TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS Ử DỤNG MA TRẬN PLACKETTBURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT – PHƯƠNG ÁN CẤU TRÚC CÓ TÂM

TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS SỬ DỤNG MA TRẬN PLACKETT-BURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT – PHƯƠNG ÁN CẤU TRÚC CÓ TÂM Tác giả HUỲNH THỊ THANH HIỀN Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản vi sinh thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: ThS Bùi Hồng Quân Tháng 08 năm 2010 i    LỜI CẢM ƠN Con kính tặng thành cho Ba Mẹ thành viên gia đình, người ni dưỡng, dạy dỗ nên người, khuyên nhủ, động viên chia xẻ vui buồn sống Mãi ghi nhớ công ơn Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho kiến thức quý báu Xin cho em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Bùi Hồng Quân tận tình giúp đỡ nhiệt tình hướng dẫn cho em thời gian thực đề tài Cảm ơn tập thể Vi sinh 32 động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài cho tơi kỷ niệm khó phai đời sinh viên Một lần xin cảm ơn tất Huỳnh Thị Thanh Hiền ii    TÓM TẮT Đề tài “Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Bacillus licheniformis sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp đáp ứng bề mặt – phương án cấu trúc có tâm” thực phòng thí nghiệm hóa sinh thuộc viện công nghệ sinh học thực phẩm đại học Cơng Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 8/03/2010 đến 30/06/2010 Đề tài gồm phần chính: Trong phần 1, chúng tơi tiến hành thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng B licheniformis để xác định mức độ tăng trưởng vi khuẩn từ tìm thời điểm bổ sung giống thích hợp (tuổi giống) Kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn phát triển nhanh đạt mật độ cao sau 25 nuôi cấy điều kiện nhiệt độ thường chế độ lắc Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng có ý nghĩa lên mật độ vi sinh vật Trong phần 2, khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường nuôi cấy lên sản lượng lipase Thí nghiệm trải qua hai giai đoạn: thí nghiệm sàng lọc thí nghiệm Thí nghiệm sàng lọc sử dụng ma trận Plackett-Burman để xác định yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng lipase Kết thí nghiệm cho thấy CaCl2, tỷ lệ giống dịch chiết nấm men ba yếu tố có ảnh hưởng đến sản lượng lipase với hệ số ảnh hưởng 3,25; 3,09; 2,67 Thí nghiệm thiết kế theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)phương án cấu trúc có tâm Giá trị tối ưu ba yếu tố để đạt sản lượng lipase cao xác định sau tỷ lệ CaCl2 (1,52%), tỷ lệ giống (4,39%) dịch chiết nấm men (3,63%) cho sản lượng lipase cực đại theo mơ hình 20,5327 U/ml iii    MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Bacillus licheniformis .3 2.1.1 Đặc điểm B licheniformis 2.1.2 Các nghiên cứu B licheniformis 2.1.3 Tác hại 2.1.4 Ứng dụng 2.2 Tổng quan enzym lipase 2.2.1 Cấu tạo 2.2.2 Cấu trúc 2.2.3 Các phản ứng xúc tác lipase 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp lipase 2.2.4.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng 2.2.4.1.1.Ảnh hưởng nguồn cacbon 2.2.4.1.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 10 2.2.4.1.3 Ảnh hưởng nguồn khoáng 10 2.2.4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi 10 2.2.4.2.1 pH môi trường .10 2.2.4.2.2 Độ thơng khí .11 iv    2.2.4.2.3 Mật độ tế bào .11 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase 11 2.2.5.1 Nhiệt độ 11 2.2.5.2 pH 11 2.2.5.3 Hoạt độ nước 12 2.2.5.4 Ion kim loại 12 2.2.6 Nguồn thu nhận 13 2.2.6.1 Động vật 13 2.2.6.2 Thực vật 14 2.2.6.3 Vi sinh vật .14 2.2.7 Ứng dụng 15 2.2.7.1 Trong công nghệ thực phẩm 16 2.2.7.2 Trong mỹ phẩm .17 2.2.7.3 Trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp giấy 17 2.2.7.4 Trong y học 18 2.2.7.5 Trong cơng nghiệp tẩy rửa, xử lí nước thải 18 2.2.7.6 Trong công nghiệp hóa dầu, nơng nghiệp 19 2.2.7.7 Dầu sinh học 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm 20 3.2 Vật liệu hóa chất sử dụng 20 3.2.1 Chủng vi sinh vật 20 3.2.2 Hóa chất 20 3.2.3 Thiết bị sử dụng 20 3.2.4 Môi trường nghiên cứu .21 3.3 Bố trí thí nghiệm 21 3.3.1 Thí nghiệm xác định mức độ tăng trưởng vi khuẩn .21 3.3.2 Thí nghiệm xác định thành phần môi trường 21 3.3.2.1 Thí nghiệm sàng lọc 21 3.3.2.2 Thí nghiệm .22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 v    3.4.1 Phương pháp vi sinh vật 25 3.4.2 Phương pháp hóa sinh 25 3.5 Phương pháp xử lí số liệu .26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng B licheniformis 27 4.1.1 Thí nghiệm 27 4.1.2 Kết 27 4.2 Thí nghiệm sàng lọc .28 4.2.1 Thí nghiệm 28 4.2.2 Kết 28 4.3 Thí nghiệm 32 4.3.1 Thí nghiệm 32 4.3.2 Kết 33 4.3.2.1 Kết ảnh hưởng tỷ lệ CaCl2 35 4.3.2.2 Kết ảnh hưởng tỷ lệ giống 36 4.3.2.3 Kết ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết nấm men .37 4.3.2.4 Kết ảnh hưởng qua lại cặp yếu tố .38 4.3.2.4.1 Tìm điểm cực trị bề mặt đáp ứng thu yếu tố phạm vi nghiên cứu .39 4.3.2.4.2 Tìm điểm cực trị bề mặt đáp ứng thu tỷ lệ giống thấp 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận .43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC 59 vi    DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CCD: Central Composite Design CV: Coefficient of Variation df: Degree of freedom MS: Mean squares NA: Nutrient Broth Agar NB: Nutrient Broth RSM: Response Surface Methodology SnDL: Snail digestive lipase SS: Sum of squares     vii    DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các tác nhân ức chế xúc tác hoạt động lipase vi khuẩn 12 Bảng 2.2: Ứng dụng lipase ngành công nghiệp 15 Bảng 3.1: Các biến ma trận Plackett-Burman 23 Bảng 3.2: Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman 23 Bảng 3.3: Nồng độ yếu tố dùng RSM-CCD 24 Bảng 3.4: Môi trường theo RSM-CCD để tối ưu hóa sản lượng lipase 24 Bảng 4.1: Sản lượng lipase thu thí nghiệm sàng lọc yếu tố .29 Bảng 4.2: Ảnh hưởng biến ma trận Plackett – Burman .30 Bảng 4.3: Sản lượng lipase thu thí nghiệm CCD .32 Bảng 4.4: Bảng ANOVA yếu tố khảo sát 34   Bảng 4.5: Các giải pháp để thu sản lượng lipase cao 39 Bảng 4.6: Các điểm cực trị thu từ mơ hình (bề mặt đáp ứng) 41 viii    DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: B licheniformis Hình 2.2: cấu trúc lipase B subtilis .8 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng B licheniformis mơi trường NB 27 Hình 4.2: Ảnh hưởng tỷ lệ CaCl2 lên sản lượng lipase B licheniformis 35 Hình 4.3: Ảnh hưởng tỷ lệ giống lên sản lượng lipase B licheniformis .36 Hình 4.4: Ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết nấm men lên sản lượng lipase B licheniformis 37 Hình 4.5: Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo CaCl2 tỷ lệ giống 38 Hình 4.6: Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống chiết nấm men 38   ix      Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Enzym chất xúc tác sinh học tạo thành tế bào sinh vật Nó đóng vai trò quan trọng thiếu trao đổi chất Nhiều enzym nghiên cứu sử dụng ngành công nghiệp công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, cơng nghiệp hóa dầu, cơng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa (Choi ctv, 2006) Lipase chiếm khoảng 5% thị trường enzym, đứng sau protease carbohydrase thị trường enzym giới (Vakhlu Kour, 2006) Lipase ngày ứng dụng nhiều ngành cơng nghiệp: thực phẩm, hố học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da cơng nghiệp tẩy rửa Lipase tìm thấy thực vật, động vật vi sinh vật Giống carbohydrase protease, lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật có tầm quan trọng thương mại nghiên cứu so với lipase từ thực vật động vật có ưu điểm sau:  Một lượng lớn lipase tinh sản xuất thời gian ngắn  Lipase từ vi khuẩn nói chung ổn định lipase từ động vật thực vật  Lipase hoạt động điều kiện nhiệt độ áp suất ôn hòa giúp tiết kiệm chi phí cho tiêu phí lượng q trình xử lý so với phương pháp truyền thống  Enzym sản xuất từ vi sinh vật có khả chịu nhiệt mơi trường hóa chất bất lợi ổn định nhiệt độ cao  Do tính đặc hiệu enzym, sản phẩm không mong muốn thường xuất phản ứng giảm giới hạn  Lipase hoạt động dung mơi hữu dùng công nghiệp 1    30 Esakkiraj P., Dhas G.A.J., Palavesam A., Immanuel G., 2010 Media preparation using tuna-processing wastes for improved lipase production by shrimp gut isolate Staphylococcus epidermidis CMST Pi Applied Biochemistry and Biotechnology 160:1254 - 1265 31 Fadõloğlu S., Söylemez Z., 1997 Kinetics of lipase catalyzed hydrolysis of olive oil Food research international 30(3 - 4): 171 - 175 32 Feijoo S.C., Hayes W.W., Watson C.E., Martin J.H., 1997 Effects of Microfluidizer® technology on Bacillus licheniformis spores in ice cream mix Journal of Dairy Science 80(9): 2184-2187 33 Fregolente P.B.L., Fregolente L.V., Pinto G.M.F., Batistella B.C., Maciel M.R.W., Filho R.M., 2008 Monoglycerides and diglycerides synthesis in a solvent-free system by lipase-catalyzed glycerolysis Applied Biochemistry and Biotechnology 146(1 - 3): 165 - 172 34 Fregolente P.B.L., Pinto G.M.F., Maciel M.R.W., Filho R.M., 2009 Monoglyceride and diglyceride production through lipase-catalyzed glycerolysis and molecular distillation Applied Biochemistry and Biotechnology 160(7): 1879 - 1887 35 Freitas de L., Santos dos J.C., Zanin G.M., Castro de H.F., 2009 Packed-bed reactor running on babassu oil and glycerol to produce monoglycerides by enzymatic route using immobilized burkholderia cepacia lipase Applied Biochemistry and Biotechnology 161(1 - 8): 372 - 381 36 Froyshov O., Laland S.G., 1974 On the biosynthesis of bacitracin by a soluble enzyme complex from Bacillus licheniformis European Journal of Biochemistry 46(2): 235 - 242 37 Gangadhara, Kumar P.R., Prakash V., 2009 The structure functional catalytic activity of rice bran lipase in the presence of selenium and lithium European Food Research and Technology 230(4): 551 - 557 38 Ghaly A.E., Arab F., Mahmoud N.S., Higgins J., 2007 Production of levan by Bacillus licheniformis for use as a soil sealant in earthen manure storage structures American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3(2): 47 54 39 Govender V., 2005 Evaluation of biological control systems for control of mango post-harvest diseases MSc Thesis, University of Pretoria 40 Gray G.L., Mainzer S.E., Rey M.W., Lamsa M.H., Kindle K.L., Carmona C., Requadt C., 1986 Structural genes encoding the thermophilic α-Amylases 48     of Bacillus stearothermophilus and Bacillus licheniformis Journal of Bacteriology 166(2): 635 - 643 41 Gupta N., Mehra G., Gupta R., 2004 A glycerol-inducible thermostable lipase from Bacillus sp.: medium optimization by a Plackett–Burman design and by response surface methodology.Canadian Journal of Microbiology 50: 361 - 368 42 Hasan F., Shah A.A., Hameed A., 2006 Industrial applications of microbial lipases Enzyme and Microbial Technology 39: 235 - 251 43 Heravi K.M., Eftekhar F., Yakhchali B., Tabandeh F., 2008 Isolation and Identification of a lipase producing Bacillus sp from soil Pakistan Journal of Biological Sciences 11(5): 740 - 745 44 Horsmans P.C., Borch S.J., 2005 Use lipases for improving doughs and baked products European Patent Application No 1559788 45 Ingham E., Holland K.T., Gowland G., Cunliffe W.J., 1981 Partial purification and characterization of lipase from Propionibacterium acnes Journal of General Microbiology, 124(2): 393 - 401 46 Ishihara K., Kwon I.S., Masuoka N., Nakajima N., Hamada H., 2010 Oneprocedure synthesis of capsiate from capsaicin by lipase-catalyzed dynamic transacylation World Journal of Microbiology and Biotechnology, DOI 10.1007/s11274-009-0304-z 47 Islam M.A., Parveen F., Hossain K., Khatun S., Karim Md.R., Kim G.S., Absar N., Haque Md S., 2009 Purification and Biochemical Characterization of Lipase from the Dorsal Part of Cirrhinus reba Thai Journal of Agricultural Science 42(2): 71 - 80 48 Jaeger K.E., Eggert T., 2002 Lipases for biotechnology Current Opinion in Biotechnology 13(4): 390 - 397 49 Jars M.U., 1992 Dertergent compsitions comprising a Pseudomonas lipase and a specific protease United States Patent Application Publication No 5078898 50 Jerome S., Marie-P.L., 1999 Application of lipase in brewing International Application Published Under The Patent Cooperation Treaty (PCT), WO 99/49011 49     51 Jonsson U., Snygg B.G., 1974 Lipase production and activity as a function of incubation time, ph and temperature of four lipolytic micro-organisms J appl Bact 37: 671 - 681 52 Kampfer P., Andersson M.C., Buzalski T.H., Scoging A.C., 1999 Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning Applied and Environmental Microbiology 65(10): 4637 - 4645 53 Karout A., Pierre A.C., 2009 Partial transesterification of sunflower oil with ethanol by a silica fiber reinforced aero gel encapsulated lipase Journal of Sol-Gel Science and Technology 52(2): 276 - 286 54 Katada M., Masui K., Oomura H., Tanaka Y., Kondo M., Komori T., 1992 Diacylglycerin and cosmetic composition United States Patent Application Publication No 5080889 55 Kenealy W.R., Jeffries T.W., 2003 Enzyme processes for pulp and paper: a review of recent developments In Wood deterioration and preservation: advances in our changing world, San Diego, California, April 1-5, 2001 (Eds Goodell B., Nicholas D.D., Schultz T.P.) ACS symposium series, trang 210 - 215 56 Kenthorai R.J., Leong J.Y., Eng S.C., Pogaku R., 2009 Design an immobilized lipase enzyme for biodiesel production Journal of renewable and sustainable energy 1(6): - 57 Khiyami M., Masmali I., 2008 Characteristics of thermostable chitinase enzymes of Bacillus licheniformis isolated from red palm weavil gut Australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(4): 943 - 948 58 Khyami H H., 1996 Thermotolerant strain of Bacillus licheniformis producing lipase World Journal of Microbiology and Biotechnology 12: 399 - 401 59 Kim K.R., Kwon D.Y., Yoon S.H., Kim W.Y., Kim K.H., 2005 Purification, refolding, and characterization of recombinant Pseudomonas xuorescens lipase Protein Expression and Purification 39: 124 - 129 60 Kouker G., Jaeger K.E., 1987 Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases Applied and Environmental Microbiology 53: 211 - 213 61 Lee J.H., Kim S.B., Park C., Tae B., Ha S.O., Kim S.W., 2009 Development of batch and continuous processes on biodiesel production in a packed-bed reactor by a mixture of immobilized Candida rugosa and Rhizopus oryzae lipases Applied Biochemistry and Biotechnology 161(1 - 8): 365 - 371 50     62 Lima V.M.G., Krieger N., Sarqui M.I.M, David A Mitchell D.A., Luiz P Ramos L.P.,và José D Fontana J.D., 2003 Effect of nitrogen and carbon sources on lipase production by Penicillium aurantiogriseum Food Technology and Biotechnology 41(2): 105 - 110 63 Lin S.F., Chiou C.M., Yeh C.M., Tsai Y.C., 1996 Purification and partial characterization of an alkaline lipase from Pseudomonas pseudoalkaligenes F-111 Applied Environmental and Microbiology 62(3): 1093 - 1095 64 Lin Z., Zhou C., Wu J., Cheng H., Liu B., Ni Z., Zhou J., Fu J., 2002 Adsorption and reduction of palladium (Pd2+) by Bacillus licheniformis R08 Chinese Science Bulletin 47(15) 65 Liu W., Beppu T., Arima K., 1973 Effect of various inhibitors on lipase action of thermophilic fungus Humicola lanuginosa S-38 Agric Biol Chem., 37: 2487 - 2492 66 Ma J., Zhang Z., Wang B., Kong X., Wang Y., Cao S., Feng Y., 2006 Overexpression and characterization of a lipase from Bacillus subtilis Protein Expression and Purification 45: 22 - 29 67 Maeshima M., Beevers H., 1985 Purification and properties of glyoxysomal lipase from castor bean Plant Physiology 79(2): 489 - 493 68 Maki K.C., Davidson M.H., Tsushima R., Matsuo N., Tokimitsu I., Umporowicz D.M., Dicklin M R., Foster G S., Ingram K A., Anderson B D., Frost S D., Bell M., 2002 Consumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances loss of body weight and fat in comparison with consumption of a triacylglycerol control oil American Journal of Clinical 76: 1230 - 1236 69 Mandal M.D., Mandal S., Pal N.K., 2005 Plasmid-mediated dimethoate degradation by Bacillus licheniformis isolated from a freshwater fish Labeo rohita Journal of Biomedicine and Biotechnology 3: 280 - 286 70 Mayer C D., Villarreal L., Caro Y., Ruales J., Villeneuve P., Pina M., 2003 Lipase activity in alcoholysis and esterification reactions of crude latex from babaco fruit (Carica pentagona) John Libbey Eurotext 10(2): 232 - 234 71 McCutchen B.F., Abad A.R., Wong J.F., Yu C.G., 2007 Lipases and method of use United States Patent Application Publication No 0180577 51     72 Moeller B., Vetter R., Wilke D., Poullois B., 1995 Alkaline Bacillus lipases, coding DNA sequences therefor and Bacilli, which produce these lipases United States Patent Application Publication No 5427936 73 Mohapatra K.D., Pati B.R., Mondal K.C., 2009 Effect of amino acid on tannase biosynthesis by Bacillus licheniformis KBR6 Journal of Microbiology, Immunology and Infection 42: 172 - 175 74 Moreau R.A., Liu K.D.F., Huang A.H.C., 1980 Spherosomes of castor bean endosperm membrane components, formation, and degradation Plant Physiology 65 (6): 1176 -1180 75 Mori M., Ali E., Du D., Park E.Y., 2009 Characterization and optimization of extracellular alkaline lipase production by Alcaligenes sp using stearic acid as carbon source Biotechnology and Bioprocess Engineering, 14: 193 201 76 Muto S., Beevers H., 1974 Lipase activities in castor bean endosperm during germination Plant Physiology 54(1): 23 - 28 77 Nadeem M., Qazi J I., Baig S., Syed Q.U.A., 2008 Effect of medium composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis N-2 Food Technology and Biotechnology 46(4): 388 394 78 Nayak J., Nair P.G.V., Mathew S., Ammu K., 2004 A study on the intestinal lipase of Indian major carp Labeo rohita Asian Fisheries Science 17: 333 340 79 Negishi S., Suzuki J., Sakural C., Arimoto S., Uehara H., Hirose T., Yamauchi Y., Arai Y., Suganuma T., 2007 Method for producing a purified lipase United States Patent Application Publication No 0264695 80 Noudeh G.D., Moshafi M.H., Khazaeli P., Akef F., 2007 Studies on bioemulsifier production by Bacillus licheniformis PTCC 1595 American Journal of Pharmacology and Toxicology 2(4): 164 - 169 81 Olusesan A.T., Azura L.K., Abubakar F., Hamid N.S.A., Radu S., Saari N., 2009 Phenotypic and molecular identification of a novel thermophilic Anoxybacillus species: a lipase-producing bacterium isolated from a Malaysian hotspring World Journal of Microbiology and Biotechnology 25(11): 1981 - 1988 52     82 Ory R., Angelo A.J.S.T., Altschul A.M., 1960 Castor bean lipase: action on its endogenous substrate Journal of Lipid Research 1(3): 208 - 213 83 Öztürk B., 2001 Immobilization of lipase from Candida rugosa on hydrophobic and hydrophilic supports Master thesis, Biotechnology and Bioengineering, Turkey 84 Peng R., Lin J., Wei D., 2009 Purification and characterization of an organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas aeruginosa CS-2 Applied Biochemistry and Biotechnology DOI 10.1007/s12010-009-8841-3 85 Pepe O., Blaiotta G., Moschetti G., Greco T., Villani F., 2003 Ropeproducing strains of Bacillus spp from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria Applied Environmental and Microbiology 69(4): 2321 - 2329 86 Pogaku P., Suresh A., P Srinivas P., Reddy S.R., 2010 Optimization of lipase production by Staphylococcus sp Lp12 African Journal of Biotechnology 9(6): 882 - 886 87 Quyen D.T., Nguyen T.T., Le T.T.G., Kim H.K., Oh T.K., Lee J.K., 2004 A novel lipase/chaperone pair from Ralstonia sp M1: Analysis of the folding interaction and evidence for gene loss in Ralstonia solanacearum Molecular Genetics and Genomics 272: 538 - 554 88 Quyen D.T., Le T.T.G., Nguyen T.T., Oh T.K.,và Lee J.K., 2005 High-level heterologous expression and properties of a novel lipase from Ralstonia sp M1 Protein Expression and Purification 39: 97 - 106 89 Quyen D.T., Le T.T.G., Nguyen T.T., Oh T.K., Lee J.K., 2007 Production and properties of an extracellular alkaline, thermostable, highly organicsolvent-resistant and detergent-inducible lipase from Ralstonia sp M1 ASEAN Journal of Science & Technology for Development 24: 237 - 251 90 Quyen D.T., Nguyen S.L.T., Dao T.T., 2007 A novel esterase from Ralstonia sp M1: Gene cloning, sequencing, high-level expression and characterization Protein Expression and Purification 51: 133 - 140 91 Rabbani M., Mirmohammadsadeghi H., Ani M., Chegini K.G., Etemadifar Z., Moazen F., 2009 Functional expression of an alkaline lipase in Escherichia coli Annals of Microbiology 59(4): 763 - 769 92 Rahman R.N.Z.R.A., Baharum S.N., Salleh A.B., Basri M., 2006 S5 Lipase: an organic solvent tolerant enzyme The Journal of Microbiology 44(6): 583 590 53     93 Rey M.W., Elizabeth J.G., Tina S., 2003 Method for using lipase in banking United States Patent Application Publication No 0180418 94 Rey M.W., Ramaiya P., Nelson B.A., Brody-K.S.D., Zaretsky E.J., Tang M., Lopez de Leon A., Xiang H., Gusti V., Clausen I.G., Olsen P.B., Rasmussen M.D., Andersen J.T., Jorgensen P.L., Larsen T.S., Sorokin A., Bolotin A., Lapidus A., Galleron N., Ehrlich S.D., Berka R.M., 2004 Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species Genome Biology 5(10): 12 95 Rifaat H.M., Mahalawy E.A.A., Menofy E.H.A., Donia S.A., 2010 Production, optimization and partial purification of lipase from Fusarium oxysporum Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation V (N): 70 - 84 96 Rismani E., Fooladi J., Ebrahimi Por G H., 2006 Biosurfactant production in batch culture by a Bacillus licheniformis isolated from the Persian Gulf Pakistan Journal of Biological Sciences (13): 2498 - 2502 97 Salameh Moh’d.A., Wiegel J., 2007 Purification and characterization of two highly thermophilic alkaline lipases from Thermosyntropha lipolytica Applied Environmental and Microbiology 73(23): 7725 - 7731 98 Salameh Moh’d.A., Wiegel J., 2009 Synthesis of fatty acid esters and diacylglycerols at elevated temperatures by alkalithermophilic lipases from Thermosyntropha lipolytica Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 36(10): 1281 - 1287 99 Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., 2008 Optimization of protease and lipase production by Bacillus pumilus SG isolated from an industrial effluent The Internet Journal of Microbiology 5(2) 100 Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., 2010 Concomitant production of protease and lipase by Bacillus licheniformis VSG1: production, purification and characterization Brazilian Journal of Microbiology 41(1) 101 Schallmey M., Sing, A., Ward O.P., 2004 Developments in the use of Bacillus species for industrial production Canadian Journal of Microbiology 50(1): - 17 102 Shah K R., Patel P M., Bhatt S A., 2007 Lipase production by Bacillus sp under different physio-chemical conditions Journal of Cell & Tissue Research 7(1): 913 - 916 54     103 Shariati P., Mitchell W.J., Boyd A., Priest F.G., 1995 Anaerobic metabolism in Bacillus licheniformis NClB 6346 Microbiology 141: 1117 - 1124 104 Shehri A., Abdulrahman M Yasser M.S., 2004 Production and some properties of protease produced by Bacillus licheniformis isolated from Tihamet Aseer, Saudi Arabia Pakistan Journal of Biological Sciences 7(9): 1631 - 1635 105 Siripornadulsil S., Labteephanao W., 2008 The efficiency of effective microorganisms (EM) on oil and grease treatment of food debris wastewater KKU Science Journal 36: 27 - 35 106 Snoke J E., Cornell N., 1965 Protoplast Lysis and Inhibition of Growth of Bacillus licheniformis by Bacitracin Journal of Bacteriology 89(2): 415 420 107 Souza de R L., Barbosa J M P., Lobão M W N., Soares C M F., Lima Á S., 2010 Partitioning of porcine pancreatic lipase in a two-phase systems of polyethylene glycol/potassium phosphate aqueous Applied Biochemistry and Biotechnology DOI 10.1007/s12010-010-8907-2 108 Stephens M.A., Ortlepp S.A., Ollington J.F., Mcconnell D.J., 1984 Nucleotide Sequence of the 5' Region of the Bacillus licheniformis αAmylase Gene: Comparison with the B amyloliquefaciens Gene Journal of Bacteriology, 158(1): 369 - 372 109 Tan T., Zhang M., Xu J., Zhang J., 2004 Optimization of culture conditions and properties of lipase from Penicillium camembertii Thom PG-3 Process Biochemistry 39: 1495 - 1502 110 Tian J., Wang Q., Zhang Z., 2009 Lipase-catalyzed acylation of L-carnitine with conjugated linoleic acid in [Bmim] PF6 ionic liquid European Food Research and Technology 229 (2): 357 - 363 111 Tietz N.W., Shuey D.F., 1993 Lipase in serum-the elusive enzyme: An overview Clinical chemistry 39(5): 746 - 756 112 Treichel H., Oliveira D.D., Mazutti M.A., Luccio M.D., Oliveira J.V., 2010 A review on microbial lipases production Food Bioprocess Technology 3(2): 182 - 196 113 Uhma K.N., Lee S.J., Kim H.K., Kang H.Y., Lee Y., 2007 Enantioselective resolution of methyl 2-chloromandelate by Candida antarctica lipase a in a 55     solvent-free transesterification reaction Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 45: 34 - 38 114 US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, 2001 Biopesticide registration action document Bacillus licheniformis strain SB3086 (PC code 006492) US Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs, 36 trang 115 Vakhlu J., Kour A., 2006 Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning Electronic Journal of Biotechnology 9(1): 69 85 116 Valério A., Fiametti K.G., Rovani S., Treichel H., Oliveira de D., Oliveira J.V., 2009 Low-pressure lipase-catalyzed production of mono and diglycerides with and without N-Butane and AOT surfactant Applied Biochemistry and Biotechnology 160(6): 1789 - 1796 117 van Pouderoyen G., Eggert T., Jaeger K.E., Dijkstra B.W., 2001 The crystal structure of Bacillus subtilis lipase: a minimal α/β hydrolase fold enzyme Journal of Molecular Biology 2001, 309:215-226 118 Veith B., Herzberg C., Steckel S., Feesche J., Maurer K.H., Ehrenreich P., Bäumer S., Henne A., Liesegang H., Merkl R., Ehrenreich A., Gottschalk G., 2004 The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 7(4): 204 - 211 119 Venil C., Kamatshi N.S., Lakshmanaperumalsamy P., 2009 Statistical optimization of medium components for the production of lipase by Serratia marcescens SB08 The Internet Journal of Microbiology (1) 120 Volpato G., Rodrigues R.C., Heck J.X., Ayub M.A.Z., 2009 Effects of oxygen volumetric mass transfer coefficient and pH on lipase production by Staphylococcus warneri EX17 Biotechnology and Bioprocess Engineering 14(1): 105 - 111 121 Vulfson E.N., 1994 Industrial applications of lipases In Lipases—their structure, biochemistry and applications (Eds P Woolley, S.B.Peterson) Cambridge: Cambridge Univ Press, trang 271 - 288 122 Watanabe Y., Pinsirodom P., Nagao T., Kobayashi T., Nishida Y., Takagi Y., Shimada Y., 2005 Production of fame from acid oil model using immobilized Candida antarctica lipase Journal of the American Oil Chemists’ Society 82(11): 825 - 831 56     123 Xia X., Wang C., Yang B., Wang Y.H., Wang X., 2009 Water activity dependence of lipases in non-aqueous biocatalysis Applied Biochemistry and Biotechnology 159: 759 - 767 124 Xu Y., Liu H., Du W., Sun Y., Ou X., Liu D., 2009 Integrated production for biodiesel and 1,3-propanediol with lipase-catalyzed transesterification and fermentation Biotechnology Letters 31(9): 1335 - 1341 125 Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredriokson H.L., 1995 Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis BAS50 Applied Environmental and Microbiology 61(5): 1706 -1713 126 Yamauchi A., Nagao T., Watanabe Y., Sumida M., Kobayashi T., Shimada Y., 2005 Purification of arachidonic acid from Mortierella single-cell oil by selective esterification with Burkholderia cepacia lipase Journal of the American Oil Chemists’ Society 82(11): 833 - 837 127 Ye R., Pyo S.H., Hayes D.G., 2009 Lipase-catalyzed synthesis of saccharide–fatty acid esters using suspensions of saccharide crystals in solvent-free media Journal of the American Oil Chemists’ Society 87(3): 281 - 293 128 Yesiloglu Y., Demirkan B., 2009 Biocatalytic properties of lipase from walnut seed (Juglans regia L.) Journal of the American Oil Chemists’ Society DOI 10.1007/s11746-010-1540-y 129 Ying M., Chen C., 2007 Study on the Production of Biodiesel by Magnetic Cell Biocatalyst Based on Lipase-Producing Bacillus subtilis Applied Biochemistry and Biotechnology, 137-140(1-12): 793 - 803 130 Zhao L.L., Chen X.X., Xu J H., 2009 Strain improvement of Serratia marcescens ECU1010 and medium cost reduction for economic production of lipase World Journal of Microbiology and Biotechnology DOI 10.1007/s11274-009-0203-3 Tài liệu từ internet: 131 Augusto Q., “Enzymes in the pulp and paper industry: a review”, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tháng năm 2010 132 Thu Quynh Mai, “A microbial biorealm page on the genus Bacillus licheniformis”, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tháng năm 2010 57     PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng B licheniformis Thời gian (h) Lần 3 3 3 3 10 15 20 25 30 35 40 OD (620nm) 0,060 0,064 0,074 0,130 0,147 0,160 0,181 0,162 0,167 0,193 0,195 0,178 0,207 0,186 0,191 0,217 0,221 0,225 0,186 0,209 0,227 0,167 0,162 0,165 0,126 0,146 0,139 Trung bình 0,066 0,146 0,17 0,189 0,216 0,221 0,207 0,164 0,137 Phụ lục 2: Lượng NaOH sử dụng thí nghiệm sàng lọc Thí nghiệm Lượng NaOH (ml) Đối chứng Mẫu thí nghiệm 4,9 8,14 9,87 16,56 9,22 38,19 13,13 58     16,73 13,23 25,37 10 10,44 11 18,34 12 7,95 Phụ lục 3: Lượng NaOH sử dụng thí nghiệm Thí nghiệm Lượng NaOH (ml) Đối chứng Mẫu thí nghiệm 29,81 43,01 42,80 45,05 37,52 50,57 41,79 50,67 35,00 10 11 4,9 33,10 12 44,12 13 42,41 14 49,95 15 44,00 16 41,07 17 41,36 18 42,70 19 42,46 20 41,76 59     46,85 Phụ lục 4: Kết xử lý thống kê thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng B licheniformis Phụ lục 5: Cơ sở lý thuyết thí nghiệm Plackett – Burman Thiết kế thí nghiệm tối ưu đa yếu tố theo Plackett – Burman phát minh vào năm 1946 đăng tạp chí Biometrica (Plackett Burman, 1946) Thiết kế đưa để nghiên cứu k yếu tố N = (k+1) thí nghiệm chúng tương đương với thiết kế 2k-p N bình phương với 2k- p= k+1 Nhiều phần mềm xây dựng cho thiết kế Design expert xây dựng cho thiết kế 11, 19, 23, 27 31 yếu tố với số thí nghiệm lớn yếu tố đơn vị MINITAB xây dựng thiết kế Plackett-Burman cho 12, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 48 thí nghiệm, số yếu tố tương ứng nhỏ đơn vị Thiết kế thí nghiệm theo Plackett-Burman kinh tế thiết kế 2k-p Đó thiết kế 2k-p, có 8, 16, 32, 48 thí nghiệm, ngược lại thiết kế Plackett-Burman cho thêm thí nghiệm tương ứng với ba thiết kế khoảng 16-32 khoảng từ 8-16 Nghĩa thiết kế Plackett-Burman có 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 thí nghiệm Trong thiết kế Plackett-Burman, tác giả đưa ký hiệu mã hoá cột đầu tiên, cột xây dựng cách chuyển cột bên trái sang cột bên phải với thí 60     nghiệm cuối luôn mức thấp (-1) Tính linh động thiết kế thể yếu tố khơng đủ thiết kế sử dụng biến giả để thiết kế tương ứng với số yếu tố bên gần Việc thiết kế thí nghiệm tính tốn kết thực phần mềm chuyên dụng như: SAS, MINITAB, JMP, D.o.E Fusion Pro, Statistics Toolbox™- Mathlab Design-Expert Trong đó, phần mềm design expert 7.0.0 thiết kế sẵn cho 11, 19, 23, 27, 31 yếu tố (vì 8, 16 yếu tố có sẵn thiết kế 2k-p- Level Facterial có sẵn phần mềm) Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman sử dụng rộng rãi công nghiệp, đặc biệt cơng nghệ hố học, cơng nghệ sinh học, nơng nghiệp Phụ lục 6: Cơ sở lý thuyết thí nghiệm Phương pháp bề mặt đáp ứng tập hợp công cụ để lắp ráp mặt cong tập hợp số liệu việc xác định giá trị tối ưu yếu tố phần phương pháp Dĩ nhiên, hình dạng bề mặt xác định mơ hình phù hợp đáp ứng với giá trị (số liệu) gọi bề mặt đáp ứng Nhưng chắn có khác biệt bề mặt lắp ráp bề mặt thực tế Bề mặt lắp ráp ước lượng bề mặt thực thí nghiệm lặp lại, bề mặt lắp ráp chắn khác so với bề mặt láp ráp ban đầu Tuy nhiên, để đánh giá khác biệt này, thông số R2 đưa R2 hệ số tương quan số liệu thực nghiệm (mặt cong thực nghiệm) số liệu tiên đoán (mặt cong lắp ráp) Giá trị R2 chấp nhận thường lớn 0,7 Thành phần RSM thiết kế bề mặt đáp ứng Các thiết kế sử dụng lâu thiết kế cấu trúc có tâm Các đề tài ứng dụng RSM sử dụng trước cơng nghiệp hố chất thực phẩm mối quan tâm đến RSM mở rộng sang lĩnh vực sinh học, y sinh sinh dược Thiết kế bề mặt đáp ứng thường sử dụng thiết kế cấu trúc có tâm (CCD) Có nhiều dạng CCD Người phát minh thiết kế Box - Wilson Khi thông số tới hạn q trình tìm thấy, chúng tối ưu cách dùng thiết kế cấu trúc có tâm Thiết kế cấu trúc có tâm dạng thiết kế phổ biến cho việc lắp ghép mơ hình bậc 61     Cấu tạo thiết kế gồm ba phần: điểm thí nghiệm 2k-p thiết kế với k số yếu tố p thường không cần thiết 0; điểm nằm trục quay điểm tâm Tất phần thay đổi CCD thường sử dụng với điểm thí nghiệm thiết kế 2k Ngồi ra, để giảm số thí nghiệm, phần mềm đưa CCD cải biến MINITAB xây dựng CCD đầy đủ (dùng thiết kế 2k) cho k từ đến 7, CCD bán phần cho k từ đến CCD ¼ cho k Đặc biệt, k = CCD bán phần có 32 điểm với 16 điểm biên, 10 điểm điểm tâm Hình 6.1: Mơ hình hố thiết kế có tâm tổng qt cho hai yếu tố ba dạng CCD Ngược lại với điểm thí nghiệm, điểm ln ln gấp đơi 2k số yếu tố thí nghiệm Giá trị điểm lựa chọn theo bảng giá trị điểm (bảng 6.1) tài liệu CCD thiết kế mặc định theo phần mềm chuyên dụng (Design expert; MINITAB) Các điểm ký hiệu ±α với –α+1 Khơng có mực thước để chọn lựa điểm tâm nghiên cứu bề mặt đáp ứng tốt có lặp lại thí nghiệm tâm Bảng 6.1: Giá trị Các điểm α thiết kế CCD Số yếu tố 5 Số thí nghiệm 22 23 24 25-1 25 26-1   62     Giá trị α = 1,414 23/4 = 1,682 24/4 = 2,000 24/4 = 2,000 25/4 = 2,378 25/4 = 2,378 2/4 ... hợp lipase từ Bacillus licheniformis sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp đáp ứng bề mặt – phương án cấu trúc có tâm thực phòng thí nghiệm hóa sinh thuộc viện cơng nghệ sinh học thực... Bùi Hồng Quân, tiến hành thực đề tài: “TỐI ƯU HÓA SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ Bacillus licheniformis SỬ DỤNG MA TRẬN PLACKETT-BURMAN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT” 1.2 Mục đích đề tài Đề tài nhằm thực... khả sinh tổng hợp lipase Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym Những đặc điểm tính chất, sinh lý, sinh hóa vi sinh vật có ý nghĩa định Không phải tất vi sinh vật có khả sinh tổng hợp