỏ, lồi ra ngoài hậu môn.Vi khuẩn phát triển mạnh gây nhiễm trùng toàn cơ thể và hoại tử lan rộng nhiều nội quan chủ yếu là gan và thận

Bệnh mãn tính: Ổ viêm nhiễm xuất huyết trên da, cá chết rãi rác mỗi ngày, thượng

bì và hạ bì bị tổn thương, cơ bị viêm loét Ngoài ra, còn thấy xuất huyết điểm giác mạc và

cơ nhưng nội quan không bị hoại tử

( Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh, 2009)

2.5 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas hydrophila Gây Ra Trên Cá Tra

Chúng ta cần hạn chế làm cá bị sây sát, phải vệ sinh ao nuôi đúng quy định để môi trường nước luôn sạch Bên cạnh đó không nên nuôi với mật độ quá dày để tránh gây stress cho cá Cần quản lý các chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, pH, NH3, DO tạo điều kiện cho cá phát triển khỏe mạnh

Có thể phòng bệnh bằng cách dùng thuốc tím KMnO4 tắm cá, liều dùng là 4 ppm đối với cá nuôi trong ao Xử lý trong 3 ngày liên tục Định kỳ tắm cá 1-2 tuần/lần hay 1 tháng/lần tùy vào sức khỏe cá

Khi bệnh xảy ra chúng ta giảm hoặc ngưng cho ăn để hạn chế đến mức tối đa ô nhiễm nước Cần vớt bỏ cá bệnh nhằm tránh lây lan bệnh Tránh lây lan bệnh từ các dụng

cụ nuôi, chim cò…

Dùng thuốc trộn vào thức ăn:

Oxytetracyline: 55 - 57 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày

Streptomycin: 50 - 75 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày

Kanamycin : 50 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày

Nhóm sulfamid: 150 – 200 mg/1kg thể trọng, cho ăn 7 ngày

( Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh (2009) và Bùi Quang Tề ( 2006))

2.6 Sơ Lược Về Bronopol

2.6.1 Nguồn gốc và tên gọi

Bronopol được phát triển bởi công ty The Boot Company PLC, Notthingham, Anh vào đầu những năm 1960 và được sử dụng lần đầu tiên như là chất bảo quản có tính kháng khuẩn

Tên hóa học : 2-bromo-2 nitropropane-1,3diol

Tên thương mại: Pyceze, Onyxide 500…

Công thức hóa học : C3H6BrNO4

Cấu tạo hóa học:

2.6.2 Vai trò của Bronopol trong thủy sản

Cơ quan Thuốc Thú y Anh (VMD) và Cơ quan Thuốc Thú y Quốc gia Pháp (ANMV) đã cho phép sử dụng sản phẩm “Pyceze” có hoạt chất chính là Bronopol do công ty Novartis Animal Vaccines Limited sản xuất để thay thế Malachite Green trong điều trị bệnh nấm ngoại ký sinh và sát khuẩn trên cơ thể cá

Trong vùng nước ngọt: Ở vùng nước lạnh và nước ấm Bronopol có độc tính nhẹ đối với cá, độc tính trung bình với động vật không xương sống Trong vùng nước lợ, Bronopol có độc tính nhẹ đối với cá, độc tính trung bình với tôm Trong vùng nước mặn, Bronopol có độc tính cao hơn mức trung bình đối với động vật không xương sống Ngoài

ra, Bronopol còn là hóa chất diệt khuẩn có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm, tảo

Theo Lê Long Hồ (2006): Xử lý rửa trứng bằng Bronopol ở nồng độ 10 ppm và 20 ppm cho tỷ lệ trứng nở cao hơn đối chứng nhưng ở nồng độ 40 ppm tỷ lệ trứng nở thấp hơn ở nồng độ 10 ppm và 20 ppm

Theo Trần Phương Đại (2007): Về khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol: ở nồng độ 10 ppm và 20 ppm tắm trong 30 phút và 2 giờ thì cho hiệu quả cao nhất Về khả năng diệt khuẩn trong nước và trên cá thì Bronopol có khả năng diệt khuẩn trong nước nhưng trên cá thì không cao và LC50-24h của Bronopol đối với cá tra là 13,07 ppm

Một số lưu ý khi sử dụng Bronopol:

- Không sử dụng thuốc đối với trứng cá dùng cho người ăn

- Không trộn thuốc với chế phẩm khác trong ngâm tắm trị bệnh

- Không để thuốc dính vào da, mắt

- Sản phẩm này có thể làm hỏng một vài chất dẻo

- Bảo quản thuốc ở nhiệt độ dưới 250C

- Liều lượng sử dụng đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Đậy nút kín sau khi sử dụng

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3-5/2010

- Địa điểm nghiên cứu: Trại Thực Nghiệm Thủy Sản và Phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu Và Hóa Chất Nghiên Cứu

3.2.1 Đối tượng

+Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập từ cá bệnh ở Long Xuyên

+ Cá tra giống ở trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản nuôi trong bể xi măng

+ Cá đạt đến cỡ 15 ± 1,5 g/con thì chọn cá cùng cỡ, khỏe mạnh, không xuất huyết

để tiến hành thí nghiệm

3.2.2 Dụng cụ

- Hệ thống bể composite có cùng kích thước Mỗi bể chứa 70 L nước

- Thau, vợt, xô, cân điện tử, kính hiển vi, lame, bộ dụng cụ tiểu phẩu, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn

- Tủ cấy vi sinh, tủ ủ, máy sấy, nồi hấp Autoclave, máy Votex và một số dụng cụ cần thiết khác

3.2.3 Hóa chất

Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, lugol, chất tẩy màu, Safranin

Cồn 90o, cồn 70o, nước muối sinh lý, thuốc mê MS222

Hóa chất thử phản ứng Oxidase : Đĩa giấy oxidase của công ty Nam Khoa hoặc đĩa giấy có tẩm Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochlorid 1%

Hóa chất thử phản ứng Catalase: H2O2 30%, dung dịch đệm phosphate

Môi trường: NA (Nutirent Agar), NB ( Nutrient Broth), Rimler Shott (môi trường

chọn lọc đối với Aeromonas hydrophila)

Bộ testkit pH, DO, NH3/NH4

3.3 Nội Dung Nghiên Cứu

Bố trí gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila bằng

phương pháp ngâm :

- Thí nghiệm 1: Gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực

- Thí nghiệm 2: Gây stress bằng phương pháp ngâm với Bronopol 8 ppm

Quan sát triệu chứng, bệnh tích Theo dõi tỷ lệ chết

Phân lập, tái định danh vi khuẩn

Kết luận Gây stress

3.4.2 Thí nghiệm 1: Gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila bằng phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách rạch vây đuôi, vây ngực

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức với 3 lần lập lại trong 21 bể composite chứa cùng thể tích 70 L Số lượng cá bố trí là 50 con/bể

Cá được bố trí thí nghiệm phải được thả trong bể tại phòng gây bệnh 2 ngày nhằm giúp cá làm quen với điều kiện môi trường

Nguồn nước cung cấp vào bể là nước máy sinh hoạt đã được trữ trong thời gian 24h để bay hơi chlorine có trong nước

Tiến hành bố trí:

- Bắt ngẫu nhiên 10 con cá trong lô cá dùng làm thí nghiệm kiểm tra ký sinh trùng

- Lần lượt lấy cá ở từng nghiệm thức tiến hành gây mê

+ Đối với nghiệm thức ĐC I gây mê xong thả cá lại bể hồi phục

+ Các nghiệm thức còn lại gây mê xong dùng dao bén rạch 1 đường dọc vây

ngực và 2 đường vây đuôi Sau đó thả lại bể để hồi phục

Sau 1 ngày cá được hồi phục, lần lượt bắt cá từng bể cho vào các xô chứa 5 L nước

có pha huyền phù vi khuẩn tương ứng với từng nghiệm thức Ngâm cá trong 60 phút Ở

nghiệm thức ĐC I, ĐC II mặc dù không ngâm vi khuẩn cũng được giữ trong xô 60 phút

để tạo sự đồng đều giữa các nghiệm thức Trong suốt quá trình gây nhiễm, nước được sục

khí liên tục

- Sau đó đưa cá thả lại bể

Hình 3.2 : Rạch vây gây stress cho cá Hình 3.3: Ngâm cá với vi khuẩn

trong xô có sục khí

Theo dõi, chăm sóc, quản lý : Tiến hành quan sát biểu hiện bệnh, triệu chứng,

bệnh tích, theo dõi tỷ lệ chết trong 14 ngày

Các yếu tố chất lượng nước : Trong quá trình theo dõi cá cần kiểm tra các yếu tố

chất lượng nước :pH, DO, NH3 và nhiệt độ 2 lần/ngày

Tiến hành siphone và thay nước mỗi ngày, mỗi lần thay từ 20 - 25% lượng nước

Hằng ngày vớt cá chết và cá lờ đờ bằng vợt riêng của từng bể

Cá bệnh mới chết và lờ đờ được đem quan sát dấu hiệu bệnh lý, giải phẫu, quan sát triệu chứng, bệnh tích Tiến hành phân lập, tái định danh vi khuẩn

Tiến hành chụp hình, ghi nhận các kết quả thu được

3.4.3 Thí nghiệm 2: gây bệnh thực nghiệm trên cá tra đối với Aeromonas hydrophila

bằng phương pháp ngâm sau khi gây stress bằng cách xử lý với Bronopol 8 ppm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức trong 12 bể composite chứa cùng thể tích 70 L Các bể được vệ sinh sạch sẽ trước khi sử dụng

Số lượng cá bố trí thí nghiệm là 50 con/bể

Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần

Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm 2

Trong đó:

- ĐC : Nghiệm thức đối chứng

- NT I : Gây bệnh nhưng không xử lý bronopol

- NT II : Xử lý bronopol nhưng không gây bệnh

- NT III : Gây bệnh và xử lý bronopol

ĐC

NT I.1

+ Sau đó đưa cá thả lại bể

Theo dõi, chăm sóc, quản lý : Tiến hành tương tự như thí nghiệm 1

3.5 Phương Pháp Thực Hiện

3.5.1 Phương pháp giải phẫu nghiên cứu ký sinh trùng trên cá

Quan sát bên ngoài

Đặt cá trong khay nhôm sạch, giữ ẩm Nếu cá có kích thước lớn thì làm chết ngay bằng cách hủy não

Quan sát triệu chứng lâm sàng

Trước tiên quan sát cá bằng mắt thường, chú ý màu sắc, hình dạng thân, xem trên thân có các hiện tượng như bị tổn thương, u nhọt, vết đen, loét, đốm trắng ở da và mang cũng như các ký sinh trùng lớn (đỉa, giáp xác…) bám trên

da, vẩy cá để chẩn đoán sơ bộ bệnh cá

Cân trọng lượng, đo chiều dài và chụp hình cá

Dùng kéo cắt bỏ nắp mang rồi quan sát bằng mắt thường Cắt cung mang, dùng kẹp lấy ra quan sát bằng mắt thường, sau đó quan sát dưới kính hiển vi từ

độ bội giác nhỏ đến lớn

Đối với cá giống chỉ nghiên cứu từ bên ngoài (da, mang)

Nghiên cứu cơ quan bên trong cá

Mổ xoang bụng, khi mổ phải cẩn thận tránh làm hỏng các cơ quan bên trong Để mổ xoang thân, dùng kéo cắt một đường ngang trước lỗ hậu môn một ít không làm hỏng ruột Trước hậu môn 1cm dùng kéo cắt 2 đường song song với đường bụng và đường bên, đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên Tách rời một bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong Trước tiên quan sát bằng mắt thường màu sắc của các cơ quan bên trong, sự viêm loét của nội tạng và các hiện tượng khác nếu có trong cơ thể cá

Lấy ruột ra cùng với các cơ quan nội tạng: gan, túi mật, tỳ tạng để vào đĩa petri, thường xuyên nhỏ vài giọt nước sạch để mẫu không bị khô và dính vào nhau

Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng trên cá

¾ Bộ phận kiểm tra: mang, nhớt, ruột

¾ Phương pháp kiểm tra trên từng cơ quan

9 Nhớt: dùng dao cạo lấy nhớt ở nhiều vị trí khác nhau trên cơ thể cá:

da, vây… đủ để dàn đều cho 1 lamell (20x20mm) Sau đó dùng lamelle gạt nhẹ nhớt cạo được trên kính lame, nhỏ lên đó 1-2 giọt nước sạch rồi dùng lamelle dàn mỏng lớp nhớt trên lame Đặt lamelle lên và quan sát dưới kính giải phẫu và kính hiển vi

9 Mang: mở nắp mang rồi dùng kẹp gắp kéo một lá mang (để tránh sự chảy máu), để lên lame, sau đó nhỏ lên 1-2 giọt nước muối sinh lý và quan sát dưới kính hiển vi Nếu mang nhỏ (<10cm) thì ta xem trực tiếp, nếu mẫu mang lớn (>10cm) thì ta dùng dao cạo nhớt trên mang

để lên lame và quan sát

9 Ruột: chia thành từng phần, mỗi phần dùng kéo mổ dọc lấy những thức ăn chưa tiêu hóa hết Sau đó cạo nhớt ở thành ruột, ép và xem dưới kính hiển vi

3.5.2 Phân lập vi khuẩn trên cá thí nghiệm

Phân lập vi khuẩn trên các cơ quan: gan, lách, thận, trên môi trường NA (Nutrient Agar)

Khi giải phẩu để tránh nhiễm trùng các tạp khuẩn từ bên ngoài da cá Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 300C Sau 24 giờ quan sát và ghi nhận các đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc

3.5.3 Định danh sơ bộ vi khuẩn

Nhuộm Gram

Nguyên tắc: Nhuộm gram là một trong những phương pháp quan trọng để phân loại vi khuẩn Nhuộm gram cho phép chúng ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn là gram dương hay gram âm

Cách tiến hành: Lấy 1 khuẩn lạc đơn riêng lẻ trong các đĩa petri có thời gian

ủ từ 18 – 24 giờ tiến hành nhuộm gram theo cách truyền thống

Ghi tên mẫu, ngày thử nghiệm lên lame

Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame

Dùng que cấy lấy 1 lượng nhỏ vi khuẩn từ một khuẩn lạc rời, riêng lẻ dàn mỏng lên giọt nước cất

Để vết bôi khô hoàn toàn

Cố định vết bôi bằng cách hơ qua lại thật nhanh dưới ngọn lửa đèn cồn

Các bước nhuộm gram:

Nhỏ Crystal violet (dung dịch màu tím) lên vết bôi trong 30 giây

Đổ bỏ crystal violet, rửa với nước cất

Dùng dung dịch lugol cố định màu crystal violet trong 1 phút

Đổ bỏ lugol, rửa với nước cất

Nghiêng lame, nhỏ dung dịch tẩy (cồn 95 %) cho đến khi mất màu hoàn toàn, sau đó rữa lại bằng nước

Cho Safranin lên vết bôi, trong 60-80 giây

Đổ bỏ dung dịch, rửa nước, để khô lame

Quan sát màu vi khuẩn sau nhuộm: ta thấy khuẩn lạc màu hồng, kết luận là

vi khuẩn gram (-), còn khuẩn lạc màu tím là gram (+)

Quan sát hình dạng vi khuẩn: là trực khuẩn ngắn, hình que

Phương pháp:

Đặt đĩa giấy đã được tẩm hóa chất thử (Merk, Nam Khoa) lên đĩa thạch, nhỏ nước muối sinh lý tiệt trùng lên đĩa giấy sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt Dùng pipet pasteur lấy một khuẩn lạc riêng lẻ bôi lên đĩa giấy

Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu tím đen tức là có oxidase là dương tính, sau 60 giây là âm tính

Khả năng di động

Một số vi khuẩn có khả năng di động được là nhờ những cơ quan đặc biệt gọi là tiên mao Để xác định khả năng di động của vi khuẩn ta thường quan sát trực tiếp (soi tươi) dưới kính hiển vi hoặc thử nghiệm trên môi trường thạch mềm (bán rắn)

Cách 1: Mẫu soi tươi

‐ Nhỏ 1-2 giọt nước muối sinh lí lên lame

‐ Dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc của vi khuẩn được phân lập từ cá bệnh (lấy khuẩn lạc từ mẫu mô thận) trang lên trên lame

‐ Đậy lamelle

‐ Xem dưới kính hiển vi ở vật kính X100 có giọt dầu

Kết quả: Thấy vi khuẩn có khả năng di động

Cách 2: Thử nghiệm trên môi trường thạch mềm (bán rắn)

‐ Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch)