XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HÔ HẤP

BỘ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI - THÚ Y ************************* KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CÓ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HÔ HẤP Sinh viên thực : PHẠM TRƯỜNG AN Lớp: DH08TY Ngành: Thú y Niên khóa : 2008 - 2013 Tháng 09/2013 BỘ GIÁO DỤC vàĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI - THÚ Y ************************* PHẠM TRƯỜNG AN XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCRPHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUISTRÊN HEO CAI SỮA CĨ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HƠ HẤP Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn ThS ĐỖ TIẾN DUY TS LÊ THANH HIỀN Tháng 09/2013 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực hiện: PHẠM TRƯỜNG AN Tên đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS PARASUIS TRÊN HEO CAI SỮA CĨ DẤU HIỆU RỐI LOẠN HƠ HẤP” Đã hoàn thành theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến đóng góp, nhận xét hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày …………… Giáo viên hướng dẫn Giáo viên hướng dẫn ThS Đỗ Tiến Duy TS Lê Thanh Hiền ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời biết ơn chân thành đến Bố Mẹ sinh thành, không quản nắng mưa vất vả nuôi nấng, dạy dỗ ngày hơm Gia đình ln bên lúc nơi, chỗ dựa tinh thần vững cho sống Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn ni Thú y, tồn thể q thầy tận tâm truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trường tạo điều kiện thuận lợi thời gian thực khóa luận! Em chân thành biết ơn ThS Đỗ Tiến Duy TS Lê Thanh Hiền hết lòng hướng dẫn, động viên em suốt q trình thực khóa luận! BSTY Nguyễn Phạm Huỳnh vàBSTY Lê Thị Hạnh Dung tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp! Xin cảm ơn Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Các anh chị công tác làm đề tài tốt nghiệp Bệnh Viện Thú Y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực tập Tập thể lớp DH08TY quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ vui buồn tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! PHẠM TRƯỜNG AN iii TÓM TẮT Đề tài “Xây dựng quy trình PCR phát Haemophilus parasuis heo cai sữa có dấu hiệu rối loạn hơ hấp” thực từ tháng 02/2013 đến tháng 07/2013 phòng xét nghiệm sinh học phân tử - tế bào thuộc Bệnh Viện Thú y, khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình PCRphát vi khuẩn H parasuis cách nhanh chóng, xác hiệu quả, từ có biện pháp hữu hiệu để phòng chống ngăn ngừa lây lan bệnh Kết đạt sau: • Quy trình PCR có nồng độ primerHPF-cysS; HPR-cysS 0,5 µM • Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: tiền biến tính 95 oC phút; biến tính 94 oC 30 giây; bắt cặp 56 oC phút; kéo dài 72 oC phút; giai đoạn kéo dài cuối 72 oC phút • Quy trình PCR sau tối ưu ứng dụng mẫu thực địa iv MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Phiếu xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Danh sách sơ đồ xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh vi khuẩn H parasuis gây 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Lịch sử nghiên cứu 2.1.3 Đặc điểm H parasuis 2.1.4 Dịch tễ học 2.1.5 Cơ chế sinh bệnh 2.1.6 Triệu chứng 2.1.7 Bệnh tích 2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR v 2.2.2 Các giai đoạn phản ứng PCR 2.2.3 Các yếu tố quan trọng phản ứng PCR 11 2.2.3.1 Primer 11 2.2.3.2 DNA mẫu 11 2.2.3.3 Nồng độ MgCl2 11 2.2.3.4 dNTP 12 2.2.3.5 Taq-polymerase 12 2.2.3.6 Số chu kỳ phản ứng PCR 13 2.2.4 Đọc kết phản ứng PCR 13 2.2.5 Ứng dụng kỹ thuật PCR 14 2.2.6 Ưu nhược điểm kỹ thuật PCR 14 2.3 Phản ứng multi PCR 15 2.4 Quy trình ly trích DNA 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 17 3.2 Nội dung thực 17 3.3 Vật liệu hóa chất 17 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3.2 Hóa chất 17 3.3.3 Thiết bị 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Kiểm tra độ đặc hiệu khả hình thành cấu trúc thứ cấp primer 19 3.4.2 Xác định nồng độ primer tối ưu cho phản ứng PCR 20 3.4.3 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR 20 3.4.4 Xác định nồng độ Master mix tối ưu cho phản ứng PCR 22 3.4.5 Ứng dụng quy trình PCR mẫu thực địa 23 3.4.6 Đánh giá mức độ thống kết s-PCR m-PCR 23 3.4.6.1 Quy trình m-PCR phát H pasasuis 24 3.4.6.2 Hệ số Kappa 25 vi Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer 26 4.2 Kết xác định nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp tối ưu 30 4.3 Kết xác định nồng độ Master mix tối ưu 33 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR 34 4.5 Ứng dụng quy trình PCR mẫu thực địa 36 4.5.1 Kết ứng dụng quy trình PCR mẫu thực địa 36 4.5.2 Đánh giá mức độ thống kết s-PCR m-PCR 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 vii DANH SÁCHCÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetate DNA Deoxyribonucleoic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate H parasuis Haemophilus parasuis K Kappa m-PCR Multiplex Polymerase Chain Reaction MWM Molecular Weight Marker NAD Nicotinamide Adenin Dinucleotide NCBI the National Center for Biotechnology Information NT Nghiệm thức OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome SDS Sodium Dodecyl Sulfat s-PCR Single Polymerase Chain Reaction TBE Tris Borate EDTA Ta Annealing Temperate TE Tris EDTA Tm Melting Temperate viii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Cặp pimer sử dụng phản ứng PCR phát H parasuis 19 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR xác định nồng độ primer 20 Bảng 3.3 Thí nghiệm nhiệt độ bắt cặp trình luân nhiệt 21 Bảng 3.4 Các nghiệm thức xác định nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp 22 Bảng 3.5 Thành phần Go taq® green Master mix 23 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng m-PCR phát H parasuis 24 Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng m-PCR phát H parasuis 24 Bảng 4.1 Các đặc tínhcơ cặp primer 26 Bảng 4.2 Kết cấu trúc thứ cấp mang lượng thấp 27 Bảng 4.3 Kết phân tích BLAST cặp primer 29 Bảng 4.4 Kết xác định nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp 30 Bảng 4.5 Kết phản ứng s-PCR m-PCR phát H parasuis 37 Bảng 4.6 So sánh phù hợp kết s-PCR m-PCR 38 ix 4.2 Kết xác định nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp tối ưu Kết khảo sát bốn nồng độ primer 0,25µM, 0,5µM, 0,75µM 1µM bốn nhiệt độ bắt cặp khác 52oC, 54oC, 56oC 58oC trình bày qua hình Bảng 4.4 Bảng 4.4Kết xác định nồng độ primer nhiệt độ bắt cặp Nhiệt độ T1=52oC T2=54oC T3=56oC T4=58oC PA = 0,25μM + + +++ +++ PB = 0.05μM + ++ ++++ ++++ PC = 0,75μM + ++ ++++ +++ PD = 1.0μM + ++ ++++ ++++ Nồng độ primer +: band sản phẩmmờ, có band phụ ++: band sản phẩm dày, có band phụ +++: band sản phẩm rõ, khơng có band phụ ++++: band sản phẩm sáng, rõ, dày, khơng có band phụ Bảng 4.4với 16 NT (Nghiệm thức)cho thấy tác động qua lại nhiệt độ bắt cặp nồng độ primer khác Sản phẩm PCR 16 NT gel điện di cho kết đặc hiệu, sản phẩm PCR có band kích thước 821bp (so với thang chuẩn100bp) H parasuis Ở nhiệt độ bắt cặp 52 oC với bốn nồng độ primer 0,25µM, 0,5µM, 0,75µM 1µM - NT A1, B1, C1 D1 cho sản phẩm PCR có band mờ, đồng thời có band phụ (mức độ 1+) Ở nhiệt độ 54oC, bốn sản phẩm PCR bốn NT có band sản phẩm phụ, NT A2 (nồng độ primer 0,25µM) cho band sản phẩm mờ (mức độ 1+),các NT B2, C2, D2 (ba nồng độ primer lại) có band sản phẩm dày, rõ (mức độ 2+) 30 Với nhiệt độ bắt cặp 56oC, nồng độ primer khác - NT A3, B3, C3, D3 cho sản phẩm PCR sáng rõ, band dày khơng có band sản phẩm phụ (mức độ 4+).Do nồng độ primer 0,25µM thấp nên band sản phẩm mờ nồng độ khác (mức độ 3+) Ở nhiệt độ bắt cặp 58oC, NT A4, C4 – với nồng độ primer0,25µM 0,75 µM – cho sản phẩm PCR có band sáng, không xuất band sản phẩm phụ (mức độ 3+) Với NT B4, D4 - nồng độ primer 0,5 µM 1µM, ta sản phẩm PCR có band sáng rõ, dày (mức độ 4+) Từ kết trên, cho thấy NT B3 - nhiệt độ bắt 56oC nồng độ primer tối ưu 0,5µM, tốt cho quy trình PCR phát H parasuis (nồng độ primer thấp, tiết kiệm hóa chất đảm bảo band sản phẩm sáng rõ, kích thước chuẩn vi khuẩn H parasuis, đồng thời khơng có band sản phẩm phụ) Quy trình tối ưu dùng cho việc thử nghiệm L (-) A1 B1 C1 D1 821 bp 500bp Hình 4.1 Kết khảo sát nồng độ primer 52 oC A1: nồng độ primer 0,25 μM B1: nồng độ primer 0,5 μM C1: nồng độ primer0,75 μMD1: nồng độ primer 1.0 μM L:ladder (-) đối chứng âm 31 L (-) A2 B2 C2 D2 821 bp 500 bp Hình 4.2 Kết khảo sát nồng độ primer 54 oC A2: nồng độ primer 1.0μM B2: nồng độ primer 0,75 μM C2: nồng độ primer0,5 μMD2: nồng độ primer 0,25 μM L:ladder (-) đối chứng âm L (-) A3 B3 C3 D3 821 bp 500bp Hình 4.3 Kết khảo sát nồng độ primer 56 oC A3: nồng độ primer 0,25 μM B3: nồng độ primer 0,5 μM C3: nồng độ primer0,75 μM D3: nồng độ primer 1.0 μM Lladder (-) đối chứng âm 32 L (-) A4 B4 C4 D4 821 bp 500 bp Hình 4.4 Kết khảo sát nồng độ primer 58 oC A4: nồng độ primer 1.0μM B4: nồng độ primer 0,75 μM C4: nồng độ primer0,5 μM D4: nồng độ primer 0,25 μM L:ladder (-) đối chứng âm 4.3 Kết xác định nồng Master mix tối ưu Dựa vào kết thí nghiệm 4.2, chọn NT B3 vớinồng độ primer 0,5μM nhiệt độ bắt cặp 56oC thực phản ứng PCR mẫu đối chứng dương với nồng độMaster mix 6μl, 8μl, 10μl Theo kết gel điện di Hình 4.5, ba nồng độ Master mix khảo sát cho kết đặc hiệu, thu band sản phẩm mong muốn 821bp sáng rõ nét Nồng độMaster mix 6µl cho band mờ hơn, nồng độ 8µl 10µl cho band sản phẩm dày, sáng rõ gần ngang nên nồng độ Master mix 8µl nồng độ tối ưu sử dụng (do tiết kiệm hóa chất đạt yêu cầu sản phẩm PCR có band sáng rõ, dày, không xuất band sản phẩm phụ) 33 L (-) 821bp 500bp Hình 4.5 Kết khảo sát nồng độ Master mix (1) nồng độ μl (2) nồng độ μl (3) nồng độ 10 μl (-) đối chứng âm(L) ladder 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR Sản phẩm PCR sau điện di agarose 1.5% thu vạch DNA với kích thước 821 bp mong muốn Tuy nhiên, chưa thể kết luận DNA loài H parasuis Do phương pháp giải trình tự gen áp dụng để kiểm chứng sản phẩm PCR Đoạn trình tự nucleotide sau giải (Cơng ty Nam Khoa) tiến hành kiểm tratrên Genbank công cụ BLAST NCBI, kết trình bày theo độ tương đồng giảm dần, 100 trình tự có độ tương đồng cao với đoạn gen cysS có 85 trình tự tương đồng 100% 15 trình tự tương đồng 99% 34 Hình 4.6 Kết BLAST sản phẩm phản ứng PCR phát H parasuis Kết BLAST thể Hình 4.6 cho thấy có lồi mang gen tương đồng với trình tự cysS đề tài H parasuis vị trí tương đồng nằm vùng gen mã hóa cysS H parasuis Như kết luận trình tự mà 35 phản ứng PCR phát H parasuis khuếch đại với trình tự cysS hồn toàn đặc hiệu với H parasuis 4.5 Ứng dụng quy trình PCR mẫu thực địa Khi xác định thành phần phản ứng chu trình luân nhiệt phù hợp,tiến hành thực phản ứng s-PCR phát H parasuistrên 30 mẫu DNA ly trích từ mơ (phổi, gan, lách, thận, hạch) heocai sữa có dấu hiệu rối loạn hô hấp 4.5.1 Kết ứng dụng quy trình PCR mẫu thực địa Sau thực phản ứng s-PCR phát H parasuis 30 mẫu DNA, kết thu 9/30 mẫu dương tính với mầm bệnh chiếm tỷ lệ 30% Kết thấp số nghiên cứu trước Theo Oliveira ctv (2000) 30 mẫu DNA xét nghiệm phát H parasuis kỹ thuật PCR, có 18 mẫu dương tính với tỷ lệ 60%, năm 2012 Oliveira ctv nghiên cứu 245 mẫu bệnh phẩm, có 53,6% mẫu dương tính với vi khuẩn H parasuis 10 (+) (-) 821bp L 500bp Hình 4.7 Kết ứng dụng quy trình s-PCR mẫu thực địa 1-10: sản phẩm PCR mẫu thực địa (+)Đối chứng dương (-) Đối chứng âmL: ladder 36 4.5.2 Đánhgiá thống kết s-PCR m-PCR Trong 30 mẫu thực phản ứng s-PCR, có 20 mẫu trước thực phản ứng m-PCR phát H parasuis(Theo Đoàn Thị Nhung, 2013), so sánh 20 kết phương pháp s-PCR m-PCR Sử dụng phần mềm Win Episcope 2.0 vớihệ số Kappa (K) đánh giá mức độ tương đồng quy trình s-PCR m-PCR phát vi khuẩn H.parasuis gây viêm phổi viêm đa mạc heo Bảng 4.5 Kết phản ứng s-PCR m-PCR phát H parasuis Mẫu Kết s-PCR Kết m-PCR A - - B + + C - - D + + E + + F + + G - - H - - I - - K + + L - - M - - N + + O + + P - - Q + + R - - S - - 37 T - - U - - 20 8/20 8/20 Tỉ lệ dương tính với H parasuisxét nghiệm phương pháp s-PCRlà 8/20 mẫu chiếm tỷ lệ 40 %, mẫu trước cho kết dương tính vớiH parasuis xét nghiệm phương pháp m-PCR Bảng 4.6 So sánh kết s-PCR m-PCR s-PCR m-PCR Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 12 Hình 4.8 Xử lý số liệu với phần mềm Win Episcope 2.0 38 Sau xử lý số liệu với phần mềm Win Episcope 2.0, kết hệ số Kappa (K) = cho thấy kết hai phương pháp s-PCR m-PCR phát H parasuis hoàn toàn thống nhất, tương đồng với 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài chúng tơi hồn thành mục tiêu đề thu kết sau • Tối ưu thành phần phản ứng PCR phát vi khuẩn H parasuistrên heo với nồng độ primerHP-cysS F, HP-cysS R l 0,5àM, Go taqđ green master mix 1X l 8àl • Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát vi khuẩn H parasuis heo sau: tiền biến tính 95 oC phút; biến tính 94 oC 30 giây, bắt cặp 56 oC phút, kéo dài 72 oC phút (ba giai đoạn lặp lại 35 chu kỳ); giai đoạn kéo dài cuối 72 oC phút Quy trình PCR chúng tơi xây dựng ứng dụng vào thực tiễn công tác chẩn đốn mầm bệnh H parasuis heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp Bệnh viện thú y – Đại học Nông Lâm TPHCM 5.2 Đề nghị Khảo sát yếu tố nồng độ dNTP, MgCl2, số chu kỳ cho quy trình chuẩn phát H parasuis kỹ thuật PCR Khảo sát bậc pha loãng DNA khác để có khoảng giới hạn phát gần nhất, qua đánh giá độ nhạy quy trình PCR phát H parasuis 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 195 – 209 Tô Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, trang 64 – 67 Trần Thị Dân Lê Thanh Hiền, 2007 Dịch tễ học thú y Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 75 – 78 Nguyễn Phú Dũng, 2005 Xây dựng quy trình phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu (Mealybug wilt) dứa Cayenne phương pháp RTPCR.Luận văn tốt nghiệp Bộ mônCông nghệ sinh học - trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008 Sinh Học Phân Tử(khái Niệm – Phương Pháp Ứng Dụng) Tái lần thứ năm.Nhà xuất Giáo Dục Thành Phố Hồ Chí Minh, 300 trang Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 66 - 67 Bùi Thị Hương Linh, 2013 Khảo sát mô bệnh học phân lập số vi trùng gây bệnh phổi heo cai sữa bị bệnh hô hấp phức hợp số trại heo 41 tỉnh phía Nam Luận văn tốt nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y - trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Trung Ngoan, 2005.Chẩn đoán Haemophilus parasuis từ phổi heo có bệnh tích nghi ngờ lò quay thuộc huyện Hóc mơn TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y - trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Phan Cự Nhân, 2001 Di truyền học động vật Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 157 – 164 10 Đoàn Thị Nhung, 2013 Xây dựng quy trình multiplex-PCR phát Porcine circovirus type (PCV2), H parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) gây bệnh rối loạn hô hấp phức hợp heo Luận văn tốt nghiệp Bộ mônCông nghệ sinh học - trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam 11 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm heo Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, trang 141 - 146 12 Khuất Hữu Thanh, 2006 Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 154 – 172 13 Cao Anh Thi, 2011 Xây dựng quy trình chuẩn phát vi khuẩn Streptococcus suis Streptococcus suis type kỹ thuật Polymerase Chain Reaction 42 (PCR) Luận văn tốt nghiệp khoa Công nghệ Thực phẩm - trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam 14 Tổ chức Hợp tác Quốc tế Nhật Bản, 2001 Tập ảnh màu bệnh gia súc Dự án tăng cường lực viện Thú y Quốc gia, trang 124 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 M Hicinova, 2010 Multiplex PCR assay for Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis in Lungs of Pigs from a Slaughterhouse 16 Promega, 2012 Certificate of Analysis - GoTaq® Green Master Mix INTERNET 17 Simone Oliveira, Lucina Galina and Carlos Pijoan, “Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections”, University of Minnesota, November 21st 2000, 18 Simone Oliveira,“Haemophilus parasuis detection by PCR and strain characterization by genotyping”, University of Minnesota, June 26th2012,