Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm của hai loài hải miên rhabdastrella providentiae và xestospongia muta ở vùng biển trung bộ việt nam (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - DƢƠNG THỊ DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN Rhabdastrella providentiae VÀ Xestospongia muta Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số : 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phan Văn Kiệm Người hướng dẫn khoa học 2: TS Bùi Hữu Tài Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Trong nhi u năm g n đ y, với s h trợ c a thuật ti n tiến, hoạt chất t thi n nhi n đ n n ph n ập đánh giá hoạt t nh sinh học ất nhi u thuốc c nguồn gốc sinh vật iển đ c m t tr n th trường o h ng ược ớn tr n giới cung cấp, à: Cytara ine, Ha aven, Ziconoti e, Vi ara ine, Tra ecte in… Việt Nam với lợi có bờ biển ài 260 m chạy dọc t Bắc vào Nam, nhi u đảo ven biển, đ c biệt có hai qu n đảo Trường Sa Hồng Sa nằm biển Đơng Đi u kiện đ a ý đ đ đem ại nhi u thuận lợi, ti m v nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú cho đất nước, tạo nên hệ sinh vật biển vô đa ạng, dồi v trữ ượng thành ph n loài Các kết nghiên cứu cho thấy số ượng loài hải miên vùng biển Việt Nam phát khoảng 160 loài phân bố tập trung vùng biển quanh đảo ven bờ xa bờ Trong đ nghiên cứu v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a khoảng 20 lồi Riêng loài hải miên Rhabastrella providentiae chưa c nghi n cứu giới Việt Nam Loài hải miên Xestospongia muta chưa c nghiên cứu Việt Nam Việc nghiên cứu, khảo sát thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a loài hải mi n vấn đ thu hút s quan tâm c a nhà khoa học giới Ở Việt Nam, bước đ u đ c cơng trình nghiên cứu v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a lồi sinh vật biển đăng tr n tạp chí quốc tế uy t n chưa nhi u Chính thế, nhiệm vụ nghiên cứu khảo sát v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a hải miên nói riêng sinh vật biển nói chung nước ta quan trọng Xuất phát t điểm đ , đ tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào kháng viêm hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae Xestospongia muta vùng biển Trung Việt Nam” đ l a chọn Mục tiêu luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành ph n hóa học c a hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae Xestospongia muta thu vùng biển Trung Việt Nam Đánh giá hoạt t nh g y độc tế bào hoạt tính kháng viêm c a hợp chất phân lập để tìm kiếm hoạt chất àm sở khoa học cho nghiên cứu để tạo sản phẩm chăm s c sức khỏe cho cộng đồng Nội dung luận án bao gồm: Phân lập hợp chất t hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae Xestospongia muta thu vùng biển Trung Việt Nam phương pháp sắc ký; Xác đ nh cấu trúc hóa học c a hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học; Đánh giá hoạt t nh g y độc tế ung thư in vitro c a hợp chất phân lập được; Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro c a hợp chất phân lập CHƢƠNG TỔNG QUAN Bao gồm ph n tổng quan v nghiên cứu nước quốc tế v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a hải miên nói chung hải miên thuộc hai giống Rhabdastrella Xestospongia 1.1 Giới thiệu chung hải miên: ph n giới thiệu v đ c điểm, phân bố, nghiên cứu v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a hải miên nói chung 1.2 Tổng quan hải miên thuộc giống Rhabdastrella 1.2.1 Giới thiệu vài nét hải miên thuộc giống Rhabdastrella Hải miên giống Rhabdastrella thuộc họ Ancorinidae, Astrophorida, lớp Demospongia Các nhà hoa học đ ph n ập xác đ nh cấu trúc c a hoảng 80 hợp chất, hợp chất đ u thuộc khung isomalabaricane oại nortriterpenoi triterpenoi 1.2.2 Tình hình nghiên cứu giống Rhabdastrella giới 1.2.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học hải miên giống Rhabdastrella 1.2.2.2 Đặc trưng phổ 13C-NMR số hợp chất isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella 1.2.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học hải miên giống Rhabdastrella 1.3 Tổng quan hải miên thuộc giống Xestospongia 1.3.1 Giới thiệu chung hải miên thuộc giống Xestospongia Đến năm 2018 c hoảng 350 nghi n cứu v hải mi n thuộc giống Xestospongia T nghi n cứu đ ph n ập xác đ nh cáu trúc c a hỏng 400 hợp chất 1.3.2 Tình hình nghiên cứu hải miên thuộc giống Xestospongia giới 1.3.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học hải miên giống Xestospongia 1.3.2.2 Đặc trưng phổ 13C-NMR số hợp chất macrocyclic bis-quinolizidine alkaloid phân lập từ hải miên giống Xestospongia 1.3.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất alkaloid phân lập từ hải miên thuộc giống Xestospongia CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu hải miên Rhabdastrella providentiae (Dendy, 1916) thu rạn san hô thuộc vùng biển Cồn Cỏ, Quảng Tr Mẫu hải miên Xestospongia muta (Schmidt, 1870) thu rạn san hô thuộc vùng biển V nh Mốc, Quảng Tr Tên khoa học c a hai mẫu xác đ nh GS TS Đ Công Thung, Viện Tài nguyên Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam (VAST) Mẫu tiêu ưu giữ Viện Hóa sinh biển, VAST 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập hợp chất Phương pháp xác định cấu trúc Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.3 Phân lập hợp chất 2.3.1 Phân lập hợp chất từ lồi hải miên R providentiae Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài Rhabdastrella providentiae 2.3.2 Phân lập hợp chất từ loài hải miên X muta Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ lồi Xestospongia muta 2.4 Thơng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập 2.5 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 2.5.1 Kết thử hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài R providentiae - Bảng 2.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 hợp chất RP1-RP18 Hợp chất RP2 RP5 RP7 RP8 RP9 RP10 RP11 RP12 RP13 RP14 RP15 RP16 IC50 (µM) 7,4 ± 0,4 75,3 ± 3,8 17,5 ± 0,9 46,8 ± 2,3 22,9 ±1,1 39,2 ± 2,0 26,3 ± 1,3 19,4 ± 1,0 29,4 ± 1,5 17,1 ± 0,9 19,5 ± 1,0 43,8 ± 2,2 4,5 ± 0.5 Butein 2.5.2 Kết thử hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài X muta Bảng 2.2 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 hợp chất XM1-XM11 Hợp chất XM1 XM6 XM8 IC50 (µM) 4,9±0,24 11,5± 0,57 8,2 ± 0,41 4,4 ± 0,5 Butein 2.5.3 Kết nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài R providentiae Bảng 2.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất RP1-RP18 Hợp chất RP1 RP2 RP3 RP7 ĐC IC50 (µM) Hep-G2 84,70±3,45 13,99±2,13 71,26±3,99 56,03±2,25 2,03 ± 0,3 LU-1 84,82±6,67 14,75±1,30 63,38±2,45 62,20±3,41 1,96 ± 0,2 MCF-7 77,92±4,54 16,04±2,04 63,76±3,91 55,85±2,96 1,71 ± 0,2 HL-60 56,14± 4,08 14,76± 1,31 46,33± 2,58 48,30± 3,73 2,16 ± 0,1 ĐC: Sử dụng Ellipticine làm đối chứng dương SK-Mel 75,39± 4,83 11,16± 1,40 75,52± 6,69 37,96± 0,07 2,12 ± 0,3 2.5.4 Kết nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài X muta Bảng 2.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất XM1-XM11 Hợp chất XM1 XM2 XM3 XM4 XM5 XM6 XM7 XM8 XM11 ĐC Hep-G2 0,43±0,03 0,75±0,11 6,58±0,94 5,06±0,39 5,55±0,98 6,85±0,76 30,35±3,04 19,52±1,45 34,31±3,43 1,54 ± 0,37 LU-1 0,76±0,09 0,96±0,09 9,20±1,21 5,63±0,19 5,84±0,45 9,88±0,98 32,59±2,56 22,25±1,26 34,83±0,54 1,38 ± 0,16 IC50 (µM) MCF-7 0,44±0,05 0,79±0,05 7,36±1,16 5,32±0,67 5,68±0,89 7,82±0,53 24,85±1,21 24,85±0,91 37,96±1,01 1,18 ± 0,12 HL-60 0,62±0,08 0,88±0,17 7,84±0,85 5,65±0,42 6,58±0,94 9,19±0,72 22,95±0,95 16,79±0,74 19,14±1,58 1,34 ± 0,24 SK-Mel 0,77±0,13 1,02±0,11 11,23±0,33 5,45±0,91 6,24±0,96 7,51±0,69 35,92±4,87 23,04±2,47 36,63±1,40 1,91 ± 0,28 ĐC: Sử dụng Ellipticine làm đối chứng dương Đánh giá chế chống ung thư hợp chất XM1 dòng tế bào ung thư vú người MCF-7: Kết cho thấy hợp chất XM1 gây nên q trình apoptosis c a tế thơng qua àm thay đổi mức độ biểu c a protein liên quan tế ung thư vú người MCF-7 Đồng thời hợp chất tác động đến chu kì tế ung thư vú người MCF-7 pha G2/M CHƢƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài R providentiae 3.1.12 Hợp chất RP12: rhabdaprovidine G (hợp chất mới) Hình 3.30 Cấu trúc hóa học hợp chất RP12 hợp chất RP10 Hợp chất RP12 thu ưới dạng chất bột vô đ nh hình màu vàng nhạt Trên phổ khối ượng phân giải cao HR-ESI-MS c a RP12 xuất pic ion giả phân tử m/z 471.3461 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức phân tử C30H47O4, 471,3474), m/z 493,3289 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức phân tử C30H46O4Na, 493,3294), m/z 515,3390 [M+HCOO]- (tính tốn lí thuyết cho công thức phân tử C31H47O6, 515,3373); kết hợp với phổ 13 C-NM cho phép xác đ nh công thức phân tử c a RP12 C30H46O4 T công thức phân tử tr n t nh toán độ bất bão hòa c a RP12 Trên phổ 1H-NMR c a hợp chất RP12 xuất tín hiệu c a nhóm methyl singlet cộng hưởng δH 0,95, 1,05, 1,09, 1,50, 1,60, 1,68, 1,71 (3H, s); tín hiệu c a proton olefin δH 5,81 (d, J = 8,5 Hz), 5,10 (d, J = 6,5 Hz); tín hiệu c a proton oxymethine δH 4,15 (d, J = 5,5 Hz), 4,24 (br s), 4,70 (t, J = 6,5 Hz) Phân tích phổ 13C-NMR thấy xuất tín hiệu c a 30 car on đ có carbon thuộc nhóm carbonyl cộng hưởng δC 219,9; tín hiệu c a carbon olefin δC 121,8, 124,1, 131,6, 141,9 gợi ý cho s xuất liên kết đơi C-C; tín hiệu c a carbon oxymethine cộng hưởng δC 68,1, 76,3, 77,0; tín hiệu c a 22 carbon khác T liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR gợi ý hợp chất RP12 có dạng khung isomalabaricane, lớp hợp chất triterpene có nh n vòng ngưng tụ 6,6,5-tricyclic Cấu trúc c a RP12 bao gồm nhóm carbonyl, liên kết đơi C-C, vòng c a ch nh, d đốn có thêm vòng ph n mạch nhánh để phù hợp với độ bất bão hòa Các số liệu phổ NMR c a RP12 so sánh với số liệu c a hợp chất RP10 thấy g n trùng hớp t v trí C-1 đến C-8, gợi ý cho s thay đổi cấu trúc c a RP12 bắt đ u t vòng cạnh Hình 3.31 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất RP12 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR RP12 hợp chất tham khảo C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 * δCa,b 31,2 33,4 218,8 46,9 45,2 18,9 35,8 41,2 50,6 34,5 34,4 207,1 123,6 172,2 19,3 23,5 - δCa,b 32,9 33,8 219,9 47,2 45,7 19,4 34,4 42,6 54,1 36,0 77,0 76,3 54,9 54,0 36,4 68,1 121,8 49,8 24,1 141,9 16,6 39,8 26,6 124,1 131,6 25,7 17,8 29,3 19,4 36,5 δHa,c (mult., J = Hz) 1,73 (m)/ 2,57 (m) 2,32 (m)/ 2,70 (m) 2,48 (dd, 2,5, 12,5) 1,41 (m)/ 1,58 (m) 1,40 (m)/ 2,04 (m) 1,90 (d, 3,0) 4,24 (br s) 4,15 (d, 5,5) 1,72 (d, 5,5) 1,13 (d, 13,5)/ 2,26 (dd, 6,0, 13,5) 4,70 (br dd, 6,5, 8,5) 5,81 (d, 8,5) 2,65 (d, 4,5)/ 2,76 (d, 4,5) 0,95 (s) 1,71 (s) 2,06 (m)/ 2,11 (m) 2,08 (m)/ 2,14 (m) 5,10 (t, 6,5) 1,68 (s) 1,61 (s) 1,09 (s) 1,05 (s) 1,49 (s) CDCl3, b125MHz, c500MHz *δC số liệu c a hợp chất RP10 Các tương tác H-H phổ COSY gồm H-9 (δH 1,90)/H-11 (δH 4,24)/H-12 (δH 4,15)/H-13 (δH 1,71) tương tác HMBC t H-30 (δH 1,49) đến C- 13 (δC 54,9) giúp qui kết số liệu phổ vòng C (5 cạnh) c a hợp chất RP12 Khác với hợp chất RP9 RP10, s thay đổi hóa học c a C-11 (δC 77,0), C-12 (δC 76,3) C-13 (δC 54,9) a 12 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài X muta 3.2.1 Hợp chất XM1: araguspongine C Hình 3.51 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) hợp chất XM1 Hợp chất XM1 thu ưới dạng chất bột màu trắng, vơ đ nh hình Phân tích TLC nhận thấy hợp chất XM1 phản ứng ương tính với ung ch c a Dragen orff cho thấy hợp chất XM1 a a oi Hợp chất XM1 xác đ nh c công thức ph n tử C28H50O4N2 xác đ nh a vào phổ hối ph n giải cao H -ESIMS xuất pic ion giả ph n tử m/z: 479,3854 [M+H]+ (tính tốn thuyết cho công thức ph n tử C28H51O4N2, 479,3843) 477,3701 [M-H]- (t nh tốn thuyết cho cơng thức ph n tử C28H49O4N2, 477,3692) Kết hợp với 14 t n hiệu car on xuất tr n phổ 13C-NMR gợi ý cho hợp chất XM1 chất có cấu trúc đối xứng Do đ , ta c n làm sáng tỏ cấu trúc c a nửa phân tử Phân tích tín hiệu phổ cộng hưởng t hạt nhân 1D-NMR nhận thấy hợp chất XM1 có dạng khung macrocyclic bis-1-oxaquinolizidine Trên phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H-NM c a XM1 quan sát thấy h u hết tín hiệu proton xuất vùng trường cao δH 1,11 – 4,85 Trên phổ 13C-NMR DEPT c a XM1 xuất ba t n hiệu vùng oxymethine (δC 91,0, 77,6 72,0), mười t n hiệu methylene (δC 21,8 – 53,2) T đ c trưng phổ NM tr n c thể thấy XM1 hợp chất marcrocyc ic is 1oxaquinolizidine, ớp chất cơng ố có loài hải 13 mi n thuộc giống Xestospongia Các tương tác COSY ao gồm δH 1,58, 1,38 (H-16′)/δH 3,60 (H-2)/δH 1,79, 1,13 (H-3)/δH 2,99, 3,15 (H4) δH 3,09, 2,40, (H-6)/δH 1,94, 1,49 (H-17)/δH 1,54, 1,39 (H-9) đ chứng minh mảnh cấu trúc c a C-16/C-2/C-3/C-4 C-6/C-7/C8 Các tương tác HMBC t H-4 (δH 2,99, 3,15)/C-6 (δC 45,5)/C-10 (δC 91,0); H-10 (δH 4,10) đến C-4 (δC 53,2), C-6 (δC 45,5) độ chuyển d ch hóa học c a chúng cho thấy hai mảnh cấu trúc C10 nối với qua nguyên tử N để hình thành khung quinolizidine M t hác, tương tác HMBC t H-10 (δH 4,10)/C-2 (δC 77,6)/C-8 (δC 33,8)/C-9 (δC 72,0) giá tr δC c a C-2 xác nhận v trí C-1 thay nguyên tử oxy Bên cạnh đ , t n hiệu singlet c a proton H-10 tương tác HMBC t H-10 đến C-9/C-8/C11 (δC 41,3) cho thấy có nhóm hydroxy C-9 chu i carbon mạch thẳng liên kết C-9 Giả thiết chu i carbon mạch thẳng gồm nhóm CH2 bắt đ u t C-9, o đ tương tác COSY H-2 (δH 3,71)/H-16' (δH 1,61/1,45) hai nửa phân tử liên kết với dạng C-2/C-16': C-16/C-2' Như vậy, cấu trúc phẳng c a hợp chất XM1 đ xác đ nh Do cấu trúc c a XM1 có dạng bis-1oxaquinolizidine, chứa hệ thống hai vòng sáu cạnh ngưng tụ tương t decalin nên tồn cấu dạng b n cis ho c trans Hơn nữa, v trí C-1 b thay nguyên tử oxy nên khung 1-oxaquinolizidine có ba cấu dạng b n (1 dạng trans dạng cis) Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu proton c a H-2 (δH 3,60), H-3a (δH 1,79), H-4a (δH 3,15), H-6a (δH 3,09) H-8a (δH 1,54 ) có số tương tác JHaxial-axial lớn (10,5 ~ 13,5 Hz) tất chúng chiếm v trí axial Do đ , tương tác NOE H-10 (δH 4,10)/H2/H-4a xác nhận đ nh hướng axial c a H-10 (đối với vòng B) Và tương tác NOE H-8a (δH 1,54) H-11 (δH 1,70) cho thấy hướng equatorial c a H-11 o đ nh m hy roxy C-9 phải v trí axial Cuối cùng, tương tác NOE H-3a (δH 1,79) H-6a (δH 3,09) cho thấy XM1 tồn cấu dạng b n (b)-cis Do đ , cấu trúc hóa học c a XM1 đ xác đ nh, hợp chất đ phân lập t số loài hải mi n X exigua, Haloclona exigua có tên 14 thường gọi araguspongine C Các liệu 13C-NMR c a XM1 phân tích lại CDCl3 nhận thấy hồn tồn trùng khớp với số liệu 13C-NMR đ cơng ố c a hợp chất araguspongine C ung mơi đo NM Hình 3.52 Các cấu dạng bền khung 1-oxa-quinolizidine Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR XM1 hợp chất tham khảo C # δCd δCb, δCa, d b δHa,c (mult., J = Hz) 2, 2′ 76,8 76,4 77,6 3,60 (br dd, 10,5, 10,5) 3, 3′ 26,4 25,9 26,9 4, 4′ 52,9 52,4 53,2 6, 6′ 44,6 44,2 45,5 7, 7′ 21,3 20,8 21,8 1,79 (dddd, 4,0, 10,5, 13,0, 13,0) 1,13 (br d, 13,0) 3,15 (ddd, 2,5, 13,5, 13,5) 2,99 (br dd, 3,5, 13,5) 3,09 (br dd, 11,5, 11,5) 2,40 (br d, 11,5) 1,94 (m)/ 1,49 (m) 8, 8′ 30,0 29,6 33,8 9, 9′ 71,1 70,7 72,0 1,54 (ddd, 4,0, 11,0, 11,0) 1,39 (br d, 11,0) - 10, 10′ 90,7 90,3 91,0 4,10 (s) 11, 11′ 39,0 38,5 41,3 1,70 (ddd, 4,0, 13,0, 13,0)/1,23 (m) 12, 12′ 23,0 22,5 23,7 1,47 (m)/ 1,35 (m) 13, 13′ 32,7 32,2 33,0 1,30 (m)/ 1,28 (m) 14, 14′ 31,9 31,5 31,0 1,45 (m)/ 1,28 (m) 15, 15′ 25,3 24,9 26,3 1,60 (m)/ 1,33 (m) 16, 16′ 36,7 36,3 37,6 1,58 (m)/1,38 (m) a b CD3OD, 125MHz, c500MHz, dCDCl3, #δC số liệu c a araguspongine C 15 Hình 3.53 Các tương tác NOE phần khung 1-oxaquinolizidine hợp chất XM1 3.2.12 Tổng hợp hợp chất phân lập từ loài X muta XM1 XM11 T oài hải mi n Xestospongia muta đ ph n ập xác đ nh cấu trúc c a 11 hợp chất (XM1-XM11) (Hình 3.78): tất 11 hợp chất đ u thuộc macrocyc ic bis-quinolizidine alkaloid, đ c hợp chất (XM2) đ t t n meso - araguspongine C 10 hợp chất đ iết: araguspongine C (XM1), araguspongine N-P (XM3-XM5), araguspongine A (XM6), araguspongine E (XM7), araguspongine L (XM8), petrosin (XM9), petrosin A (XM10), aragupetrosine A (XM11) Có thể thấy, cấu trúc c a hợp chất tạo thành hai đơn v 1-oxa-quino izi ine, hai đơn v quinolizidine, hay kết hợp đơn v 1-oxa-quino izi ine đơn v quinolizidine Một số hợp chất có cấu trúc hóa học dạng đối xứng XM1, XM2, XM3, XM9, XM10 Các điểm bật phân tích cấu trúc hợp chất phân lập t loài X muta sau: - Hợp chất XM2 xác đ nh hóa lập thể d a việc phân tích chi tiết số tương tác J c a proton, phân tích cấu dạng tương tác hơng gian tr n phổ NOESY - Các hợp chất XM3-XM4 hợp chất cũ đ y n đ u tiên hợp chất biện giải cấu trúc phân tích hóa học lập thể - Các hợp chất macrocyc ic is-1-oxa-quino izi ine tìm thấy 20 hợp chất thơng báo có 16 ồi hải mi n giống Xestospongia Vì thế, hợp chất XM1XM11 c thể sử ụng hợp chất mar er đ nh anh oài hải mi n giống Xestospongia Hình 3.78 Cấu trúc hóa học hợp chất XM1-XM11 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 3.3.1 Hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài R providentiae Sau hi đánh giá sơ ộ tác dụng ức chế s sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS c a 18 hợp chất (RP1RP18) nồng độ 80 µM, hợp chất RP2, RP5, RP7-RP16 không g y độc tế bào có khả ức chế >50% s sản sinh NO 17 tế BV2 Do đ , chất tiếp tục thí nghiệm nồng độ khác để xác đ nh giá tr IC50 Kết (Bảng 2.1) cho thấy: Hợp chất RP2 thể tác dụng ức chế sản sinh NO tế bào BV2 tốt với giá tr IC50 7,4 ± 0,4 µM Các hợp chất RP7, RP9, RP11-RP15 thể tác dụng ức chế sản sinh NO đáng ý với giá tr IC50 17,1-29,4 µM Các hợp chất RP8, RP10, RP16 thể tác dụng ức chế sản sinh NO với giá tr IC50 39,2-46,8 µM Còn lại hợp chất RP5 thể tác dụng ức chế sản sinh NO tế bào BV2 yếu với giá tr IC50 75,3 ± 3,8 µM Theo tổng quan tài liệu, chưa c nghi n cứu v hoạt tính kháng viêm c a hợp chất khung isomalabaricane analog Nghiên cứu sử dụng làm ti n đ cho nghiên cứu s u v hoạt tính kháng viêm c a hợp chất RP2, RP7, RP9, RP11-RP15 3.3.2 Hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập từ loài X muta Kết đánh giá s ảnh hưởng c a 11 hợp chất (XM1XM11) đến s phát triển c a tế bào BV2 nồng độ thử nghiệm (20, 40 80 µM) cho thấy hợp chất XM2-XM5, XM7 gây chết tế bào (>30%) nồng độ 40 80 µM Tuy vậy, hợp chất khơng ảnh hưởng đến s phát triển ình thường c a tế bào BV2 nồng độ < 20 µM Còn hợp chất XM9-XM11 ức chế 100 µM) dòng tế bào T kết trên, nhận thấy hợp chất RP1-RP3 với cấu trúc isomalabaricane analog 29C thể hoạt t nh g y độc tế bào dòng tế ung thư thử nghiệm, hợp chất lại có cấu trúc isomalabaricane ana og 19C đến 25C khơng thể hoạt tính Hợp chất RP7 với đồng phân 13E thể hoạt tính hi đồng phân 13Z (RP6) khơng thể hoạt t nh Đi u hoàn toàn phù hợp so với nghiên cứu trước đ y rằng: hợp chất isomalabaricane analog với ph n mạch nhánh ài thể hoạt t nh g y độc tế bào mạch hợp chất có mạch nhánh ngắn, đồng phân 13E thể hoạt tính mạnh đồng phân 13Z M t khác, hợp chất RP2 với có cấu hình liên kết đơi 20(22)Z có hoạt tính g y độc tế tăng đáng ể so với đồng phân 20(22)E (RP1), cho thấy cấu hình c a liên kết đơi C-20/C-22 đ nh tới hoạt t nh g y độc tế bào c a hợp chất isomalabaricane analog 3.3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài X muta Kết đánh giá hoạt t nh g y độc tế bào in vitro c a 11 hợp chất phân lập t lồi hải miên X muta (XM1-XM11) dòng tế ung thư người: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HL-6, SK-Mel- 19 (Bảng 2.4) cho thấy: Các hợp chất XM1, XM2 (IC50 0,43-1,02 µM) thể hoạt t nh g y độc tế bào dòng tế ung thư thử nghiệm mạnh đối chứng ương Ellipticine (IC50 1,18-1,91 µM) Các hợp chất XM3-XM6 thể hoạt tính đáng ý với giá tr IC50 4,71-11,23 µM Các mẫu XM7, XM8, XM11 có khả g y độc tế bào với giá tr IC50 khoảng 16,79-37,96 µM Các mẫu lại chưa thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu dòng tế ung thư thử nghiệm T kết nhận đưa nhận xét sau: hợp chất tạo thành t hay đơn v 1-oxa-quinolizidine (XM1XM8, XM11) thể hoạt t nh g y độc tế bào hợp chất không chứa đơn v 1-oxa-quinolizidine (XM9, XM10) khơng thể hoạt tính Đối với chất dạng khung bis-1-oxaquinolizidine: hợp chất không chứa nhóm methyl C-3 C-3′ (XM1, XM2) thể hoạt tính g y độc tế bào mạnh hẳn hợp chất có nhóm methyl (XM3, XM4, XM5) Hợp chất XM8 với nguyên tử N-Oxide so với XM1 thể khả ức chế dòng tế ung thư thử nghiệm yếu hẳn so với XM1 Đánh giá chế chống ung thư hợp chất XM1: Hợp chất XM1 (araguspongine C) có hoạt tính ức chế s phát triển dòng tế ung thư thử nghiệm mạnh nên l a chọn để tiếp tục đánh giá chế chống ung thư dòng tế ung thư vú MCF-7 a Đánh giá tác động hợp chất XM1 đến chu kì tế bào ung thư vú người MCF-7 sau 48 xử lí với hợp chất XM1 nồng độ 10µM: Hình 3.79 Tác động hợp chất XM1 đến chu kì tế bào MCF-7 20 Bảng 3.30 Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 pha G0/G1, S, G2/M apoptosis (sub-G1) sau 48 xử lí với hợp chất XM1 nồng độ 10µM % Tế bào pha chu trình phân bào Mẫu % sub-G1 %G0/G1 %S %G2/M Control 0,01 54,92 38,39 5,93 XM1_2µM 0,05 53,10 34,79 9,19 XM1_10µM 0,03 40,00 19,11 24,86 Qua phân tích flow cytometry, tỉ lệ tế bào MCF-7 pha G0/G1 pha S giảm d n theo s gia tăng nồng độ c a hợp chất XM1 Ph n trăm tế bào giai đoạn G2/M tăng n 24,86% sau xử lí với hợp chất XM1 nồng độ 10µM sau 48 (Hình 3.79, Bảng 3.30) Đi u cho thấy hợp chất XM1 tác động đến chu kì tế bào pha G2/M b Đánh giá tác động hợp chất XM1 lên thay đổi hình thái tế bào MCF-7 nồng độ 10µM Hình 3.80 Tác động hợp chất XM1 nồng độ 10µM lên hình thái tế bào ung thư vú người MCF-7 Kết kiểm tra hình thái tế bào MCF-7 xử lí với hợp chất XM1 sau 48 cho thấy tế đ c s co lại sáng c a số nhân tế bào (do s cô đ c c a nhiễm sắc thể) thể đ c trưng xuất nhi u nồng độ 10µM Mật độ tế bào MCF-7 giảm rõ rệt sau xử lí với hợp chất MCF-7 nồng độ 10µM (Hình 3.80) Các đ c điểm hình thái cho thấy tế bào t chết theo chương trình (apoptosis) sau hi xử lí với hợp chất XM1 c Đánh giá tác động hợp chất XM1 lên trình tự chết tế bào ung thư vú người MCF-7 nồng độ 10µM 21 Hình 3.81 Tác động cùa hợp chất XM1 lên trình tự chết tế bào MCF-7 Kết (Hình 3.81) cho thấy hợp chất XM1 gây trình t chết (apoptosis) tế bào MCF-7 Tỉ lệ apoptotic cells tăng t 2.79% mẫu control lên 50.74% mẫu xử lí với hợp chất XM1 nồng độ 10µM d Đánh giá tác động hợp chất XM1 đến biểu protein dòng tế bào MCF-7 nồng độ 1, 10µM Hình 3.82 Ảnh hưởng hợp chất XM1 đến biểu Caspase 3, Bcl-2, Bax protein dòng tế bào MCF-7 nồng độ 1, 10µM Ảnh hưởng c a hợp chất XM1 đến biểu c a Caspase 3, Bcl-2, Bax protein dòng tế bào MCF-7 nồng độ 1, 10µM đánh giá ằng phương pháp Western blot Kết cho thấy, nồng độ 3-10µM, hợp chất XM1 làm giảm biểu c a Bcl2 protein tăng iểu c a Bax Caspase -3 (Hình 3.82) KẾT LUẬN Đ y cơng trình nghi n cứu đ u tiên v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a hai loài hải miên Rhabdastrella 22 providentiae Xestospongia muta thu thập vùng biển mi n Trung Việt Nam Nghiên cứu thành phần hóa học Sử dụng kết hợp phương pháp sắc ý phương pháp phổ đại đ ph n ập xác đ nh cấu trúc 29 hợp chất t hai loài hải miên R providentiae X muta Trong đ , c 13 hợp chất Cụ thể: - Từ loài R providentiae phân lập xác định cấu trúc 18 hợp chất (RP1-RP18): bao gồm 12 hợp chất (RP1-RP12) đ t tên là: rhabdastrellin G-K (RP1-RP5), rhabdaprovidine A-G (RP6-RP12) hợp chất đ iết: jaspolide C (RP13), globostelletin C (RP14), globostelletin D (RP15), jaspiferin A (RP16), mollisolactone A (RP17), gibepyrone F (RP18) - Từ loài X.muta phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất (XM1-XM11): tất 11 hợp chất đ u thuộc macrocyclic bisquino izi ine a a oi , đ c hợp chất (XM2) đ t t n meso - araguspongine C 10 hợp chất đ iết: araguspongine C (XM1), araguspongine N (XM3), araguspongine O (XM4), araguspongine P (XM5), araguspongine A (XM6), araguspongine E (XM7), araguspongine L (XM8), petrosin (XM9), petrosin A (XM10), aragupetrosine A (XM11) Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Đ tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tr n òng tế bào ung thư người: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU1),ung thư vú (MCF-7), ung thư ạch c u cấp (HL-60), ung thư a (SK-Mel-2) c a 18 hợp chất (RP1-RP18) phân lập t loài hải miên R providentiae 11 hợp chất (XM1-XM11) phân lập t loài hải miên X muta Kết cho thấy: + Hợp chất RP2 thể hoạt t nh g y độc tế bào mạnh dòng tế ung thư thử nghiệm với giá tr IC50 khoảng 11,16-16,04 µM Các hợp chất RP1, RP3, RP7 thể hoạt tính gây độc tất dòng tế ung thư thử nghiệm với giá IC50 khoảng 37,96-84,82 (µM) 23 + Các hợp chất XM1, XM2 (IC50 0,43-1,02 µM) thể hoạt tính g y độc tế bào dòng tế ung thư thử nghiệm mạnh đối chứng ương Ellipticine (IC50 1,18-1,91 µM) Các hợp chất XM3XM6 thể hoạt tính đáng ý với giá tr IC50 4,71-11,23 µM Các mẫu XM7, XM8, XM11 có khả g y độc tế bào với giá tr IC50 khoảng 16,79-37,96 µM Nghiên cứu chế gây chết tế ung thư MCF-7 c a hợp chất XM1 theo hình thái tế bào cấp độ phân tử đ hợp chất XM1 tác động đến chu kì tế ung thư vú người MCF-7 pha G2/M Đồng thời hợp chất g y n n trình apoptosis c a tế thông qua àm thay đổi mức độ biểu c a protein i n quan (tăng iểu c a Bax, Caspase-3 giảm biểu Bcl-2) tế ung thư vú người MCF-7 - Đ nghi n cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế s sản sinh NO tế bào BV2 c a 18 hợp chất (RP1- RP18) phân lập t loài R providentiae 11 hợp chất (XM1-XM11) phân lập t loài hải miên X muta Kết cho thấy: + Trong số hợp chất RP1-RP18, hợp chất RP2 thể khả ức chế sản sinh NO mạnh với giá tr IC50 7,4 ± 0,4 µM, hợp chất RP7, RP9, RP11-RP15 ức chế sản sinh NO với giá tr IC50 đáng ý 17,1-29,4 µM, hợp chất RP8, RP10, RP16 thể hoạt tính kháng viêm với giá tr IC50 39,2-46,8 µM + Các hợp chất XM1, XM6, XM8 thể hoạt tính kháng viêm đáng ý với giá tr IC50 khoảng 4,98-11,58 µM, đ c biệt hợp chất XM1 có khả ức chế s sản sinh NO tế bào BV2 với giá tr IC50 4,9 µM g n tương đương với đối chứng ương utein (IC50 4,4 µM) KIẾN NGHỊ T kết nghiên cứu v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a lồi hải miên R providentiae X muta nhận thấy: Hợp chất XM1 tác động đến chu kì tế ung thư vú người MCF-7 pha G2/M đồng thời g y n n trình apoptosis c a tế bào thông qua àm thay đổi mức độ biểu c a protein liên quan 24 tế ung thư vú người MCF-7 Cho thấy đ y hợp chất ti m việc nghiên cứu phát triển thuốc u tr ung thư vú Vì c n có nghiên cứu s u v chế g y độc tế bào dòng tế ung thư vú hác cấp độ in vivo Các hợp chất isomalabaricane analog RP1-RP3, RP7 chất phân lập t lồi hải miên R providentiae có ti m để phát triển thành thuốc chống ung thư Vì vậy, c n có nghiên cứu s u để àm rõ chế tác động c a hợp chất đ , đ c biệt hợp chất rhabdastrellin H (RP2) với giá tr IC50 11,16-16,04 µM Các hợp chất XM1, RP2 thể hoạt tính ức chế s sản sinh NO BV2 kích thích LPS đáng quan t m với giá tr IC50 l n ượt 4,9µM 7,4 µM Do vậy, c n nghiên cứu thêm thí nghiệm kháng viêm c a hợp chất cấp độ in vivo NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đ y nghi n cứu đ u tiên v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a loài hải miên Rhabdastrella providentiae giới Đồng thời nghiên cứu đ u tiên Việt Nam v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a loài hải miên Xestospongia muta T hai loài đ ph n ập xác đ nh cấu trúc c a: 13 hợp chất mới: rhabdastrellin G-K (RP1-RP5), rhabdaprovidine AG (RP6-RP12); meso - araguspongine C (XM2) Đ c iệt cấu hình tuyệt đối c a hợp chất RP11, RP12 xác đ nh thông qua phổ NOESY CD - L n đ u ti n thử hoạt tính kháng viêm thơng qua khả ức chế sản sinh NO c a hợp chất khung isomalabaricane khung macrocyclic quinolizidine - L n đ u tiên thử hoạt t nh g y độc tế ung thư c a 13 hợp chất 25 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Phan Van Kiem, Duong Thi Dung, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong Quang, Bui Huu Tai, and Chau Van Minh New isomalabaricane analogues from the sponge Rhabdastrella providentiae and their cytotoxic activity Phytochemistry letters, 2018 (26), 199-204 Duong Thi Dung, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong Quang, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Dong Cheol Kim, Hyuncheol Oh, Youn Chul Kim, and Phan Van Kiem New acetylated terpenoids from sponge Rhabdastrella providentiae inhibit NO production in LPS stimulated BV2 cells Natural Product Communications, 2018, 13 (6), 661-664 Duong Thi Dung, Dan Thi Thuy Hang, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong Quang, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen Thi Hoai, Do Cong Thung, and Chau Van Minh, Phan Van Kiem Rhabdaprovidines D-G, four new 6,6,5-tricyclic terpenoids from the Vietnamese sponge Rhabdastrella providentiae Natural Product Communications, 2018, 13(10), 1251-1254 Duong Thi Dung, Dan Thi Thuy Hang, Pham Hai Yen, Tran Hong Quang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, YounChul Kim, Dong Cheol Kim, Hyuncheol Oh, and Phan Van Kiem Macrocyclic bis-quinolizidine alkaloids from Xestospongia muta Natural Products Research, https://doi.org/10.1080/14786419 2018.1455043 Dương Th Dung, Đan Th Thúy Hằng, Phạm Hải Yến, Nguyễn Xuân Nhiệm, Tr n Hồng Quang, Bùi Hữu Tài, Phan Văn Kiệm Nghiên cứu thành ph n hóa học lồi hải miên Rhabdastrella providentiae Tạp chí Hóa học, 2018, 56(1), 81-85 Duong Thi Dung, Nguyen Xuan Nhiem, Do Thi Trang, Pham Hai Yen, Tran Hong Quang, Hoang Le Tuan Anh, Do Cong Thung, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Phan Van Kiem Isolation of isomalabaricane analog from the sponge Rhabdastrella providentiae Vietnam journal of chemistry, 2017, 55(6e), 38-41 Duong Thi Dung, Nguyen Thi Cuc, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong Quang, Hoang Le Tuan Anh, Do Cong Thung, Do Thi Thao, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Phan Van Kiem Petrosin and petrosin A from the Vietnamese sponge Xestospongia muta Vietnam journal of chemistry, 2017, 55(6e), 72-75 ... n cứu đ u tiên v thành ph n hóa học hoạt tính sinh học c a hai loài hải miên Rhabdastrella 22 providentiae Xestospongia muta thu thập vùng biển mi n Trung Việt Nam Nghiên cứu thành phần hóa học. .. vật biển nói chung nước ta quan trọng Xuất phát t điểm đ , đ tài Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào kháng viêm hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae Xestospongia muta. .. muta vùng biển Trung Việt Nam đ l a chọn Mục tiêu luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành ph n hóa học c a hai lồi hải miên Rhabdastrella providentiae Xestospongia muta thu vùng biển Trung Việt Nam