Chọn lọc cây trồng kháng stress bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC MÔN: CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT Đề tài: Chọn lọc trồng kháng stress phương pháp in vitro GVHD: Ths Lưu Thị Thanh Tú SVTH: Nguyễn Thị Ngân Hà 1015091 Trần Thị Mỹ Linh 1015213 Đỗ Thị Nguyệt 1015302 Trương Tuyết Sương 1015383 Lê Thị Tường Vi 1015574 Mục lục Tổng quan I Nguyên nhân khái niệm 1.1 Nguyên nhân 1.2 Các khái niệm Ví dụ tác hại stress thực vật 2.1 Các ví dụ 2.2 Tác hại Phương pháp khắc phục 3.1 Giới thiệu 3.2 Kỹ thuật chọn lọc 10 II Stress vô sinh 11 Stress muối 11 1.1 Phân loại 12 1.2 Phản ứng 12 1.3 Cơ chế chịu mặn 13 1.2 Đặc tính thực vật chịu mặn chọn lọc in vitro 17 Stress nước (hạn) 18 2.1 Khái niệm hạn 18 2.2 Phân loại hạn 18 2.3 Ảnh hưởng hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 19 2.4 Tính chịu hạn 20 2.5 Các hình thức chịu hạn 21 2.6 Biện pháp nâng cao tính chịu hạn 22 2.7 Chọn lọc invitro trồng chịu hạn 23 III Stress hữu sinh 23 Đặc trưng tác nhân gây bệnh 23 1.1 Các nhóm sinh vật gây bệnh 23 1.2 Các tính chất tác động đặc trưng thực vật ký sinh 24 1.3 Cơ chế bảo vệ 24 Chọn lọc in vitro 25 Các cơng trình nghiên cứu chọn lọc kháng stress 25 Đặc tính kháng bệnh q trình lựa chọn lọc in vitro 27 IV Kết luận 29 V Tài liệu tham khảo 30 I Tổng quan Nguyên nhân khái niệm 1.1 Nguyên nhân - Hoạt động người nhiều thập kỷ gần làm tăng đáng kể tác -nhân gây hiệu ứng nhà kính như: nồng độ khí thải từ cơng nghiệp, nông nghiệp, giao thông, gia tăng dân số, phá rừng…, làm trái đất nóng dần lên, từ gây hàng loạt thay đổi bất lợi đảo ngược môi trường tự nhiên - Vấn đề biến đổi khí hậu ngày ảnh hưởng đến nhiều nước giới, đặc biệt Việt Nam nước chịu ảnh hưởng nặng nề bối cảnh biến đổi khí hậu nước biển dâng Nếu khơng có biện pháp đối phó thích ứng với biến đổi khí hậu, Đồng sơng Cửu Long (đóng góp 50% sản lượng lượng thực nước) bị ngập chìm, bị nhiễm mặn diện tích lớn 1.2 Các khái niệm  Stress gì? - Stress yếu tố gây ảnh hưởng bất lợi cho thực vật phản ứng thể thực vật tác nhân gây stress - Dưới điều kiện tự nhiên nhân tạo thực vật không ngừng chịu stress Các tác nhân gây nên stress cho thực vật khơ, hạn, lạnh, nóng, mặn, nhiễm khơng khí Các tác nhân gây stress tạo nên khả thích ứng đặc trưng thực vật  Stress hữu sinh - Stress hữu sinh stress làm tổn thương thực vật sinh vật sống khác gây - Chẳng hạn vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng, côn trùng, cỏ dại, thực vật địa…  Stress vô sinh - Stress vô sinh tác động tiêu cực yếu tố phi sinh vật sinh vật sống mơi trường cụ thể - Ví dụ hạn hán, rét, xâm mặn… Ví dụ tác hại stress thực vật 2.1 Các ví dụ Diện tích nhiễm mặn 4g/l vùng ĐBSCL cho tháng mùa khô, ứng với kịch khác ứng với năm thủy văn 2008 ghi bảng đây: Hiện trạng Tháng DT (ha) 715.095 834.762 909.797 1.147.450 1.002.417 890.236 (%) 18,2 21,2 23,1 29,2 25,5 22,6 Biển 0.50m DT (ha) 1.094.271 1.106.317 1.355.074 2.012.146 2.308.362 1.671.771 dâng Biển 0.70m (%) DT (ha) 27,8 1.195.868 28,1 1.260.592 34,5 1.517.602 51,2 2.188.518 58,7 2.440.536 42,5 1.818.105 dâng Biển 1.00m (%) DT (ha) 30,4 1.223.355 32,1 1.374.932 38,6 1.760.823 55,6 2.473.033 62,1 2.791.582 46,2 2.215.461 dâng (%) 31,1 35,0 44,8 62,9 71,0 56,3  Một số hình ảnh tác hại stress vô sinh hữu sinh Những thân ngô khô héo hạn hán cánh đồng Oakton, Indiana, Trung Tây Mỹ Cỏ dại mọc lên từ lớp đất khô cằn, hồ cạn kiệt nước Ashley, Illinois Vi khuẩn xâm nhập vào qua vết xây xát dụng cụ canh tác côn trùng.Vào cây, vi khuẩn di chuyển phát triển mạch dẫn,tạo thành đám dịch nhầy chứa đầy vi khuẩn làm nghẽn mạch nên nước không chuyển lên làm héo đột ngột - Bệnh vàng lùn (VL) hay bệnh vi rút lúa cỏ vi rút lúa cỏ gây rầy nâu môi giới truyền bệnh Bệnh vàng lùn đầu xuất gây hại nặng vùng đồng sông Cửu Long, sau lan dần tỉnh phía Bắc 2.2 Tác hại 2.2.1 Tác hại xâm mặn - - - - Đất mặn loại đất chứa hàm lượng muối cao (>0.2%) có nhiều ion độc Do nồng độ muối cao nên áp suất thẩm thấu dung dịch đất cao, đạt 200-300 atm hay cao Do đất mặn có áp suất thẩm thấu cao khơng thể hút nước khơng có chế thích nghi, gây nên tượng hạn sinh lý Cây bình thường khơng thể sống mơi trường có áp suất thẩm thấu 40 atm Một tác hại khác đất mặn dung dịch đất chứa nhiều ion độc Một số ion nồng độ thấp không độc nồng độ cao lại gây độc Các ion lại cạnh tranh với chất dinh dưỡng trình hút rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dưỡng Thành phần muối đất mặn phổ biến NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4 muối nồng độ cao gây độc cho Đặc biệt hút ion độc vào tế bào gây rối loạn trao đổi chất tế bào Các ion độc ức chế hoạt động enzim, chất kích thích sinh trưởng làm rối loạn hoạt động trao đổi chất- lượng, hoạt động sinh lý bình thường tế bào Các chất độc ảnh hưởng theo chiều hướng bất lợi đến nguyên sinh chất làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm nguyên sinh chất tăng mạnh làm tăng mạnh ngoại thẩm làm cho tế bào chất dinh dưỡng Các hoạt động sinh lý tế bào bị ảnh hưởng: trình quang hợp giảm mạnh phát triển, sắc tố chất độc ức chế trình tổng hợp sắc tố, trình xảy quang hợp bị giảm sút ảnh hưởng chất độc thiếu nước Q trình hơ hấp tăng mạnh, chất bị phân huỷ mạnh, hiệu lượng thấp, phần lớn lượng trình phân huỷ thải dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động Phân huỷ mạnh, tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lượng vật chất hô hấp phân huỷ, chất dự trữ bị hao hụt, không sinh trưởng được, còi cọc, suất thấp Nếu bị mặn nặng hay mặn kéo dài bị chết 2.2.2 Tác hại hạn hán Hạn hán nguyên nhân quan trọng làm giảm suất trồng Khi hạn hán bị stress nước dẫn đến nhiều hậu nghiêm trọng: - Gây nên tượng co nguyên sinh làm cho bị héo: môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào nước không bào co lại, mô trở nên mềm yếu héo xảy Sự héo tạm thời vĩnh viễn thiếu nước nghiêm trọng kéo dài - Hạn hán cản trở vận chuyển nước mạch gỗ: thiếu nước hạn hán cung cấp nước cho rễ không đủ đêm để thủy hố mơ bị thiếu nước ban ngày, lông hút bị tổn thương lớp vùng vỏ bị phủ suberin làm giảm áp suất rễ để đẩy cột nước lên mạch gỗ Đặc biệt thiếu nước hình thành nhiều bọt khí mạch gỗ phá vỡ tính liên tục cột nước nên cột nước mạch gỗ không đẩy lên liên tục - Hạn hán làm dày lớp cutin bề mặt làm giảm thoát nước qua biểu bì - Hạn hán làm giảm mạnh quang hợp Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp Khi hàm lượng nước khoảng 40-50% quang hợp bị đình trệ - Hạn hán cản trở sinh trưởng Do thiếu nứơc ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý quang hợp, nên làm giảm sinh trưởng, chậm lớn, suất giảm sút 2.2.3 Tác hại vi sinh vật gây bệnh Sâu bệnh nguy gây bệnh làm tổn thất thu hoạch mùa màng lớn Theo thống kê tổ chức lương thực giới hàng năm sâu bệnh làm giảm suất mùa màng đến 20-30% Trong lịch sử sản xuất nông nghiệp xuất trận dịch bệnh trồng vàng lụi, đạo ôn, tiêm lửa làm thiệt hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp Cây bị bệnh thường loại VSV gây nên Cây bị bệnh bị tổn thương lớn nhiều mặt: - VSV gây bệnh làm thay đổi tính chất nguyên sinh chất tế bào chủ theo hướng bất lợi Tính thấm tăng đột ngột tăng ngoại thẩm làm cho tế bào dần chất dinh dưỡng, kiệt quệ chết Độ nhớt nguyên sinh chất giảm mạnh làm tăng trình phân huỷ, giảm trình tổng hợp nguồn nguyên liệu dự trữ cạn kiệt dần Khả giữ nước tế bào giảm, tế bào nước Tăng cường nước mạnh khơng hút kịp nước bù vào nên thiếu nước - VSV phá huỷ cấu trúc mạch dẫn, sợi polysacarit nấm tạo làm tắc nghẽn mạch dẫn, trình vận chuyển chất bị ức chế, không đủ chất dinh dưỡng chất khoáng nên sinh trưởng, phát triển bị ngừng trệ - Các hoạt động sinh lý bị ảnh hưởng nghiêm trọng bị VSV xâm nhiễm Quang hợp bị giảm sút phản ứng pha sáng pha tối bị ức chế Hơ hấp xẩy mạnh hơ hấp vết thương Cơ chất bị phân huỷ mạnh hiệu lượng thấp, phần lớn lượng thải dạng nhiệt làm cho nội nhiệt thể tăng lên cao, bị chết nhiệt độ tăng cao - Q trình hút nước chất khống hệ rễ bị ức chế khơng hút đủ nước chất dinh dưỡng cần thiết nên ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chấtvà lượng Tóm lại tác hại hoạt động VSV xâm nhiễm vào thể thực vật gây chất độc VSV tiết ảnh hưởng sâu sắc đến trình trao đổi chất-năng lượng, họat động sinh lý cây, từ cho sinh trưởng chậm, bị nặng bị chết gây tổn thất lớn cho mùa màng Phương pháp khắc phục 3.1 Giới thiệu Stress hữu sinh vô sinh mối đe dọa lớn nông nghiệp Do đó, nỗ lực để phát triển thực vật kháng stress có tầm quan trọng to lớn để tăng suất trồng Trong năm gần đây, lựa chọn dựa vào nuôi cấy mô ống nghiệm lên cơng cụ có tính khả thi hiệu chi phí cho việc phát triển thực vật kháng stress Chọn lọc ống nghiệm sở mở đầu cho biến thể di truyền tế bào, mô và/hoặc quan nuôi cấy tái sinh thực vật Việc lựa chọn biến thể dòng soma vơ tính xuất thực vật tái sinh di truyền ổn định hữu ích việc cải tiến trồng Đánh giá tập trung vào tiến phát triển kháng stress thông qua lựa chọn nuôi cấy mô ống nghiệm Thực vật phát triển nhiều chế sinh hóa phân tử để tồn điều kiện stress Sản xuất suất số trồng tiếp tục bị ảnh hưởng nhiều stress hữu sinh vô sinh Thiệt hại gây stress lớn làm tổn thất kinh tế toàn cầu Các chương trình nhân giống thơng thường sử dụng để tích hợp gen thuận lợi thơng qua liên quan chi loài vào loại trồng để tạo khả kháng stress Tuy nhiên, phương pháp nhân giống thơng thường thành cơng thất bại việc cung cấp kết mong muốn Do đó, cần triển khai cơng cụ công nghệ sinh học để giải vấn đề cải tiến trồng cho nông nghiệp bền vững Kỹ thuật di truyền phát triển thực vật kháng stress dựa đưa gen khác tham gia vào phản ứng stress vào gen vật chủ giả định có chống chịu stress, chứng minh nhanh theo hướng cải thiện giống trồng Biến đổi gen thể thức sử dụng rộng rải để giới thiệu gen từ gen xa vào nhiều loài thực vật đề kháng stress nổ lực đáng kể thực để sản xuất thực vật kháng stress sử dụng kỹ thuật Tuy nhiên, yếu tố hạn chế phần mở rộng kỹ thuật cho số stress im lặng chuyển gen, giảm hậu biểu gen tần số chuyển đổi thấp Kỹ thuật nuôi cấy mô lên cơng cụ có tính khả thi hiệu chi phí cho việc phát triển thực vật kháng stress, năm gần kỹ thuật hoạt động điều kiện kiểm sốt với giới hạn khơng gian thời gian, có tiềm lựa chọn biến thể kháng stress sử dụng phòng thí nghiệm với chi phí thấp 3.2 Kỹ thuật chọn lọc Nuôi cấy tế bào, mô phận thực vật ống nghiệm môi trường có chứa chất chọn lọc cung cấp để lựa chọn tạo có đặc tính mong muốn Kỹ thuật sử dụng hiệu để tạo kháng stress bao gồm việc sử dụng số chất chọn lọc cho phép tồn ưu tiên tăng trưởng kiểu hình mong muốn Các chất lựa chọn thường sử dụng ống nghiệm bao gồm NaCl (chịu nước mặn), PEG mannitol (C6H14O6, chịu hạn) thuốc đặt trị nấm (CFC) phytotoxin giống fusaric acid có tác nhân gây bệnh (cho khả kháng bệnh) Các mẫu cấy tiếp xúc với loạt chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy Việc nuôi cấy môi trường có khả trì sống chọn lọc Các phương pháp lựa chọn đề xuất: - Chọn lọc lâu dài theo bước Trong nuôi cấy, lựa chọn tiếp xúc với nồng độ stress tăng dần - Chọn lọc sốc Các đối tượng nuôi cấy phải chịu trực tiếp cú sốc nồng độ cao có đối tượng chịu đựng tồn 10 Sự cân dịch K+ trì ngăn ngừa NaCl- cảm ứng K+ thoát khỏi tế bào thông qua việc làm tăng hoạt động H+/ATPase Điều tạo gradient điện tử thiên trình vận chuyển ion.Tăng cường hoạt động bơm proton cung cấp cho màng tế bào Na+ / H+ antiporter với động lực để trục xuất Na+ khỏi tế bào chất vào apoplast làm giảm gánh nặng Na+ cytosolic Cơ chế ngăn chặn ion mức độ sức chịu đựng với nồng độ NaCl tương đối thấp không hoạt động nồng độ muối cao 1.1.3 Sự tích lũy chất hòa tan Một tác hại khác đất mặn dung dịch đất chứa nhiều ion độc Một số ion nồng độ thấp không độc nồng độ cao lại gây độc Các ion lại cạnh tranh với chất dinh dưỡng trình hút rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dưỡng Thành phần muối đất mặn phổ biến NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4 muối nồng độ cao gây độc cho Đặc biệt hút ion độc vào tế bào gây rối loạn Trao đổi chấtcủa tế bào Các ion độc ức chế hoạt động enzim, chất kích thích sinh trưởng làm rối loạn hoạt động trao đổi chất-năng lượng, hoạt động sinh lý bình thường tế bào Các chất độc ảnh hưởng theo chiều hướng bất lợi đến nguyên sinh chất nhưu làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm nguyên sinh chất tăng mạnh tăng mạnh ngoại thẩm làm cho tế bào chất dinh dưỡng Các hoạt động sinh lý tế bào bị ảnh hưởng: trình quang hợp giảm mạnh phát triển, sắc tố chất độc ức chế trình tổng hợp sắc tố, trình xảy quang hợp bị giảm sút ảnh hưởng chất độc thiếu nước Quá trình hô hấp tăng mạnh, chất bị phân huỷ mạnh, hiệu lượng thấp, phần lớn lượng trình phân huỷ thải dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động Phân huỷ mạnh, tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lượng vật chất hô hấp phân huỷ, chất dự trữ bị hao hụt, khơng sinh trưởng được, còi cọc, suất thấp Nếu bị mặn nặng hay mặn kéo dài bị chết Dưới stress muối, thực vật giới hạn hấp thu muối điều chỉnh áp suất thẩm thấu việc tổng hợp chất hòa tan hữu thích hợp Khi chất hữu hòa tan tăng để điều chỉnh áp suất thẩm thấu Những chất hòa tan thường sử dụng: proline, sucrose, polyols, trehalose hợp chất ammonium bậc (QACs: glycine betaine, alaninebetaine , prolinebetaine, choline O-sulfate…) Trong Proline chiếm vai trò ưu bảo vệ khỏi stress thẩm thấu Dưới stress muối, số chức đưa để tích lũy proline mơ bao gồm 16 điều chỉnh thẩm thấu, dự trữ carbon nitrogen cho phát triển sau đề kháng stress, bảo vệ hoạt động quang hợp chức ty thể, nhặt rác gốc tự + Proline: điều chỉnh thẩm thấu, dự trữ carbon nitrogen => dùng cho phát triển sau đề kháng, bảo vệ hoạt động quang hợp chức ty thể, loại bỏ gốc tự Ngoài glycine betain chất nghiên cứu rộng rãi stress nhiệt, hạn: + Glycine betaine: hoạt động chất điều hòa áp suất thẩm thấu, ổn định cấu trúc hoạt động enzyme phức hợp protein, trì tính tồn vẹn tế bào 1.4 Đặc tính thực vật chịu mặn chọn lọc in vitro Khi bị stress muối thực vật thường bị bất ổn sinh lý giảm phát triển tế bào, diện tích lá, sinh khối suất Ở ni cấy ghi nhận phổ biến giảm phát triển Ví dụ: A: ni cấy dịch treo tế bào khoai lang B: tế bào sau tuần ni mơi trường MS có bổ sung NaCl C: mô sẹo môi trường MS không bổ sung NaCl D&E: mơ sẹo phơi hình thành mơi trường bổ sung NaCl F: nuôi môi trường MS không bổ sung Chấn thương thông số sàng lọc khác cho sức chịu đựng độ mặn đo tổn thương màng, tổn thất sớm diệp lục tố thiệt hại với máy quang hợp Tuy nhiên phương pháp phân biệt kiểu gen chịu mặn vừa thấp Một số chế chịu muối chung tồn thực vật như: 17 + Hệ thống bảo vệ kháng oxy hóa liên kết tích cực với sức chống chịu muối thực vật vài nghiên cứu, invitro chọn lọc thực vật chịu mặn có đặc tính việc ước lượng enzym chống oxy hóa chủ yếu SOD, APX, CAT GR + Khi độ mặn NaCl nhiều, hầu hết dạng chung stress muối, tập trung sodium (Na+) thực vật tăng nồng độ potassium (K+) giảm Điều gọi hiệu ứng muối đặc biệt vượt ion độ mặn Những chế bao gồm điều chỉnh thẩm thấu mà thường hồn thành việc tích lũy chất tan phù hợp proline, slycine betaine polyols Stress nước (hạn) 2.1 Khái niệm hạn - Hạn thực vật khái niệm thiếu nước môi trường gây nên suốt trình sống hay giai đoạn, làm ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển Những trồng phát triển bình thường điều kiện khơ hạn gọi “cây chịu hạn” khả giảm thiểu mức độ tổn thương thiếu hụt nước gây gọi “tính chịu hạn” - Dưới tác động yếu tố gây hạn môi trường thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng gây nên tượng thiếu nước cây, mà nguyên nhân cân áp suất thẩm thấu môi trường, dẫn đến thiếu hụt nước tế bào Trong trường hợp này, tác động mơi trường bên ngồi lớn gây ảnh hưởng đáng kể lên phát triển Thông thường, hạn phân biệt thành loại hạn khơng khí, hạn đất hạn tồn diện 2.2 Phân loại hạn 2.2.1 Hạn khơng khí Hạn khơng khí thường có đặc trưng nhiệt độ cao (39 – 42o C) độ ẩm thấp (