ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ NHÂN NHANH RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐƯỢC CHUYỂN GENIN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG NI CẤY VÀ CHẤT ĐIỀU HỊA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ NHÂN NHANH RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐƯỢC CHUYỂN GENIN VITRO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN LỆ QUYÊN Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 12 năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ NHÂN NHANH RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐƯỢC CHUYỂN GENIN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS HÀ THỊ LOAN TRẦN NGUYỄN LỆ QUYÊN Tháng 12 năm 2013   LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến ThS Hà Thị Loan, người hướng dẫn tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Lê Đình Đơn - Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Cảm ơn lãnh đạo Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Tơi xin cảm ơn Thầy, Cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học Thầy, Cô khác dạy cho suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, muốn gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Bảo Linh, cố vấn học tập lớp DH10SH, cô dạy, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm khóa luận Xin chân thành cảm ơn cán nhân viên Phòng Cơng nghệ Sinh học thực vật, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ tơi thời gian thực tập phòng Xin cảm ơn tập thể lớp DH10SH chia sẻ khó khăn, vất vả, vui buồn hỗ trợ trình thực đề tài Mong tất thành viên lớp khỏe mạnh, hạnh phúc thành cơng Cuối xin dành tình cảm thiêng liêng gửi tới ba mẹ, người cho sống này, nuôi dưỡng dạy dỗ nên người Con xin cảm ơn ông bà, bác anh chị em gia đình Gia đình chỗ dựa lớn Tp Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 12 năm 2013 Sinh viên Trần Nguyễn Lệ Quyên iii TÓM TẮT Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) loài sâm quý đặc hữu Việt Nam Hiện việc nuôi cấy rễ tóc để thu sinh khối dược liệu ngày phát triển đơn giản, tốn kém, thu sinh khối nhanh bệnh Vì đề tài thực nhằm khảo sát môi trường khống nồng độ chất điều hòa sinh trưởngthích hợp cho q trình nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh để bước đầu thiết lập quy trình nhân sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Đề tài gồm thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Thí nghiệm ảnh hưởng GA3 kết hợp với auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Thí nghiệm ảnh hưởng BA kết hợp với auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Mơi trường ni cấy yếu tố quan trọng nuôi cấy mô thực vậtin vitro Đề tài thực ni cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh mơi trng khoỏng c bn l B5, SH, MS,ẵMS vẳMS Kt cho thấy mơi trường SH thích hợp cho nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linhin vitro,rễ tóc có màu vàng sáng, tạo thành cụm Sau rễ tóc sâmNgọc Linh ni cấy mơi trường SH có bổ sung IBA (0,0 – 2,0 mg/l) NAA (0,0 – 2,0 mg/l)thì mơi trường SH + 1,0 mg/l NAA thích hợp cho nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh với trọng lượng rễ tươi cao (2,53 g).Môi trường SH + 1,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l GA3 môi trường SH + 1,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA tìm thấy tốt môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với GA3(0,0– 2,0 mg/l) vàmôi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với BA (0,0 - 1,0 mg/l) Từ khóa: sâm Ngọc Linh, rễ tóc, mơi trường ni cấy rễ tóc, chất điều hòa sinh trưởng thực vật iv SUMMARY Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) is a species of ginseng in Vietnam Currently, the cultured hairy root to collect biomass in medicinal plant growing so simple, less expensive, fast and free from environmental fluctuation The thesis was conducted to survey the mineral salt formulations and plant growth regulators concentration optimized for rapid in vitro process of Ngoc Linh ginseng hairy root Topics include four experiments: Experiment study of environmental impact mineral base to the rapid growth of Ngoc Linh ginseng hairy root Experiment effect of auxin on multiplication of Ngoc Linh ginseng hairy root Experiment effect of GA3 on auxin combined with rapid replication Ngoc Linh ginseng hairy root Experiment effect of BA on auxin combined with rapid replication Ngoc Linh ginseng hairy root The medium composition is one of the most important factors in plant cell culture in vitro.B5, SH, MS, ½ MS and ¼MS liquid media were used to investigate hairy root growth The results show that SH liquid mediawerethe best for the growth of Ngoc Linh ginseng hairy root in vitro, bright yellow, forming clusters hairy root Then Ngoc Linh ginseng hairy rootis cultured on SH medium supplemented with IBA (0.0 - 2.0 mg/l) and NAA (0.0 - 2.0 mg/l), SH environment +1.0 mg/l NAA is suitable for the growth of Ngoc Linh ginseng hairy roots with the highest fresh root weight (2.53 g) SH media+ 1.0 mg/l NAA + 1.0 mg/l GA3 and SH media + 1.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l BA was found to the best of the SH mediaadd 1.0 mg/l NAA in combination with GA3 (0.0- 2.0 mg/l) andSH mediaadd 1.0 mg/l NAA in combination with BA(0.0 - 1.0 mg/l) Key words: Ngoc Linh ginseng, hairy root, hairy root culture, plant growth regulator v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan sâm Ngọc Linh 2.1.1 Chi nhân sâm Panax L 2.1.2 Nguồn gốc lịch sử phát triển sâm Ngọc Linh 2.1.3 Phân loại khoa học sâm Ngọc Linh 2.1.4 Hình thái thực vật sâm Ngọc Linh 2.1.5 Đặc điểm sinh thái sâm Ngọc Linh 2.1.6 Thành phần hóa học sâm Ngọc Linh 2.1.7 Tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh 10 2.2 Tình hình nghiên cứusâm Ngọc Linh 12 2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào sâm Ngọc Linh 12 2.2.2 Nghiên cứu nhân sinh khối sâm Ngọc Linh 13 2.3 Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 14 2.3.1 Sự tạo thành rễ tóc 14 2.3.2 Các nghiên cứu chuyển gen rol tạo rễ tóc sâm 15 vi 2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy rễ tóc sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp 16 2.4 Sơ lược nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 2.4.1 Kĩ thuật nuôi cấy lỏng lắc 17 2.4.2 Các chất điều hòa sinh trưởng 18 2.4.3 Một số loại môi trường 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm thực tập 20 3.2 Vật liệu thí nghiệm 20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 20 3.3 Các thí nghiệm tiến hành 21 3.3.1 Ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 21 3.3.2 Ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 21 3.3.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 22 3.3.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 23 3.4 Xử lí số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 25 4.2 Ảnh hưởng auxin đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 26 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 29 4.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 38 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B5 Môi trường Gamborg (1976) MS Môi trường Murashige and Skoog (1962) ½MS Mơi trường MS có tất thành phần giảm nửa ¼MS Mơi trường MS có tất thành phần giảm ¾ lần SH Môi trường Schenk and Hildebrandt (1972) BA 6-benzylaminopurine GA3 Gibberellic acid IBA Indol-3-butyric acid NAA α-naphthalene acetic acid Sâm K5 Sâm khu ctv cộng tác viên CV% Coefficient of Variation – Độ biến thiên NT nghiệm thức viii DANH SÁCH CÁC BẢNG   Trang Bảng 2.1 Thành phần hóa học chung sâm Ngọc Linh hoang dại 10  Bảng 3.1Thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khoáng 21 Bảng 3.2 Thí nghiệm ảnh hưởng auxin 22 Bảng 3.3 Thí nghiệm ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 23 Bảng 3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng NAA kết hợp BA 24 Bảng 4.1 Ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng auxin đến nhân nhanh rễ tóc 27 Bảng 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 đến nhân nhanh rễ tóc 29 Bảng 4.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA đến nhân nhanh rễ tóc 31 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sâm Ngọc Linh Hình 2.2 Củ rễ sâm Ngọc Linh từ - tuổi Hình 2.3 Hoa sâm Ngọc Linh Hình 3.1 Rễ tóc sâm Ngọc Linh chuyển gen nhờ vi khuẩn A rhizogenes 20 Hình 4.1 Ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc 26  Hình 4.2 Ảnh hưởng auxin đến nhân nhanh rễ tóc 28 Hình 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3đến nhân nhanh rễ tóc 30  Hình 4.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA đến nhân nhanh rễ tóc 32  x 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Sự phân chia tế bào tăng lên mặt số lượng tế bào, lớn lên quan toàn lại phụ thuộc vào tăng kích thước tế bào nhờ giai đoạn giãn tế bào tiếp sau phân chia chúng Kích thước tế bào giai đoạn tăng nhanh chiều ngang chiều dọc Điều kiện tối cần thiết cho giãn tế bào kích thích phytohormone Hai hormone có vai trò quan trọng giai đoạn auxin gibberellin Cả hai kích thích giãn nở thành tế bào tăng kích thước tế bào Tuy nhiên, auxin kích thích giãn nở tế bào chủ yếu theo chiều ngang, gibberellin có xu hướng kích thích giãn nở tế bào theo chiều dọc Sự có mặt cân hai hormone điều kiện cần thiết cho giãn tế bào cân đối sinh trưởng bình thường Gibberellin chất không bền nhiệt, hấp tiệt trùng nhiệt độ cao phần bị phân hủy nên làm giảm tác dụng lên mẫu mô nuôi cấy Từ kết thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro, chọn môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA để thực thí nghiệm kết hợp với nồng độ GA3 Bảng 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Nghiệm thức G0 (ĐC) G1 G2 G3 CV% Nồng độ Nồng độ NAA (mg/l) GA3 (mg/l) 1,0 0,0 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 2,0 Trọng lượng mẫu ban đầu (g) 0,2 0,2 0,2 0,2 Trọng lượng rễ tươi sau 30 ngày nuôi cấy (g) 1,02b± 0,10 0,81b± 0,14 1,34a± 0,06 0,95b± 0,13 10,73 Trong cột giá trị trung bình khơng kí tự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0,01) Kết bảng 4.3 cho thấy: Trọng lượng rễ tươi thu rễ tóc sâm Ngọc Linh ni cấy thí nghiệm tương đối thấp Trong mơi trường SH có bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1,0 mg/l GA3 cho kết cao (hình 4.3) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p ≤ 0,01) Trọng lượng tươi rễ tóc thu tăng 6,7 lần so với khối lượng mẫu ban đầu Kết quan sát hình thái rễ, nhận thấy rễ thí nghiệm có xu hướng phình to, rễ có phân nhánh khơng dài Ngun nhân thời gian theo dõi ngắn (30 ngày) Tuy nhiên khơng có khác biệt rõ mặt hình thái 29 nghiệm thức có bổ sung GA3 nghiệm thức khơng bổ sung GA3.Ford ctv cho nuôi cấy rễ tóc Prunus avivum mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/lGA3 kích thích phát triển Tuy nhiên ni cấy rễ tóc A annua bổ sung GA3 cho lượng sinh khối cao lại ức chế tổng hợp alkaloids(trích dẫn bởiJeong ctv, 2007) Đồi chứng 0,5 mg/l GA3 + 1,0 mg/l NAA 1,0 mg/l GA3 + 1,0 mg/l NAA 2,0 mg/l GA3 + 1,0 mg/l NAA Hình 4.3Rễ tóc sâm Ngọc Linh 30 ngày sau cấy mơi trường SH có bổ sung GA3 NAA   4.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Từ kết thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro, chọn mơi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA để thực thí nghiệm kết hợp với nồng độ BA 30 Bảng 4.4 Ảnh hưởng NAA kết hợp BA đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Nghiệm thức B0 (ĐC) B1 B2 B3 CV% Nồng độ NAA (mg/l) 1,0 1,0 1,0 1,0 Nồng độ BA (mg/l) 0,0 0,1 0,5 1,0 Trọng lượng mẫu ban đầu (g) 0,2 0,2 0,2 0,2 Trọng lượng rễ tươi sau 30 ngày nuôi cấy (g) 1,08b± 0,13 1,32b± 0,03 2,22a± 0,24 0,40c± 0,01 10,75 Trong cột giá trị trung bình khơng kí tự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,01) Từ kết bảng 4.4 cho thấy: BA có ảnh hưởng đến nhân nhanh sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp 0,5 mg/l BA tốt cho phát triển rễ tóc Khi tăng nồng BA từ – 0,5 mg/l trọng lượng tươi thu tăng đạt trọng lượng tươi cao nồng độ 0,5 mg/l BA (2,22 g) Nghiệm thức B2 cho kết cao khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với nghiệm thức lại Khi tăng nồng độ BA lên 1,0 mg/l trọng lượng tươi thu giảm rõ rệt (0,40 g) Điều tương tác NAA BA trình điều hòa sinh trưởng thực vật Theo kết nghiên cứu Jeong ctv (2007), bổ sung BA vào mơi trường ni cấy (mơi trường có agar) nồng độ thấp (1,0 mg/l) làm tăng sinh khối rễ tóc Panax ginseng Đối chứng 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA 1,0 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA Hình 4.4Rễ tóc sâm Ngọc Linh 30 ngày sau cấy môi trường SH có bổ sung BA NAA 31   Cytokinin nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cytokinin có ảnh hưởng thực vật ngun vẹn có hiệu việc kích thích sinh tổng hợp protein Khi phối hợp với auxin cytokinin kích thích phân chia tế bào điều khiển phát sinh hình thái Thơng thường cytokinin có tác dụng ức chế tạo rễ kết hợp với auxin nồng độ thích hợp lại có tác dụng kích thích q trình tạo rễ thực vật Nồng độ cytokinin cao auxin thấp kích thích tạo chồi ngược lại auxin cao cytokinin thấp kích thích tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng ctv, 2006) Tỷ lệ auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hình thái (morphogenesis) hệ thống nuôi cấy Đối với phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trường hợp ngược lại dẫn đến sinh sản chồi chồi nách Vấn đề quan trọng không nồng độ hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng Chẳng hạn 2,4-D với BA nồng độ 5,0 ppm kích thích tạo thành callus Agrostis dùng nồng độ 0,1 ppm chúng kích thích tạo chồi trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin (Lê Văn Hoàng, 2007)       32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ   5.1 Kết luận Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy chất điều hòa sinh trưởng lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro bước nghiên cứu sản xuất sinh khối sâm Ngọc Linh quy mô lớn.Từ kết thu thí nghiệm kết luậnđược rút ra: Mơi trường khống thích hợp cho nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh mơi trường SH môi trường B5 Môi trường SH bổ sung hai loại auxin NAA IBA cho thấy trọng lượng rễ cao môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, mơi trường bổ sung1,0 mg/l NAA mơi trường bổ sung 1,0 mg/l IBA khơng có khác biệt mặt thống kê ba nghiệm thức này.Tuy nhiên môi trường SH bổ sung NAA nồng độ 1,0 mg/l cho trọng lượng rễ cao Khi rễ tóc ni cấy mơi trường SH1,0 mg/l NAA 1,0 mg/lGA3 cho kết cao kết hợp NAA GA3 Môi trường SH bổ sung1,0 mg/l NAA 0,5 mg/l BA thích hợp cho nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 5.2 Đề nghị Thí nghiệm thực dòng rễ chuyển gen Do cần tiến hành thí nghiệm so sánh sinh trưởng số dòng rễ chuyển gen mà Trung tâm có Tiếp tục khảo sát yếu tố khác ảnh hưởng lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh như: nồng độ đường, tỷ lệ NO3-/NH4+ khối lượng mẫu/thể tích ni cấy Trên sở áp dụng vào sản xuất với quy mơ lớn Thí nghiệm nhằm nhân nhanh sinh khối chưa tiến hành nghiên cứu hàm lượng saponin nghiệm thức Đề nghị nghiên cứu thực phân tích saponin 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà Nội Đơn vị nghiên cứu chuyên đề Sâm Khu 5, Bộ Y tế 1981 Tài liệu nghiên cứu Sâm Khu Hội nghị sơ kết chuyên đề Sâm Khu lần thứ nhất, – 54 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận Nguyễn Thị Thu Hương 2007 Sâm Việt Nam số thuốc họ nhân sâm Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, Hà Nội Trần Thị Dung 2003 Bài giảng Nuôi cấy mô tế bào thực vật Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Hà Thị Dụng, Grushvitsky I.V 1985 Một loài thuộc chi (Panax L.), họ Nhân sâm (Araliaceae) Việt Nam Tạp chí sinh học, tập 7, 45 – 48 Phan Văn Đệ, Grushvitsky I.V., Skavortsova N.T 1983 Đặc tính hình thái – giải phẫu Panax vietnamensis Leningrad Tạp chí Thực vật học, tập 70, 512 – 522 Phan Văn Đệ, Grushvitsky I.V., Skavortsova N.T 1987 Những hoa tự bất thường củaPanax vietnamensis Leningrad Tạp chí Thực vật học, tập 72, 1079 -1082 Nguyễn Bá Hoạt 1999 Những dẫn liệu hình thái sâm phát Việt Nam Thông báo dược liệu, số 1,5 – 9 Lê Văn Hồng 2007 Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật Nhà xuất đại học Bách khoa Đà Nẵng 10 Triệu Văn Hùng 2007 Lâm sản gỗ Việt Nam NXB Bản đồ, 545 – 547 11 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết 2011 Nghiên cứu khả tạo rễ bất định Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensisHa et Grushv.) ni cấy in vitro Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 27: 30 – 36 12 Đào Kim Long ctv 1973 Thông báo loài chi Panax phát tỉnh Kon Tum, – 34 13 Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên 2006 Công nghệ tế bào Nhà xuất đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh 14 Bùi Thị Nhã 2011 Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật tối ưu cho q trình ni cấy in vitro sâm Ngọc Linh(Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Khóa luận tốt nghiệp Kĩ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Thới Nhâm, Trần Cơng Luận, Nguyễn Dũng 1979 Nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Khu 5: chiết suất so sánh thành phần saponin Sâm Khu với Sâm Triều Tiên TL.06/HH-79-D9VSK5, – 17 16 Thân Thị Minh Phương 2011 Khảo sát ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng thực vật số chất hữu nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Khóa luận tốt nghiệp Kĩ sư Nông học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 17 Xơ Lê Tăng ctv 1981.Một số kinh nghiệm sử dụng Sâm Khu người địa phương dân quân kháng chiến chống Mỹ vùng Liên khu Trích: “ Báo cáo Hội nghị chuyên đề Sâm Khu lần 1” tháng 9/1981 18 Nguyễn Văn Trương Trịnh Văn Thịnh 1991 Từ điển Bách khoa Việt Nam, 360 Tài liệu tiếng Anh 19 Chandran R.P., Potty V.P 2008 Induction of hairy roots through the mediation of four strains of Agrobaterium rhizogenes on five host plants The Indian Journal of Biotechnology, 7: 122 - 128 20 Hwang S.J., Kim K.S., Pyo B.S., Hwang B 1999 Saponin production by hairy root cultures of Panax ginseng CA Meyer: influence of PGR and Polyamines The Biotechnol Bioprocess Eng, 4: 309 - 312 21 Jeong G.T., Park D.H., Hwang B., Park K., Kim S.W, Woo J.C 2002 Studies on Mass Production of transformed Panax ginseng hairy roots in Bioreactor.The Applied Biochemistry and Biotechnology, 98 – 100: 1115 - 1127 22 Jung S.M., Kim S.W., Ban S.H., In D.S., Jung J.D., Chung H.J., Liu J.R., Lim Y.P., Choi D.W.2006 Glutamine accumulation inhibits root growth and lateral root formation in ginseng hairy roots The Plant Science, 170: 801 – 807 35 23 Kochan E., Wasiela M., Scienkiewicz M 2013 The production of ginsenosides in hairy root cultures of American Ginseng, Panax quinquefolium L and their antimicrobial activity The In Vitro Cell Dev Biol Plant, 49: 24 – 29 24 Nhut D.T., Huy N.P., Luan V.Q., Binh N.V., Nam N.B., Thuy L.N.M., Ha D.T.N., Chien H.X., Huong T.T., Cuong H.V., Cuong L.K., Hien V.T 2011 Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv from ex vitro leaf - derived callus The African Journal of Biotechnology, 10: 19499 - 19504 25 Nhut D.T., Vinh B.V.T., Hien T.T., Huy N.P., Nam N.B., Chien H.X 2012 Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) The African Journal of Biotechnology, 11: 1084 - 1091 26 Washida D., Shimomura K., Nakajima Y., Takido M., Kitanaka S 1998 Ginsenosides in hairy roots of a Panax Hybrid The Phytochemistry, 49: 2331 - 2335 27 Washida D.,Shimomura K.,Takido M.,Kitanaka S 2004 Auxins Affected Ginsenoside Production and Growth of Hairy Roots in Panax Hybrid TheBiol Pharm Bull., 27: 657 – 660 28 Woo S.S., Song J.S., Lee J.Y., In D.S., Chung H.J., Liu J.R., Choi D.W 2004 Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis The Phytochemistry, 65: 2751 – 2761 29 Yang D.C., Choi Y.E 2000 Production of transgenic plants via Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Panax ginseng The Plant Cell Reports, 19: 491 496 Tài liệu Internet 30 Củ rễ sâm Ngọc Linh.home.hiroshima-u.ac.jp/shoyaku/PP2002B.htm Ngày truy cập: 25/11/2013 31 Hoa sâm Ngọc Linh.http://laodong.com.vn/phong-su/song-ngam-tren-dinhngoc-linh-68129.bld Ngày truy cập: 25/11/2013 32 Sâm Ngọc Linh.http://www.vncreatures.net/chitiet.php?page=1&loai=2&ID=3151 Ngày truy cập: 20/12/2013 36 37 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần mơi trường khống sử dụng cho thí nghiệm Thành phần (NH4)2SO4 MgSO4ì 7H2O Na2SO4 KC1 CaC12ì 2H2O NaNO3 KNO3 Ca(NO3)2ì 4H2O NH4NO3 NaH2PO4ì H2O NH4H2PO4 KH2PO4 FeSO4ì 7H2) Na2EDTA MnSO4ì 4H2O ZnSO4ì 7H2O CuSO4ì 5H2O H2SO4 Fe2(SO4)3 NiC12ì 6H2O CoC12ì 6H2O A1C13 FeC13ì 6H2O FeC6O5H7ì 5H2O K1 H3BO3 Na2M0O4ì 2H2O Murashige Skoog(1962) 370 440 1,900 1,650 170 27.8 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 Gamborg (1968) 134 500 150 3,000 150 27,8 37,3 10 (1 H2O) 0,025 0,025 0,75 0,25 Schenk Hildeb (1972) 400 200 2,500 300 15 20 10 0,1 0,2 0,1 1,0 0,1 Phụ lục 2: Kết xử lý thống kê Thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Bảng Trọng lượng rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 40 ngày nuôi cấy NT M2 M3 M4 M1 M5 Trung bình 1,14 1,18 1,29 2,03 2,33 1,59 Lần lặp lại 1,33 1,64 1,70 2,21 2,13 1,80 1,55 1,10 1,64 2,45 2,21 1,79 Trung bình 1,34 1,31 1,54 2,23 2,22 1,73 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2.579 0.645 13.978 0.0004 Within 10 0.461 0.046 Total 14 3.040 Coefficient of Variation = 12.42% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 4.020 1.340 0.21 0.12 3.00 3.920 1.307 0.29 0.12 3.00 4.630 1.543 0.22 0.12 3.00 6.690 2.230 0.21 0.12 3.00 6.670 2.223 0.10 0.12 -Total 15.00 25.930 1.729 0.47 0.12 Within 0.21 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitrodựa kết Bảng Original Order Mean = 1.340 Mean = 1.310 Mean = 1.540 Mean = 2.230 Mean = 2.220 Ranked Order B Mean = B Mean = B Mean = A Mean = A Mean = 2.230 2.220 1.540 1.340 1.310 A A B B B Thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro Bảng Trọng lượng tươi rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 40 ngày ni cấy NT A0 (ĐC) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 2,00 1,80 2,00 2,88 1,76 2,18 1,00 3,00 1,83 2,05 Lần lặp lại 2,42 1,66 1,93 2,21 1,79 1,91 1,55 2,58 1,61 1,96 2,20 1,61 1,90 2,03 2,18 1,63 1,31 2,02 2,33 1,88 Trung bình 2,21 1,69 1,94 2,37 1,91 1,91 1,29 2,53 1,92 1,97 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 3.275 0.409 4.378 0.0044 Within 18 1.683 0.094 Total 26 4.958 Coefficient of Variation = 15.48% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 6.620 2.207 0.21 0.18 3.00 5.070 1.690 0.10 0.18 3.00 5.830 1.943 0.05 0.18 3.00 7.120 2.373 0.45 0.18 3.00 5.730 1.910 0.23 0.18 3.00 5.720 1.907 0.28 0.18 3.00 3.860 1.287 0.28 0.18 3.00 7.600 2.533 0.49 0.18 3.00 5.770 1.923 0.37 0.18 -Total 27.00 53.320 1.975 0.44 0.08 Within 0.31 Bảng 6Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitrotrên kết Bảng Original Order Mean = 2.210 Mean = 1.690 Mean = 1.940 Mean = 2.370 Mean = 1.910 Mean = 1.910 Mean = 1.290 Mean = 2.530 Mean = 1.920 Ranked Order AB Mean BC Mean ABC Mean AB Mean ABC Mean ABC Mean C Mean A Mean ABC Mean 8= 4= 1= 3= 9= 6= 5= 2= 7= 2.530 2.370 2.210 1.940 1.920 1.910 1.910 1.690 1.290 A AB AB ABC ABC ABC ABC BC C Thí nghiệm ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linhin vitro Bảng 7Trọng lượng rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 30 ngày nuôi cấy NT G0 (ĐC) G1 G2 G3 Trung bình 1,10 0,87 1,37 1,02 1,09 Lần lặp lại 1,04 0,90 1,38 1,04 1,09 0,91 0,65 1,28 0,80 0,91 Trung bình 1,02 0,81 1,34 0,95 1,03 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitro số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.462 0.154 12.623 0.0021 Within 0.098 0.012 Total 11 0.560 Coefficient of Variation = 10.73% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.050 1.017 0.10 0.06 3.00 2.420 0.807 0.14 0.06 3.00 4.030 1.343 0.06 0.06 3.00 2.860 0.953 0.13 0.06 -Total 12.00 12.360 1.030 0.23 0.07 Within 0.11 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm kết Bảng Original Order Mean = 1.020 Mean = 0.810 Mean = 1.340 Mean = 0.950 Ranked Order B Mean = B Mean = A Mean = B Mean = 1.340 1.020 0.950 0.810 A B B B Thí nghiệm ảnh hưởng củaNAA kết hợp BA lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linhin vitro Bảng 10 Khối lượng rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 30 ngày ni cấy NT B0 (ĐC) B1 B2 B3 Trung bình 1,14 1,29 2,47 0,39 1,33 Lần lặp lại 1,17 1,35 2,00 0,4 1,23 0,94 1,33 2,18 0,40 1,21 Trung bình 1,08 1,32 2,22 0,40 1,255 Bảng 11 Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitrotrên số liệu Bảng 10 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 5.087 1.696 93.126 0.0000 Within 0.146 0.018 Total 11 5.233 Coefficient of Variation = 10.75% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.250 1.083 0.13 0.08 3.00 3.970 1.323 0.03 0.08 3.00 6.650 2.217 0.24 0.08 3.00 1.190 0.397 0.01 0.08 -Total 12.00 15.060 1.255 0.69 0.20 Within 0.13 Bảng 12 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệmảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh in vitrotrên số liệu Bảng 10 Original Order Mean = 1.080 Mean = 1.320 Mean = 2.220 Mean = 0.400   B B A C Ranked Order Mean = Mean = Mean = Mean = 2.220 1.320 1.080 0.400 A B B C ... Ảnh hưởng mơi trường khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 21 3.3.2 Ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 21 3.3.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc. .. nghiệm ảnh hưởng mơi trường khống đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Thí nghiệm ảnh hưởng auxin lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh Thí nghiệm ảnh hưởng GA3 kết hợp với auxin lên nhân nhanh rễ tóc. .. khống lên nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 25 4.2 Ảnh hưởng auxin đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 26 4.3 Ảnh hưởng NAA kết hợp GA3 đến nhân nhanh rễ tóc sâm Ngọc Linh 29 4.4 Ảnh hưởng