Tính toán tần suất haplotype hệ 17 y STR phục vụ công tác giám định tại viện khoa học hình sự

Bảng 1.1: Các chỉ thị di truyền Y-STR chọn lọcBảng 1.2: Tóm tắt các kit Y-STR thương mại Bảng 1.3: các cơ sở dữ liệu gen Y-STR trên thế giới Bảng 1.4: Các ứng dụng và thuận lợi khi phân

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

VŨ LÊ LỢI

TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y-STR

PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH TẠI

VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

VŨ LÊ LỢI

TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y-STR

PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH TẠI

VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Hà

Hà Nội, tháng 11-2013

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Thượng tá Nguyễn Văn Hà, Phó giám đốc Trung tâm giám định

Sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.

là người đã quan tâm hướng dẫn tận tình và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm luận án.

Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo, tập thể cán bộ Trung tâm giám định sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã

giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 11 năm 2013

Vũ Lê Lợi

MỞ ĐẦU

1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về người Việt (Kinh) 3

1.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể Y 4

1.3 Các chỉ thị di truyền trong phân tích nhiễm sắc thể Y 5

1.4 Các kít thương mại phân tích nhiễm sắc thể Y 8

1.5 Dữ liệu YSTR Haplotype 9

1.6 Ý nghĩa thống kê của phân tích nhiễm sắc thể Y trong hình sự 11

1.7 Ứng dụng của phân tích ADN trên nhiễm sắc thể Y 12

1.8 vấn đề sử dụng Y-STR trong phân tích AND phục vụ giám định pháp lý 14

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Thiết bị máy móc và dụng cụ 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phân tích AND 17

2.2.2 Phân tích dữ liệu AND 22

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp vô cơ sử dụng chelex 100 24

3.2 Kết quả PCR25 3.3 Phân tích alen và tính toán tần suất Y-STR haplotype 25

giữa quần thể nghiên cứu và các quần thể có sẵn trong cơ sở dữ liệu 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu v n/

KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ

LỤC

- STR Short Tandem Repeat

- Y‐STR Y‐ chromosome Short Tandem Repeat

- DNA Deoxyribonucleic Acid

- PCR Polymerase Chain Reacton

- AMPS Ammonium Persulfate

- dNTPs Deoxy Nucleotde Tri Phosphates

- EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetc Di‐Sodium Salt

- FDL Forensic DNA Laboratory

- DC Discriminaton Capacity

- HD Haplotype Diversity

- GD Gene Diversity

- bp base pairs

- PCR Polymerase Chain Reacton

- YHRD Y‐Chromosome Haplotype Reference Database

- SWGDAM Scientific Working Group on DNA Analysis Methods

- NRY Non‐recombining Y‐chromosome

- SNP Single Nucleotde Polymorphism

- mtDNA Mitochondrial DNA

- PAR Pseudo‐Autosomal Region

Bảng 1.1: Các chỉ thị di truyền Y-STR chọn lọc

Bảng 1.2: Tóm tắt các kit Y-STR thương mại

Bảng 1.3: các cơ sở dữ liệu gen Y-STR trên thế giới

Bảng 1.4: Các ứng dụng và thuận lợi khi phân tích Y-STR trong hình sự Bảng 2.1: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao

Bảng 3.4: Bảng giá trị của Фst và P giữa quần thể Việt đã nghiên cứu

và dữ liệu có sẵn trên YHRD

Bảng 3.5: Bảng giá trị Фst và P giữa quần thể người Việt (Kinh) đãnghiên cứu và quân thể các nước lân

cận

Hình 1.1: Sơ đồ 2 nhiễm sắc thể giới tính X và Y:

Hình 1.2: Trường hợp 2 alen ở locus DYS385a/b

Hình 1.3: Hình ảnh khuếch đại ở locus DYS389I/II

Hình 1.4: Kết quả điện di của kit Y-PLEXTM6

Hình 1.5: Hình ảnh pic khi phân tích Y-STR và STR trên NST thường

trong mẫu lẫn thành phần nam/nữ

Hình 1.6: Hình ảnh cây phả hệ

Hình 3.1: Hình ảnh pic 17 locus Y-STR sau điện di huỳnh quang Hình 3.2: Đồ thị mô tả chỉ số đa dạng locus gen hệ 17 Y-STR

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng thí nghiệm ADN đãđược triển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám địnhviên được đào tạo chuyên sâu [9] Lĩnh vực giám định gen được triển khai với

3 mảng lớn là: Giám định ADN trên nhiễm sắc thể thường; giám định gentrên nhiễm sắc thể giới tính và giám định ADN t thể Phân tích ADN trênnhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là trên nhiễm sắc thể Y đã đóng góp đượcnhững thành tích nhất định như: bổ sung vào bảng locus gen cùng với cáclocus gen trong phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường, phân tích quan hệhuyết thống cha con, phân tích phả hệ theo dòng bố và đặc biệt hữu íchtrong các vụ án dấu vết ít, khó phát hiện như các vụ án hiếp dâm (lẫn thànhphần thấp tế bào nam trong thành phần cao tế bào nữ hoặc nhiều đốitượng tham gia vụ án), các vụ án dấu vết bị nhiễm, bị lẫn

Giám định ADN trên nhiễm sắc thể Y là phân tích và so sánh các chỉthị di truyền là các đoạn lặp ngắn STR (Short Tandem Repeat) trên nhiễm sắcthể Y giữa mẫu cần giám định và mẫu so sánh Những người có giới tính namtrong cùng một phả hệ theo dòng bố sẽ có cùng một kiểu gen đơn bội trênnhiễm sắc thể Y (gọi là Haplotype), kiểu gen này rất ổn định ngoại trừ độtbiến Do vậy phân tích hệ Y-STR trong giám định gen không có tính truynguyên cá thể như trên nhiễm sắc thể thường, mà chỉ có tính chất loạitrừ trong một số trường hợp Tuy nhiên phân tích này lại rất hữu ích trongcác trường hợp với dấu vết ít, khó phát hiện mà phân tích trên nhiễm sắc thểthường không có tác dụng và một điều quan trọng là trong phần lớn các vụ

án bạo lực, hiếp dâm thì đối tượng luôn là nam giới Nên triển khai giám địnhADN trên nhiễm sắc thể Y là một công việc rất ý nghĩa Sự phát triển của

sắc bén trong nghiên cứu ADN nói chung và khoa học hình sự nói riêng Tuyvậy, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu chi tiết về lĩnh vực này.Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự mới có các công trình về tần suất của cácchỉ thị di truyền STR trên nhiễm sắc thể thường (người Kinh, Mường ), còn

về tần suất Haplotype chưa có thống kê nào cụ thể

Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài sẽ phân tích các alen thuộc hệ Y-STRtrên nhiễm sắc thể Y của 80 người đàn ông Việt (Kinh) khỏe mạnh, khôngquen biết nhau trước ở các vùng miền của Việt Nam Sau đó liệt kê đượcbảng đa hình các alen cho từng locus và xác định số Haplotype hệ Y-STR cóthể quan sát được bằng phương pháp đếm Từ đó tính toán tần suấtHaplotype và tính tính chỉ số Haplotype và chỉ số các locus gen

Đề tài nghiên cứu “ Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR phục vụcông tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự” được tiến hành là hếtsức cần thiết và có ý nghĩa cả về khoa học và thực tiễn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chủng tộc người Việt (Kinh)

Người Việt hay người Kinh là một d ân tộ c hình thành tại khu vực địa lý

mà ngày nay là mi ề n B ắ c Vi ệ t Nam và miền namTru n g Q uố c Đây là dân tộc

tộc Kinh để phân biệt với những dân tộc thiểu số tại V i ệ t N a m Ngôn ngữchính sử dụng là t ế ng V i ệ t theo nhóm Việt-Mường Người Kinh sinh sốngtrên khắp toàn thể nước Việt Nam và một số nước khác nhưng đông nhất

bào

ở ngoài nước thì người Việt định cư ở Hoa K ỳ là đông nhất

Theo Tổ n g đ i ều tra dân số và n h à ở nă m 2009 , người Kinh ở Việt Nam

có dân số 73.594.427 người, chiếm 85,7% dân số cả nước, cư trú tại tất cả

63 tỉ nh , t h à nh ph ố Các tỉnh, thành phố có số lượng người Kinh lớn nhất là:

T h à n h ph ố H ồ C h í M i n h (6.699.124 người), H à N ộ i (6.370.244 người),

Thanh Hóa (2.801.321 người), Ng h ệ An (2.489.952 người), Đồ n g Nai

Người Kinh là dân tộc đa số tại Việt Nam, tuy nhiên tại một sốtỉnh m iền n ú i ph í a B ắ c, người Kinh lại là dân tộc thiểu số: L à o C a i (212.528

Bình (207.569 người, chiếm 26,4% dân số toàn tỉnh, người Mường là dân tộc

số toàn tỉnh, người Thái là dân tộc đa số ở Sơn La), L ạ ng Sơn (124.433

Giang (95.969 người, chiếm 13,2% dân số toàn tỉnh, tỉnh này không có dân

tỉnh này không có dân tộc đa số), Bắc K ạn (39.280 người, chiếm 13,4% dân

số toàn tỉnh, n g ười Tày là dân tộc đa số ở tỉnh này), Cao B ằ ng (29.189 người,chỉ chiếm 5,76% dân số toàn tỉnh, tỉnh này không có dân tộc đa số)

1.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể Y

Nhiễm sắc thể Y có chiều dài 50 Mb, là nhiễm sắc thể nhỏ thứ 3 trong

bộ nhiễm sắc thể người, chỉ lớn hơn NST số 21 (47Mb) và NST số 22(49Mb) Phần lớn nhiễm sắc thể Y là vùng không tái tổ hợp (Non-Recombining NRY) chiếm 95% Hai đầu của NST Y là vùng pseudo- autosomal(PAR), kết cặp và tái tổ hợp với các vùng tương đồng trên NST X trong kỳ đầucủa giảm phân I, chúng được gọi là vùng nhiễm sắc thể thường giả bởi vì bất

kỳ gen nào định vị trong vùng này đều được di truyền hoàn toàn giống nhưcác gen trên nhiễm sắc thể thường PAR 1 ở cánh ngắn của NST Y có kíchthước 2,5 Mb, PAR 2 ở cánh dài có kích thước hơn PAR1 1 Mb Vùng NRYcòn được gọi là male-specific region (MSY) Tổng cộng có 156 đơn vị phiên

mã được biết đến bao gồm 78 gen mã hóa protein có mặt trên

1.3 Các chỉ thị di truyền trong phân tích nhiễm sắc thể Y

Từ năm 1990 đến nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng kỹ thuật phântích gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat –STR hay Microsatellite)

vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụthuộc vào các thao tác kỹ thuật người giám định Các cấu trúc VNTR haySTR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tínhđặc trưng cho cá thể Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen Các gennày thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phépđồng thời thực hiện được các phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau

STR (Short Tandem Repeat) là các trình tự ADN ngắn lặp đi lặp lại,khoảng 2-6 base pair (bp) Trình tự đoạn lặp này có thể được khuếch đạibằng cách sử dụng các mồi chuyên biệt Các phòng thí nghiệm hình sự trênthế giới thường sử dụng các đoạn lặp 4 nucleotde, đảm bảo tính đa hình vàthuận lợi cho phản ứng khuếch đại và phân tích nhiều chỉ thị di truyền cùngmột lúc [21] Phân tích STR rất phù hợp trong các trường hợp dấu vết hình

sự, bởi lẽ các dấu vết sinh học tại hiện trường chịu nhiều tác động của điềukiện ngoại cảnh nên ADN dễ bị đứt gẫy Hơn nữa STR dễ thực hiện phản ứngkhuếch đại và có thể khuếch đại nhiều vị trí cùng lúc

Kể từ cuối những năm 90, khoa học đã giải mã được bộ gen người, nênviệc sử dụng các chỉ thị di truyền Y-STR (Short Tandem Repeat) đã phổ biến ởcác phòng thí nghiệm Khoa học hình sự trên toàn thế giới Trong nhữngnăm 90 chỉ một số ít chỉ thị di truyền Y-STR được sử dụng Vào đầu năm

2002 chỉ có khoảng 30 Y-STR được sử dụng, và từ thời gian đó tới này đã có hơn 200 Y-STR mới được gửi vào cơ sở dữ liệu gen (GDB;

h t t p ://ww w .g d b o r g )

Tuy nhiên, để thuận tiện các nhà khoa học chỉ chọn một số lượng cóhạn các locus để tến hành Năm 1997 người ta đã chọ các locus DYS19,DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, và DYS385a/b

để xây dựng Haplotype tối thiểu (Minimal haplotype) Đã có hơn 4.000người đàn ông từ 48 nhóm quần thể khác nhau đã được nghiên cứu với cáclocus này Đây là cơ sở cho hình thành cơ sở dữ liệu Haplotype trực tuyếnhiện nay (htt p ://w w w.yst r org; h t t p : //www.yh r d o r g ) Vào tháng giêng năm

2003, tập đoàn nghiên cứu về ADN SWGDAM đã bổ sung thêm 2 locus cho

bộ Haplotype tối thiểu là locus DYS438 và DYS439 [10] Hiện này ABI bổ sungthêm 5 locus là DYS437, DYS448, DYS456, DYS458 và DYS635

Hiện nay, phổ biến trên thế giới và Viện Khoa học hình sự cũng đã áp

Đặc biệt, ở một số locus trên nhiễm sắc thể Y có nhiều hơn 1 alen.Thực tế này dẫn tới nhầm lẫn khi đếm số locus trên một haplotype Tại cáclocus này với một cặp mồi duy nhất có thể khuếch đại 2 đoạn ADN, cho nên

có thể xem đây là 2 locus Ví dụ tại locus DYS 385, có 2 đoạn ADN đượckhuếch đại với một cặp mồi, nên khi đọc kết quả điện di sẽ có 2 alen, 2 alennày được đặt là “a” và “b”, trong đó alen a có kích thước nhỏ hơn alen b, vàcũng có trường hợp kích thước alen a bằng alen b, khi đó kết quả điện di sẽcho 1 pic cao duy nhất [10] Trường hợp này sẽ cho 2 locus DYS385a/b chính

vì vậy có bộ kit 17 chỉ thị di truyền như trên Hình 1.2

Ở locus DYS389I/II cũng có hai sản phẩm khuếch đại trong quátrình PCR với một cặp mồi Tuy nhiên trong trường hợp này sản phẩm PCRcủa DYS389I là nhóm phụ của DYS389II vì mồi xuôi gắn vào 2 vùng

flanking của 2 vùng lặp lại [10] Hình 1.3

Hình 1.2: Trường hợp 2 alen ở locus DYS385a/b

Hình 1.3: Hình ảnh khuếch đại ở locus DYS389I/II

1.4 Các bộ kít thương mại phân tích nhiễm sắc thể Y

Các nhà khoa học hình sự chủ yếu dựa vào các bộ kít thương mại để

Technologies (NewOrleans LA), đồng khuếch đại DYS19, DYS389II,DYS390, DYS391, DYS393 và DYS385a/b ReliaGene Technologies bán bộ kít Y-PLEX12, trong đó có bổ sung các locus mà SWGDAM đã nghiên cứu cộng vớichỉ thị di truyền Amelogenin Một lợi thế lớn trong việc sử dụng kit Y-STRthương mại là sẵn có các thang alen chung

Các kit thương mại có được mô tả trong bảng dưới đây Các nhómlocus gen được thiết kế mồi gắn huỳnh quang với các màu khác nhau đểphát hiện sản phẩm điện di B là màu xanh, G là màu xanh lá cây, Y là màuvàng, R là màu đỏ

Hình 1.4: Kết quả điện di của kit Y-PLEX TM 6 Đặc điểm các locus gen được mô tả (bảng1.1) Một lợi thế của các kit

thương mại là phân tích cùng một lúc nhiều locus gen và có một thang alentêu chuẩn Các thang alen chuẩn giúp đánh giá quá trình phân tích ADN đượcchính xác

Hiện nay, Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit của hãngApplied Biosystems, với 17 chỉ thị di truyền Trong đó có 7 chỉ thị di truyền

sử dụng là hệ European Minimal Haplotyep, SWGDAM bổ sung thêm 2 chỉthị là locus DYS438 và DYS439 Hãng ABI bổ sung thêm 5 locus để sản xuất bộkít thương mại AmpFlSTR® Yfiler™ PCR Amplification Bộ kít này phổ biến cácphòng thí nghiệm hình sự thế giới, và được FBI đưa vào têu chuẩn tronggiám định gen hình sự

Bảng 1.2: Tóm tắt các kit Y-STR thương mại

1.5 Dữ liệu YSTR Haplotype

Cơ sở dữ liệu Y-STR lớn nhất và sử dụng rộng rãi nhất được LutzRoewer và Các đồng nghiệp tại Đại học Humbolt (Đức) xây dựng và đã hoạtđộng trực tuyến từ năm 2000 Các thông tn của cơ sở dữ liệu này được lấy

2004 đã có 24.000 mẫu từ 224 quần thể người trên toàn thế giới có thể

tìm

kiếm qua mạng từ trang web trực tuyến h t t p ://w w w.yst r org

ho ặc h t t p ://yhrd.org [10]

Việc xây dựng một cơ sở dữ liệu Y-STR là rất ý nghĩa Mục đích của cơ

sở dữ liệu gen là liệt kê được tất cả các alen, locus và gen phổ biến, từ đó cóthể ước tính được độ tn cậy của một nghiên cứu về alen, locus và gen nàođó

Từ khi cơ sở dữ liệu YHRD ra đời đã giải quyết được 4 mục tiêu chínhsau: (1) Thiết lập ngân hàng thông tinh tiêu chuẩn về trình tự Y-STR (2) Đưa

ra một têu chuẩn cho giám định gen phục vụ pháp lý (3) Đánh giá mức độphân bố của quần thể (4) ước tính được một khoảng tnh cậy cho tần sốhaplotype Y-STR phục vụ trong giám định gen hình sự

Tính đến ngày 30 tháng 12 năm 2010, cơ sở dữ liệu YHRD đã xâydựng được 91601 haplotyep và đã lấy mẫu từ 710 quần thể trên thế giới, vàđưa vào trực tuyến khi truy cập vào trang web h t t p ://w w w.yst r org ho ặc

h t t p ://w w w.yh r d o r g

Bảng 1.3: Các cơ sở dữ liệu gen Y-STR trên thế giới

1.6 Ý nghĩa thống kê của phân tích nhiễm sắc thể Y trong hình sự

Thực tế chỉ ra rằng, nhiễm sắc thể Y được di truyền nguyên vẹn từ chasang con trai (ngoại trừ đột biến) Nên việc phân tích hệ Y-STR không có ýnghĩa trong truy nguyên hình sự Vì một Y-STR haplotype tìm được trongdấu vết hiện trường thì sẽ trùng với tất cả những người đàn ông có quan hệtheo dòng bố của đối tượng, chính vì vậy phân tích này chỉ có ý nghĩa truynguyên nhóm Tuy vậy điều này cũng rất ý nghĩa với cơ quan điều tra khiphân vùng được đối tượng Khi một kiểu gen đơn bội hệ Y-STR phân tíchđược từ dấu vết hiện trường trùng với kiểu gen của đối tượng, thì takhông loại trừ đối tượng cũng như người thân theo dòng bố với đối tượng

đã tham gia hoạt động phạm tội Do vậy, vấn đề đặt ra là phải có một con sốthống kê có ý nghĩa với kết luận không loại trừ này Budowle và các cộng

sự đã sử dụng phương pháp đếm để tính toán thống kê tần suất Y-STRhaplotype Phương pháp này khá đơn giản, và có thể chấp nhận một khoảng

tn cậy để phản ánh sai số trong quá trình chọn mẫu đại diện để nghiên cứu.Đặc biệt có nhiều haplotype hiếm sẽ không quan sát được khi nghiên cứuvài trăm cho đến hàng nghìn cá thể

Các locus Y-STR nằm trên phần không tái tổ hợp của nhiễm sắc thể Y

Do đó tần suất của một haplotype sẽ có ý nghĩa thống kê hơn là tần suất củaalen Tần số haplotype Y-STR với khoảng tn cậy được tính theo công thứcsau:

P=X/NTrong đó: X là số kiểu gen Y-STR quan sát được khi nghiên cứu và N

là số cá thể nghiên cứu

Khoảng tn cậy:

Trong trường hợp một kiểu gen Y-STR không quan sát được trong mẫunghiên cứu thì khoảng tn cậy của nó là

1.7 Ứng dụng của phân tích ADN trên nhiễm sắc thể Y

Phát hiện thành phần nam giới trong dấu vết, đặc biệt là các dấu vết trong các vụ tấn công tình dục

Các nhà khoa học đã khẳng định rằng chỉ có người có giới tính nammới có nhiễm sắc thể Y Vì thế nếu phân tích nhiễm sắc thể Y thì sẽ phát hiệnđược thành phần tế bào nam giới Mà phần lớn các vụ tấn công bạo lực thìđối tượng là nam giới, chính vì vậy phân tích nhiễm sắc thể Y rất hữu ích.Đặc biệt trong các vụ hiếp dâm, khi mà dấu vết thu tại hiện trường hoặcthu từ dịch âm đạo của nạn nhân nữ, thường tế bào nữ sẽ chiếm lượng lớn,trong đó có rất it thành phần tế bao nam giới Khi đó phân tích ADN trênnhiễm sắc thể thường sẽ không phát hiện được thành phần nam giới (hìnhdưới) Với phân tích nhiễm sắc thể Y thì chỉ phát hiện thành phần nam giới,nên kể cả thành phần nam ít hơn rất nhiều thành phần nữ giới thì có thểphát hiện được (hình

1.3)

Trường hợp vắng mặt đối tượng điều tra hoặc là các vụ thảm họa

Trong trường hợp một số vụ án, đối tượng điều tra lẫn trốn nênchưa thu được mẫu so sánh với các dấu vết tìm được Khi ấy, để kịp tiến

độ điều tra, người ta có thể thu mẫu của các người thân có quan hệ theodòng bố với đối tượng để có thể khoanh vùng đối tượng

Hình 1.5: Hình ảnh pic khi phân tch Y-STR và STR trên NST thường

trong mẫu lẫn thành phần nam/nữ

Hoặc trong các vụ việc giám định huyết thống cha con, mà người cha

đã chết thì có thể tến hành thu mẫu của anh, em ruột người cha đó để sosánh với người con trai đó để có thể đưa ra kết luận giám định Nhưtrong hình minh họa (1.4), với một bảng phả hệ như trên thì khi người cha

đã mất thì có thể so sánh người con với chú hoặc các anh em trai họ theo sơ

đồ phả hệ đó Tuy nhiên phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường sẽ chokết luận cuối cùng tốt hơn, vì không phải lúc nào xác minh theo phả hệ cũngluôn đúng

hợp vắng mặt

đối tượng điều

tra (nam giới)

Kiểm tra với người thân có quan hệ theo dòng bố với đốitượng

1.8 vấn đề sử dụng Y-STR trong phân tích ADN phục vụ giám định pháp lý

Hệ Y-STR đã được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm khoahọc hình sự trên thế giới Ban đầu nó được sử dụng phổ biến ở châu Âu hơn

là Mỹ Tại Mỹ, cuối những năm 90 thế kỷ trước, viện nghiên cứu New

vào năm 2000 OCME đã sử dụng phân tích Y-STR cho 4 mục đích sau: (1)Dấu vết thử định hướng dương tính với tnh dịch nhưng không pháthiện ADN lạ ngoài nạn nhân hoặc là ADN đối tượng thấp, dưới ngưỡng pháthiện khi phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường (2) Xem xét tỉ lệ thànhphần ADN nam và nữ trong dấu vết có kết quả thử định hướng dương tínhvới tnh dịch (3) Kiểm tra trên số lượng lớn các dấu vết tnh dịch (4) Xácđịnh số lượng đối tượng để lại dấu vết tnh dịch đó.

Trong một báo cáo của OCME đưa ra năm 2001, khi họ có thể pháthiện tỉ lệ male/female là 1:4000 Năm 2002, Sibille et al đưa ra nghiên cứucho thấy, vẫn có thể phân tích Y-STR từ các dấu vết tnh dịch của vụ án hiếpdâm sau khi đã xảy ra khoảng 48 giờ, với 104 mẫu dịch âm đạo thu từ các vụ

án thì họ đã phân tích được khoảng 29% các mẫu này

Tại Viện Khoa học hình sự, phân tích ADN hệ Y-STR chưa có điềukiện nghiên cứu sâu vì những lý do: (1) Kinh phí cho nghiên cứu là khá lớn,(2) Các vụ việc còn khiêm tốn, khi cơ quan điều tra chủ yếu là khai thác rõ vềtruy nguyên cá thể Hiện nay tại Viện, phân tích Y-STR chủ yếu phục vụgiám định huyết thống theo dòng bố, và bổ sung vào bảng locus gen cùng vớiphân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường để đưa ra kết luận rõ ràng nhất(trong các vụ thiên tai khi phân không phân tích được đầy đủ kiểu gen trênnhiễm sắc thể thường)

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu của 80 người đàn ông Việt (kinh) khỏe mạnh, không có họhàng với nhau từ các vùng miền ở Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

a Hóa chất tách chiết

PBS (Phosphate – buffered saline)

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) (Sigma – Mỹ).

Proteinase K (Sigma – Mỹ)

Ethanol (Trung Quốc)

Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ)

- b Hóa chất dùng cho PCRAmpFℓSTR® Yfiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288)

Taq polymerase 5U/µl

Đầu côn các loại

Găng tay cao su

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân tích ADN

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết

Phương pháp tách chiết ADN từ máu theo phương pháp tách chiết

có

mặt của Chelex trong khi đun ở nhiệt độ 100 C sẽ ngăn cản quá trình biếntính của DNA bởi các tác nhân ion kim loại tạo phức có thể xúc tác cho quátrình đứt gãy ở nhiệt độ cao trong những dung dịch có cường độ ion thấp.Chelex còn liên kết cả với những chất bẩn là chất ngăn cản quá trình diễn raphản ứng PCR Tách chiết DNA sử dụng Chelex là phương pháp vô cơ.

Phương pháp này có ưu điểm là thao tác đơn giản, tốn ít thời gian vàDNA không bị hao hụt nhiều trong quá trình tách chiết Chúng tôi sử dụngphương pháp tách chiết DNA bằng chelex 100 để tách DNA trên các mẫumáu [4]

Quy trình tách chiết bằng chelex 100 như sau:

Cắt khoảng 3x3 mm mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml

Cho 1 ml nước tnh khiết đã khử ion vào ống

Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút để rửa mẫuChuẩn bị dung dịch chelex 5% bằng cách pha 5 g chelex vào 100

ml nước khử ion

Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút

Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu

Trộn bằng vortex trong 5 giây

Trộn bằng vortex trong 5 giây

Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút

Sản phẩm DNA thu được sau quá trình tách chiết được định lượng bằng

bộ kit “Quantblot Human DNA Quantitaton kit” của hãng Perkin Elmer(Mỹ)

Nguyên tắc:

Định lượng DNA bao gồm quá trình lai đầu dò có gắn biotin với DNA cầnđịnh lượng Mẫu DNA cần định lượng được cố định trên màng nilon Đầu dòđặc hiệu đối với đoạn lặp của locus gen D17 Z1 Một enzym liên kết HRP– SA gắn vào đầu kia của biotin Enzym này xúc tác quá trình oxy hóa củaChromogen TMB để tạo thành kết tủa màu xanh trên màng nilon Lượng kếttủa màu xanh sẽ biểu thị tỷ lệ lượng DNA

- Giai đoạn hiện màu, sử dụng Chromogen TMB và H2O2

- Đánh giá kết quả căn cứ vào mức độ kết tủa màu và mẫu DNA chuẩn

để đánh giá Mức độ đậm nhạt khác nhau là tùy thuộc vào lượng DNA nhiềuhay ít

2.2.1.3 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phương pháp PCR

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù

từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung