NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM BÓN CHO MÍA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BĨN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM BĨN CHO MÍA Ngành học Sinh viên thực Niên khóa : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : ĐỖ XUÂN NGỌC : 2011-2013 Tháng 12/ 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BĨN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM BĨN CHO MÍA Ngành học Sinh viên thực Niên khóa : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : ĐỖ XUÂN NGỌC : 2011-2013 Tháng 12/ 2013 i LỜI CÁM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bố Mẹ ngƣời sinh ra, ni dƣỡng, chăm sóc lo lắng cho trở thành ngƣời hữu ích cho xã hội, động viên suốt thời gian xa nhà Tôi gửi lời cám ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tất thầy cô tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tơi thời gian tơi theo học trƣờng Xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến Công Ty Thành Thành Công tài trợ học bổng cho tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập nghiên cứu Kế đến xin gửi lời cám ơn đến, Th.S Võ Thị Thúy Huệ K.S Nguyễn Minh Quang, ngƣời hƣớng dẫn khoa học cho suốt thời gian thực luân văn, Thầy Cô tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thề hồn thành tốt khóa luận Đồng thời, Thầy Cô quan tâm, theo dõi động viên tinh thần để tơi vƣợt qua khó khăn q trình thực khóa ln Tơi xin cám ơn bạn lớp LT11SH bạn Trƣơng Hân Hân, Phan Văn Tuấn, Đinh Thị Hà Ni đồng hành chia sẻ niềm vui, khó khăn, động viên cung cấp giúp tơi thêm nghị lực để vƣợt lên tất hoàn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! Thành Phố Hồ Chí Minh tháng 12/ 2011 Đỗ Xuân Ngọc ii TÓM TẮT Xu phát triển công nghệ ứng dụng sử dụng chế phẩm, phân bón sinh học chủ yếu sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinhvật Việc sử dụng sản phẩm sinh học canh tác nông nghiệp góp phần cải tạo đất, giảm nhiễm mơi trƣờng, sinh thái Bên cạnh đó, thời kỳ ngành cơng nghiệp mía đƣờng nƣớc ta phát triển, việc nghiên cứu loại phân bón vi sinh hay chế phẩm sinh học phù hợp cho mía cần thiết Trên sở tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm bón cho mía” Kết nhƣ sau: - Phân lập làm đƣợc chủng vi khuẩn có khả phát triển môi trƣờng NFb từ 12 mẫu đất, thân, lá, rễ mía từ ruộng trồng mía tỉnh Tây Ninh - Tuyển chọn định danh đƣợc chủng vi khuẩn có khả phân giải đạm cao nhất: + Chủng NR1 có tên Stenotrophomonas maltophilia + Chủng NR2 có tên Pseudomonas putida - Xác định thời gian nhân sinh khối vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia tối ƣu 120 đạt mật số: 2,6 X 1010 (CFU/ml), pH dung dịch vi khuẩn 6,8, kết đạt tiêu chuẩn phân bón vi sinh (Theo quy định Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn thông tƣ 36/2010/TT-BNNPTNT ngày 24 tháng 06 năm 2010) iii SUMMARY New trends in technology development and applications currently used biological products and fertilizers which are mostly products derived from microorganism The use of bio-based products in agriculture will contribute to improve soil, reduce environmental pollution and ecological Besides, during the current sugar industry in our country is growing, then the study of biological products or microorganism fertilizer are suitable for sugarcane are essential On that basis, we carried out the thesis: " Research and Production of microorganism fertilizer product containing nitrogen fixing bacteria for sugarcane " The results: - Seven bacterial strains were isolated and purified on the NFb medium from stem, leaf and root tissues of sugarcane in TayNinh province - Selection and identification of two strains of nitrogen-fixing bacteria : + Stenotrophomonas maltophilia + Pseudomonas putida - Producion of microorganism fertilizer (including nitrogen fixing bacteria Stenotrophomonas maltophilia) met the standard stipulated in the Circular No 36/2010/TT-BNNPTNT on June 24, 2010 promulgated by the Ministry of Agriculture and Rural Development (biomass concentration at 2,6 X 1010 Cfu/mL, pH value of 6,8) iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chƣơng I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chƣơng II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan mía 2.1.1 Thực trạng ngành công nghiệp mía đƣờng nƣớc ta 2.2 Tổng quan phân vi sinh 2.2.1 Giới thiệu phân bón vi sinh 2.2.2 Phân loại phân vi sinh theo công nghệ sản xuất 2.2.3 Giới thiệu vi sinh vật cố định đạm 2.2.3.1 Định nghĩa vi khuẩn cố định nitơ tự 2.2.3.2 Arthrobacter 2.2.3.3 Enterobacter 10 2.2.3.4 Azotobacter 11 2.2.3.5 Vi khuẩn cộng sinh Rhizobium 12 2.2.3.6 Vi khuẩn tự Azospirillum 13 2.2.3.7 Vi khuẩn Pseudomonas putida 14 v 2.2.4 Quá trình cố định Nitơ 16 2.2.4.1 Vòng tuần hồn Nitơ tự nhiên 16 2.2.4.2 Cố định nitơ tự nhiên 16 2.2.4.3 Sản xuất nitơ công nghiệp 17 2.2.4.4 Cố định nitơ nhờ vi sinh vật 17 2.2.5 Quá trình tổng hợp phân giải hợp chất chứa nitơ 18 2.2.5.1 Q trình amơn hóa 18 2.2.5.2 Q trình nitrat hóa 19 2.2.5.3 Quá trình phản nitrat 19 2.2.5.4 Quá trình cố định N2 19 2.2.5.5 Vai trò Nitơ thực vật 19 2.2.5.6 Một số nghiên cứu nƣớc 19 2.2.5.7 Một số nghiên cứu nƣớc 19 2.2.5.8 Một số nghiên cứu giới 20 Chƣơng III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 22 3.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 22 3.2.1 Vật liệu 22 3.2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 22 3.3 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23 3.3.1 : Nội dung 1: Phƣơng pháp phân lập làm vi khuẩn nội sinh 23 3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn 23 3.3.1.2 Phân lập chọn lọc 24 3.3.2 Nội dung 2: Quan sát hình thái tế bào nhuộm Gram vi khuẩn 26 3.3.3 Nội dung 3: Khảo sát số đặc tính sinh hóa 27 3.3.4 Nội dung 4: Định danh vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 29 vi 3.3.5 Nội dung 5: Khảo sát trình nhân sinh khối vi khuẩn 30 Chƣơng IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết 31 4.1.1 Kết phân lập làm 31 4.1.2 Kết quan sát hính thái tế bào nhuộm Gram vi khuẩn 33 4.1.3 Kết khảo sát khả phân giải đạm 36 4.1.4 Kết khảo sát đặc tính sinh hóa 35 4.1.5 Kết định danh chủng vi khuẩn phân giải đạm 38 4.1.6 Kết khảo sát trình nhân sinh khối vi khuẩn 40 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP: Adenosine Triphosphate NT: nghiệm thức GLU: Glucose oxidation ONPG: Ortho-Nitrophenol test for beta-galactosidase production UREA: Urea hydrolysis CIT: Citrate Utilization IND: Indole production MALO: Malonate LDC: Lysine decarboxylase viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kí hiệu mẫu lá, thân, rễ mía đất thu thập đƣợc 31 Bảng 4.2 Đặc điểm màu sắc khuẩn lạc 07 chủng vi khuẩn 32 Bảng 4.3 Kết nhuộm Gram quan sát hình thái tế 33 Bảng 4.4 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 36 Bảng 4.5 Mật độ vi khuẩn cố định đạm 38 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Chế phẩm phân bón cho cấy mía Hình 2.2 Khuẩn lạc đặc trƣng chủng Arthrobacter 10 Hình 2.3 Khuẩn lạc đặc trƣng chủng Enterobacter 11 Hình2.4 Khuẩn lạc Azotobacter 12 Hình 2.5 Các dạng khuẩn lạc khác số dòng vi khuẩn Pseudomonas 14 Hình 4.1 Khuẩn lạc chủng vi khuẩn chọn lọc môi trƣờng NFb 32 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram vi khuẩn 33 Hình 4.3 Kết quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 34 Hình 4.4 Hình ảnh chủng vi khuẩn sau 48 ni cấy 35 Hình 4.5 Khuẩn lạc đặc trƣng hình ảnh nhuộm 37 Hình 4.6 Sinh khối vi khuẩn q trình ni cấy 39 ix 4.1.3 Thí nghiệm 3: Kết khảo sát đặc tính sinh hóa Hình 4.4 Hình ảnh chủng vi khuẩn sau 48 nuôi cấy môi trƣờng NFb (A: chủng NR1, B: chủng NR2, C: chủng NT2, D: chủng NS1, E: chủng NT1, F: chủng NT3) Sau tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm gram quan sát trình tăng sinh vi khuẩn nhận thấy chủng NR1, NR2, NT2 NS1 chủng vi chủng vi khuẩn có khả cố định đạm cao nhất, chủng vi khuẩn làm thay đổi màu môi trƣờng rõ rệt, theo (Cao Ngọc Điệp, 2011) vi khuẩn cố định đạm làm thay đổi pH môi trƣờng Môi trƣờng NFb bị đổi từ màu xanh chuyển sang màu xanh dƣơng (hình 4.4) Qua q trình thực tơi nhận thấy chủng vi khuẩn có khả phân giải đạm cao chọn chủng vi khuẩn để thực khảo sát số đặc tính sinh hóa đặc trƣng cho vi khuẩn cố định đạm (Ruqui Sulima cs, 2007) Kết đƣợc trình bày bảng 4.5 35 Bảng 4.4 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Các phản ứng sinh hóa NR1 NR2 NT2 NS1 GLU - - - - ONPG + + + + UREA + + + + CIT + + + + H2 S - - - - IND - - - - MALO + + + + LDC - - - - (-) Âm tính, (+) Dương tính GLU: Glucose oxidation ONPG: Ortho-Nitrophenol test for beta-galactosidase production UREA: Urea hydrolysis CIT: Citrate Utilization H2S: H2S production IND: Indole production MALO: Malonate LDC: Lysine decarboxylase Qua bảng 4.5 cho thấy chủng vi khuẩn cho kết âm tính với phản ứng GLU, H2S, IND LCD dƣơng tính với phản ứng ONPG, UREA, CIT, MALO Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Ruqui Sulima cs (2007) tiến hành thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh mía Stenotrophomonas maltophilia, đồng thời kết phù hợp với nghiên cứu trƣớc Cao Ngọc Điệp cs (2005) vi khuẩn cố định đạm 4.1.4 Thí nghiệm 4: Kết định danh chủng vi khuẩn phân giải đạm Quan sát đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn dựa vào kết nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm nội sinh mía Ruqui Sulima cs (2007), kết hợp với khóa phân loại vi khuẩn Bergey nhận thấy chủng NR1 thuộc chi Stenotrophomonas, NR2 thuộc chi Pseudomonas 36 Sau chúng tơi tiến hành gửi mẫu định danh kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự gen) chủng Công ty Nam Khoa, kết thu đƣợc nhƣ sau: Chủng vi khuẩn ký hiệu NR1 có tên Stenotrophomonas maltophilia Chủng vi khuẩn ký hiệu NR2 có tên Pseudomonas putida Hình 4.5 Khuẩn lạc đặc trƣng hình ảnh nhuộm Gram chủng vi khuẩn Pseudomonas putida Stenotrophomonas maltophilia (A, B: khuẩn lạc đặc trưng hình ảnh nhuộm Gram sau 48 cấy chủng Pseudomonas putida C, D: khuẩn lạc đặc trưng hình ảnh nhuộm Gram sau 48 cấy chủng Stenotrophomonas maltophilia) Đây hai chủng vi khuẩn cố định đạm đƣợc nghiên cứu số đối tƣợng trồng nhƣ rau, lúa, khóm đặc biệt chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh mía đƣợc nghiên cứu ứng dụng Brazil (Reis cs, 2004; Ruqui Sulima cs, 2007) để sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm cho mía 37 4.1.5 Thí nghiệm 5: Kết khảo sát trình nhân sinh khối vi khuẩn mức thời gian khác Sinh khối vi sinh vật có ích nguồn ngun liệu cho việc sản xuất phân vi sinh Xác định đƣợc điều kiện tối ƣu để nhân nhanh sinh khối thành cơng q trình nghiên cứu sản xuất phân vi sinh Trong thí nghiệm này, thực khảo sát nhằm xác định thời gian tối ƣu cho việc nhân sinh khối vi khuẩn chủng Stenotrophomonas maltophilia (NR1) đƣợc phân lập từ mẫu mía tỉnh Tây Ninh Bảng 4.5: Mật độ vi khuẩn cố định đạm Stenotrophomonas maltophilia môi trƣờng NFb mức thời gian khác Thời gian Mật độ tế bào 2,3 X 105 24 2,3 X 107 48 3,6 X 109 72 4,6 X 109 96 X 1010 120 2,6 X 1010 Đơn vị tính (Cfu/ml) Tiến hành ni cấy chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia môi trƣờng NFb lỏng, với mật số ban đầu 105 Cfu/ml Nuôi cấy tủ lắc định ôn với điều kiện: tốc độ lắc 120 vòng/ phút nhiệt độ phòng Sau ngày nuôi cấy tiến hành xác định mật độ vi khuẩn Kết trình nhân sinh khối cho thấy, 48 nuôi cấy mật độ sinh khối vi khuẩn tăng lên nhanh (2,3 X 109Cfu/ml) thời gian khoảng thời gian thuận lợi trình tăng sinh chủng vi khuẩn, nguồn thức ăn, dinh dƣỡng đầy đủ Mật độ vi khuẩn đạt cao thời điểm 120 nuôi cấy (2,6 X 1010 Cfu/ml), tốc độ tăng sinh vi khuẩn có chiều hƣớng chậm lại khoảng thời gian từ 96-120 giờ, nguyên nhân nguồn dinh dƣỡng mơi trƣờng giảm 38 Hình 4.6 Sinh khối vi khuẩn q trình ni cấy A: 24 giờ; B: 48 giờ; C: 72 giờ; D: 120 Các dòng vi khuẩn ni cấy mơi trƣờng NFb có chung tính chất chúng có khả làm thay đổi pH mơi trƣờng kéo theo có đổi màu môi trƣờng NFb (nhận biết nhờ có mặt chất thị màu Bromoethyl Blue) Vi khuẩn sinh trƣởng phát triển nhiều làm thay đổi màu môi trƣờng (chuyển từ xanh nhạt sang xanh dƣơng) (Nguyễn Thị Quỳnh Nhƣ cs, 2013) Hình 4.5 cho thấy màu mơi trƣờng ni cấy tăng sinh vi khuẩn thay đổi mức thời gian 24 đến 120 Ở thời điểm 24 ni cấy, mơi trƣờng có màu xanh nhạt chuyển dần sang màu xanh dƣơng thời điểm 48, 72 120 Điều cho thấy, mật số vi khuẩn tăng dần theo thời gian nuôi cấy Qua kết nghiên thí nghiệm, chúng tơi chọn thời gian ni cấy tối ƣu để nhân sinh khối vi khuẩn cố định đạm Stenotrophomonas maltophilia 120 Từ đó, 39 tiến hành nhân sinh khối để sản xuất phân vi sinh Kết sau 120 nuôi cấy môi trƣờng lỏng NFb, với điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng, ni cấy lắc (120 vòng/phút) thời gian 120 thu đƣợc sinh khối vi khuẩn đạt mật số: 2,6 X 1010, pH dung dịch vi khuẩn 6,8, kết đạt tiêu chuẩn phân bón vi sinh (Theo quy định Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn thông tƣ 36/2010/TT-BNNPTNT ngày 24 tháng 06 năm 2010) phân vi sinh mật độ chủng vi sinh vật có ích khơng thấp X 108 Cfu/ml) 40 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Phân lập làm đƣợc chủng vi khuẩn có khả phát triển môi trƣờng NFb từ 12 mẫu đất, thân, lá, rễ mía từ ruộng trồng mía huyện Trảng Bàng, thị xã Tây Ninh, tỉnh Tây Ninh - Định danh chủng vi khuẩn cố định đạm: + Chủng NR1 có tên Stenotrophomonas maltophilia + Chủng NR2 có tên Pseudomonas putida - Xác định thời gian nhân sinh khối vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia tối ƣu 120 - Nhân sinh khối sản xuất phân vi sinh cố định đạm (gồm vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia) đạt theo quy định Bộ NN&PTNT phân vi sinh (Thông tƣ 36/2010/TT-BNNPTNT ngày 24 tháng 06 năm 2010) 5.2 Đề nghị Từ kết nghiên cứu thu nhận đƣợc chúng tơi nhận thấy cần nghiên cứu thêm số vấn đề sau: - Nghiên cứu khả cố định đạm nội sinh mía chủng NR1 (Stenotrophomonas maltophilia) NR2 (Pseudomonas putida) điều kiện in vitro đồng ruộng - Thực định danh chủng vi khuẩn lại NT2, NS1bằng kỹ thuật sinh học phân tử 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp 2011 Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật NXB Đại học Cần Thơ Cao Anh Đƣơng 2013 Báo cáo tham luận thực trang công tác giống mía lai tạo giống Việt Nam hội nghị Mía đƣờng tồn Quốc năm 2013 Trần Ngọc Hà 2010 Phân lập, chọn lọc nhân sinh khối chủng vi khuẩn cố định đạm Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học Trƣờng ĐH Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Đức Lƣợng 2002 Thí nghiệm vi sinh vật học NXB ĐH Quốc gia Tp HCM Nguyễn Hoài Hƣơng 2009 Thực hành vi sinh vật ứng dụng Trƣờng ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp HCM Nguyễn Thị Ngọc Trúc 2012 Tuyển chọn dòng vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA để làm phân bón cho rau Tiền Giang Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Huỳnh Nhƣ, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa, Thái Trần Phƣơng Minh 2013 Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh có khả tổng hợp IAA cố định đạm chuối Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ Trần Linh Thƣớc 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo Dục Tuyển tập kết nghiên cứu khoa học 1997-2007 Viện Nghiên cứu Mía Đƣờng Tài liệu Tiếng Anh 10 Cavalcante V.A and Dobereiner, J 1988 A new acid tolerant nitrogen fixing bacteriumassociated with sugarcane Plant and Soil 108, 23-31 11 Irene S Mages, 2008 Indentities of Arthrobacter spp And Arthrobacter- like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens 42 12 Yan Wang 2010 Isolation and characterization of Arthrobacter sp HW08 capable of biodegrading swainsonine African Journal of Microbiology Research Tập 4, 16351638 13 Muthukumarasamy R, 2002 Gluconacetobacter diazotrophicus (syn Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics Department of Botany, Sri Pushpam College, Poondi 613 503, India 14 Pedraza, R.O 2008 Recent advances in nitrogen-fixing acetic acid bacteria International Journal of Food Microbiology, 125, 25-35 15 Maheshkumar, K.S., Krishnaraj, P.U and Alagwadi, A.R (1999) Mineral solubilising activity of Acetobacter diazotrophicus, a bacterium associated with sugarcane Current Science, 76, 874-875 16 Ruqui Suliman, Rukhsana Bajwa and Sadaf Zahid 2007 Rhizospheric bacteria of sugar cane from Punjab Mycopath 92007) 5(1): 41-49 Tài liệu Internet 17 http://csdl.thutuchanhchinh.vn/ho_so_vb/bo_nong_nghiep_va_phat_trien_nong_thon/ 18 http://www.vienmiaduong.vn/vi/loaisach.php?Maloai=5 19 http://www.mediafire.com/view/?370k9ajaqmqumqq 20 http://www.mediafire.com/view/?fr8e2frdhj60l2f 43 PHỤ LỤC Thành phần số môi trƣờng Bảng Thành phần môi trƣờng NFb đặc (g/l) (Kirchhof ctv, 1997) Hóa chất Nồng độ Malic acid 5g/l K2HPO4 5g/l MgSO4.7H2O 0,2g/l CaCl2 0,02g/l NaCl 0,1g/l KOH 4,5g/l Fe EDTA (1,64%) 4ml/l Dung dịch nguyên tố vi lƣợng 2ml/l Dung dịch vitamin 1ml/l Bromothymol blue 0,5% KOH 0,2N 2ml/l Agar Môi trƣờng rắn 18g/l pH 5.5 Bảng Thành phần môi trƣờng LGI (Cavalcante Dobereinel, 1988) Hóa chất Nồng độ Sucrose 10 g/l KH2PO4 0.6 g/l MgSO4.7H2O 0.2 g/l MgSO4.7H2O 0.2 g/l CaCl2 0.02 g/l FeCl3 0.01 g/l Na2MoO4.2H2O 0,002 g/l Bromothymol blue 0.5% KOH 0.2N mg/l Agar 18g/l pH 5.5 Bảng Thành phần mơi trƣờng BAz (Extrada, 2011) Hóa chất Nồng độ Acid adelaic g/l KH2PO4 0,4 g/l CaCl2 0,4 g/l MgSO4.7H2O 0,02 g/l FeCl3 0,2 g/l Na2MoO4.2H2O 0,01 g/l Bromothymol blue 0,002 g/l Agar 0,075 g/l pH 5,7 Phƣơng pháp nhuộm vi khuẩn Christian Gram Nguyên tắc: dựa vào khả lƣu giữ phẩm màu Crystal violet thành tế bào vi khuẩn sau rửa cồn Vi khuẩn gram dƣơng có lớp vỏ tế bào dày tạo peptidoglycan, nhờ mà màu tím Crystal violet đƣợc gắn vào tế bào (nhờ iodine) nên khơng bị khử cồn, giữ đƣợc màu thuốc nhuộm ban đầu.Vi khuẩn gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng (do có peptidoglycan hơn), nhƣng lại có nồng độ lipid cao, rửa cồn lớp chất béo bị hòa tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ thuốc nhuộm Fuschin Nhƣ vậy, sau nhuộm vi khuẩn gram âm có màu hồng đỏ, vi khuẩn gram dƣơng có màu tím Các bƣớc thực hiện: nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy môi trƣờng King’ B sau 24 lên lam kính (nếu mật độ vi khuẩn q dày đặc pha lỗng ra) cố định tiêu vi khuẩn lửa đèn cồn Nhuộm mẫu dung dịch Crystal violet phút, rửa lại nƣớc Nhuộm tiếp dung dịch lugol phút, rửa lại nƣớc Nhuộm tiếp mẫu dung dịch Fuschin Ziehl 30 – 60 giây, rửa lại nƣớc Để khô, quan sát bắt màu vi khuẩn dƣới kính hiển vi Cách pha loại thuốc thử thuốc nhuộm  Thuốc nhuộm Crystal violet Dung dịch A: hòa tan 1g Crystal violet 10 ml rƣợu ethylic 96% sau chộn với dung dịch b Dung dịch B gồm: 5g phenol 100 ml nƣớc cất, sau lọc qua giấy lọc, trữ chai tối màu  Thuốc nhuộm Fuchsin Dung dịch A: hòa tan 1g Fuchsin kiềm 10 ml rƣợu ethylic 96% sau chộn với dung dịch b Dung dịch B gồm: 5g phenol 100 ml nƣớc cất, sau lọc qua giấy lọc, trữ chai tối màu  Thuốc thử Methyl red 1% Methyl red 0,1g Ethanol 0,1 ml Bảng Mật độ vi khuẩn cố định đạm Stenotrophomonas maltophilia môi trƣờng NFb mức thời gian khác Thời gian Mật độ tế bào 2,3 X 105 24 2,3 X 107 48 3,6 X 109 72 4,6 X 109 96 X 1010 120 2,6 X 1010 Đơn vị tính (Cfu/ml) 4.Kết thử nghiệm sinh hóa Bảng Đặc điểm sinh hóa chung vi khuẩn cố định đạm Các phản ứng NR1 NR2 NT2 NS1 sinh hóa OXI - - - - GLU - - - - NIT + - + + ONPG + + + + UREA + + + + PAD - _ _ - CIT + + + + ESC + + + + H2S - - - - IND - - - - VP - - + + MLO + + + + LDC + + + + MOB - + + + (-) Âm tính, (+) Dương tính GLU: Glucose oxidation ONPG: Ortho-Nitrophenol test for beta-galactosidase production UREA: Urea hydrolysis CIT: Citrate Utilization H2S: H2S production IND: Indole production MALO: Malonate LDC: Lysine decarboxylase ... tài: Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm bón cho mía 1.2 Yêu cầu đề tài - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật cố định đạm từ mẫu đất, rễ, thân mía thu thập số vùng trồng mía tỉnh... nghiệp mía đƣờng nƣớc ta phát triển, vi c nghiên cứu loại phân bón vi sinh hay chế phẩm sinh học phù hợp cho mía cần thiết Trên sở tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định. .. Nhân sinh khối chủng vi sinh vật có khả cố định đạm tốt nhằm sản xuất phân bón vi sinh 1.3 Nội dung thực - Phân lập làm chủng vi sinh có khả cố định đạm từ mẫu đất, rễ, thân mía số vùng trồng mía