nguồn nguyên liệu và phương pháp xử lý nguyên liệu để thu nhận enzyme

• - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm dùng để ăn không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Ng

Trang 1

- Lipase, trypsin, chymotrypsin

- Làm mềm da, khử các vết nứt, sản xuất các chế phẩm dịch tụy y học, thực phẩm…

• 2 DẠ DÀY:

- Pepsin A, B, C, D; gastrisin; celulase; renin

- Công nghệ sản xuất pho mát

• 3 CÁC LOẠI NỘI TẠNG KHÁC:

- Gan, tim lợn để tách aspartat – glutamat aminotransferase

- Huyết tương để tách trombia (protein chống đông máu)

Trang 2

Nguồn thực vật

Trang 3

• Nhược điểm của nguồn động, thực vật

- Chu kỳ sinh trưởng dài

• - Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được

• - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng

làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme

nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân

Nguồn vi sinh vật

dễ tổ chức sản xuất

Trang 4

Glucoamylase

Trang 6

Tổng quan enzyme 11

Các dạng chế phẩm enzyme

• Chế phẩm thô

oChế phẩm thô từ canh trường lỏng

oChế phẩm thô từ canh trường bề mặt

• Chế phẩm kỹ thuật: Là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó

một số protein và enzyme tạp chất đã được tách ra Trong chế phẩm

kỹ thuật thường chứa hỗn hợp một vài enzyme chủ yếu

• Chế phẩm enzyme tinh khiết: trong chế phẩm này đã loại bỏ hoàn

toàn các protein và enzyme tạp, chỉ còn lai duy nhất một enzyme

mong muốn Các chế phẩm này chỉ dùng trong y học, nghiên cứu

khoa học và phân tích

Trang 7

Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

• pH: pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 ± 2)

• Tránh tạo bọt

• Không dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ

• Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, ethanol để kết tủa

enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp

• Cần phải làm thí nghiệm nhanh (mẫu càng mới hoạt tính cao)

Trang 8

• Giữ nhiệt độ và pH của các thành phần tham gia phản ứng ổn

định trong khi thực hiện phản ứng

• Sử dụng pipette đúng cách để lấy lượng enzyme thật chính xác

• Tránh đánh rơi nguồn enzyme tạp vào mẫu

• Cần bảo quản chế phẩm enzyme ở nhiệt độ thấp hoặc sấy

hơn

Thu nhận enzyme ngoại bào

• Ly tâm lạnh: Ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm

ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa

• Lọc: Lọc ép (thể tích nhỏ), lọc chân không, lọc theo dòng chảy

cắt ngang

Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 16

Trang 9

Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào

VK gram (+) Vk gram (-) Nấm Thực vật Động vật

peptidoglycan, teichoic acid và polysaccharide

2 lớp gồm peptidoglycan và lớp

lipopolysaccharide (hai khoang chu chất)

glucan, mannan, và chitin

cellulose và các polysaccharide

Không có

protein

phospholipid và protein

phospholipid

và lipoprotein

phospholipid và protein

phospholipid và cholesterol, protein

Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào

• Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lý

• Phá vỡ tế bào bằng phương pháp hóa học

Trang 10

Phương pháp nghiền với bột thủy tinh hoặc thép

• Khi huyền phù tế bào được lắc cùng với hạt

bằng thủy tinh hoặc bằng thép nhỏ (đường

kính khoảng 0,2 – 1,0 mm) thì tế bào sẽ bị

phá vỡ do lực cắt của chất lỏng cao và do

va chạm với các hạt này

• Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme tùy

thuộc vào vận tốc lắc, kích cỡ của hạt và

đường kính của thiết bị

• Nhược điểm của phương pháp là làm tăng

nhiệt và mức tiêu thụ năng lượng, vì vật cần

phải thiết kế các thiết bị làm lạnh thích hợp

Trang 11

Sự phá vỡ tế bào là quá trình ngẫu nhiên nên khó để mô tả Để

có thể mô tả, có thể dùng phương trình sau:

𝐶

1𝜃C: nồng độ của enzyme được giải phóng (kg/m3)

Hằng số thời gian 𝜃 phụ thuộc vào điều kiện phá vỡ, thiết bị và

đặc điểm của tế bào

Ví dụ một mẻ tế bào nấm men được phá vỡ dùng phương pháp siêu âm , nồng độ của

enzyme được đo theo thời gian như sau:

3.49

𝐶𝑚𝑎𝑥= 1 − exp −60𝜃

4.56

𝐶𝑚𝑎𝑥= 1 − exp −120𝜃

Giải hệ hai phương trình trên, thu được C max=5 mg/ml, 𝜃=50 giây

Vì vậy, khi t=240 giây ta có

𝐶

5= 1 − exp −

240 50

Suy ra, C = 4.96 mg/ml

Trang 12

• Dịch sau khi phá vỡ được đây ra ngoài do quá trình

ly tâm cũng như tốc độ phá vỡ cao tạo ra do không

một pittong đã được kết nối với bộ phận ép

Dịch huyền phù tế bào được đặt giữa pittong

và ống trụ tròn

Ống trụ tròn có một lỗ kết nối với vòi được

gắn trên đĩa, tại đây dịch được ép với vận tốc

lớn ra ngoài qua vòi phun

Thể tích của thiết bị từ vài ml đến vài trăm ml

Áp suất hoạt động 10000 đến 50000 psig

Trang 13

Siêu âm

Nguyên tắc:

• Sóng siêu âm tạo nên hiện tượng sủi bong bóng khi tần số âm thanh đủ

lớn để tạo nên vô số các vi bọt tại các vùng tập trung sinh khối trong

chất lỏng

• Các bọt sẽ lớn lên trong pha giãn và xẹp đi trong pha nén của sóng âm

thanh Việc xẹp bóng bọt sẽ chuyển năng lượng âm thanh thành năng

lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng

ngàn atm (300 MPa)

• Năng lượng này sẽ có tác dụng phá vỡ tế bào Ngoài ra, các vi dòng có

các gradient vận tốc lớn cũng tăng khả năng phá vỡ tế bào

Siêu âm

• Quá trình phát sóng siêu âm có thể liên tục hoặc không

liên tục

• Tần số phổ biến sử dụng là 25 kHz

• Sự phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm phụ thuộc vào loại

tế bào, thể tích mẫu và nồng độ tế bào

• Đối với tế bào vi khuẩn như E coli, sử dụng 30-60 giây

cho thể tích mẫu nhỏ Đối với nấm men 2-10 phút

• Ưu: đơn giản, phổ biến, hữu ích ở quy mô nhỏ Nhược:

sinh nhiệt gây biến tính enzyme

Trang 14

chất tẩy rửa phá vỡ cấu trúc của màng tế bào bằng cách hòa tan

phospholipid

• Các hóa chất này được sử dụng chủ yếu để phá vỡ tế bào

động vật

• Đối với vk, sử dụng chất tẩy rửa kết hợp với lysozyme

• Đối với tế bào nấm mốc, thành tế bào phải được làm yếu trước

khi sử dụng chất tẩy rửa

Trang 15

Chất tẩy rửa

• Có thể phân chất tẩy rửa làm 3 loại: cationic, anionic (natri

laurysulfat) và non-ionic

Chất tẩy rửa non-ionic (Triton – X hay Tween series) được ưa chuộng vì chúng ít gây

tổn thương đến protein và DNA

Triton x – 100 sử dụng riêng rẽ hoặc cùng với các chất khác như guanidine – HCl được

dùng để trích ly các enzyme liên kết màng rất có hiệu quả

• Hạn chế: một lượng lớn protein bị biến tính hay kết tủa cần

được loại bỏ ra khỏi sản phẩm

Dung môi hữu cơ

• Nguyên tắc: hoạt động chủ yếu lên màng tế bào bằng cách hòa

tan phospholipid và biến tính các protein gắn trên đó

• Một vài loại dung môi như toluene có thể phá vỡ thành tế bào

• Hạn chế (tương tự với chất tẩy rửa): cần loại ra từ sản phẩm và

gây biến tính protein So với chất tẩy rửa, dung môi dễ bay hơi

nên dễ được loại bỏ hơn

Trang 16

Xử lý kiềm

• Nguyên tắc: Xử lý kiềm ở pH giữa 11,5 và 12,5 sẽ làm thủy

phân màng tế bào và do đó sẽ giải phóng enzyme

• Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho các enzyme bền trong

môi trường kiềm ít nhất trong khoảng 20 – 30 phút Người ta

thường dùng phương pháp này để trích ly asparaginase từ

bào đột ngột từ môi trường đẳng trương (isotonic) sang môi trường

nươc (nhược trương – hypotonic) khiến nước tràn nhanh vào tế

bào, kết quả làm thể tích tế bào bị phồng to và sau đó bị vỡ

• Phương pháp này dùng chủ yếu cho tế bào động vật có vú Với tế

bào vi khuẩn và nấm , thành tế bào cần được làm yếu trước khi bị

phá vỡ bằng phương pháp sốc thẩm thấu

• Phương pháp này được sử dụng để loại bỏ các chất ở khoang chu

chất (chủ yếu là protein) từ tế bào mà không cần sử dụng phương

pháp phá vỡ vật lý

Trang 17

Lysozyme

• Nguyên tắc: Lysozyme thường thủy phân lên kết β – (1,4) – glucosid

của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn Gram

dương và Gram âm Lysozyme thường được liên kết với EDTA để

tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysaccarit và phá hủy

tế bào

• Phá vỡ thành tế bào chủ yếu là vi khuẩn Gram dương

• Sử dụng một mình lysozyme không thể phá vỡ được tế bào vì nó

không phân giải được màng plasma  kết hợp giữa lysozyme và

một chất tẩy rửa thường hay được sử dụng (tác dụng lên cả thành

và màng tb)

Lysozyme

• Lysozyme có trong nước bọt, lòng trắng trứng

• Lysozyme từ lòng trắng trứng là enzyme dung giải duy nhất có

thể sử dụng ở quy mô thương mại

• Hạn chế:

• chỉ áp dụng được ở quy mô nhỏ do các điều kiện thao tác kinh tế và

giá thành lysozyme cao, đồng thời cần loại lysozyme ra khỏi sản phẩm,

hiện diện của các enzyme khác như protease trong mẫu

Trang 18

Phương pháp cô đặc

- Làm tăng hoạt tính enzyme trong một khối dung dịch enzyme

- Làm giảm chi phí và công sức và chi phí cho việc xử lý sau này

Trang 19

Kết tủa

Có 2 loại kết tủa: kết tủa âm và kết tủa dương

- Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần

thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa

- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần

thiết lại nằm trong phần tủa, còn protein tạp nằm trong phần

dung dịch

Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4

Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4

• Nguyên tắc:

mỗi protein có một khoảng nồng độ muối mà tại đó protein enzyme sẽ bị kết tủa hoàn

toàn (khoảng nồng độ muối tích)

• Cách tiến hành:

Thêm vào dịch có chứa enzyme một lượng thể tích muối trung tính bão hòa hoặc

một lượng muối trung tính dạng rắn để có một độ phần trăm bão hòa nào đó của muối này

• Có thể dùng: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4

(NH4)2SO4 là tốt nhất vì an toàn, rẻ và phổ biến

Trang 20

Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4

• Ưu điểm: đơn giản, dễ thu nhận chế phẩm enzyme

• Nhược điểm: cần loại bỏ muối (thẩm tích, sắc ký lọc gel)

Kết tủa dùng dung môi hữu cơ

• Nguyên tắc: giảm hằng số điện môi của dung dịch làm tăng lực hút tĩnh

điện giữa các phân tử protein làm cho các phân tử protein liên hợp tạo

thành kết tủa

• Mỗi enzyme được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau

• Ưu điểm: không cần loại muối, và m ột số dung môi có thể chưng cất và thu hồi lại được

• Nhược điểm: dễ làm vô hoạt enzyme,  tiến hành nhanh ở nhiệt độ thấp; chế phẩm có màu

• Phương pháp này thường được sử dụng cho các enzyme ít bị biến tính

bởi dung môi hữu cơ, và ít được dùng ở quy mô lớn, do chi phí cao, dễ

gây cháy nổ

Trang 21

Kết tủa đẳng điện

• Một protein enzyme thường kết tủa ở điểm đẳng điện (pI) vì ở

pI các phân tử enzyme có tổng điện tích bằng 0 (không có lực

đẩy tĩnh điện), nên các phân tử enzyme sẽ kết hợp với nhau

tạo ra kết tủa

• Có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các

enzyme và protein tạp khác Tiến hành lọc và li tâm để thu

hoặc loại bỏ các kết tủa

Trang 22

Tinh sạch enzyme

• Mục tiêu của quá trình tinh sạch

• Đặc điểm của enzyme và nguồn tạp

• Xây dựng phương pháp

Xác định mục tiêu

Lựa chọn phương pháp phù hợp đảm bảo thu nhận lượng

enzyme tinh sạch lớn với hoạt tính cao, đảm bảo tính kinh tế (chi

phí thấp, thời gian ngắn)

 Xác định mức độ tinh khiết cần đạt được của sản phẩm

Xác định nguồn tạp nhiễm quan trọng

Xác định bản chất của các nguồn tạp nhiễm còn lại ngay khi có thể

Nguồn tạp nhiễm ảnh hưởng đến protein đích cần được loại bỏ đầu tiên (protease)

Mức độ tinh sạch càng cao càng tốt

Trang 23

Xác định đặc điểm của enzyme đích và nguồn tạp nhiễm

Mục đích: để lựa chọn phương pháp tinh sạch phù hợp và tránh làm

bất hoạt enzyme trong suốt quá trình tinh sạch

Trang 24

Sắc ký lọc gel

• Nguyên tắc: phân đoạn một số hỗn

hợp protein theo khối lượng phân tử

của chúng

• Pha tĩnh là các hạt gel chứa đầy

trong cột (trơ, bền với các yếu tố về

cơ học cũng như sinh học không có

tính đàn hồi và ưa nước)

Trang 25

Sắc ký trao đổi ion

• Nguyên tắc: dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các

protein enzyme

- Nhựa trao đổi ion cationit

- Nhựa trao đổi ion anionit

Sắc ký trao đổi ion

Quá trình phân tách trên cột gồm 2 giai đoạn:

a) Hấp phụ thuận nghịch protein – enzyme cần tinh sạch vào

nhựa trao đổi ion

b) Khử hấp phụ các protein đã hấp phụ bằng cách:

- Thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi ion hóa, do

đó thay đổi điện tích tổng của protein

- Tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh Các

protein enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị

đẩy ra ngoài trước tiên và ngược lại

Trang 26

Sắc ký ái lực

Nguyên tắc: dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch

của một enzyme với một phân tử khác (phối tử), đã được gắn

bằng liên kết cộng hóa trị vào một chất mang không hòa tan

chứa trong cột

chỉ có enzyme quan tâm bị giữ lại

Tiếp đó, enzyme sẽ được rửa giải bằng các phương pháp khác

nhau

Sắc ký ái lực

• Kháng thể gắn kháng nguyên

• Niken- His tag

• GST tag (Glutathione-S-tranferase) ái lực cao với Glutathione

Trang 27

Sắc ký ái lực- chất mang

• hoàn toàn không hòa tan trong pha động

• có độ bền về hóa học và sinh học

• có độ cứng cơ học, có tính háo nước, tính thấm

• không có các tương tác đặc hiệu

• có chứa các nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa

trong điều kiện nhẹ nhàng

 polyacrylamide, polystyrên, cross-linked dextran, agarose

Trang 28

Rửa giải enzyme

Dung dịch đệm rửa giải thường phải:

• Có chứa một phối tử (tự do) của enzyme có khả năng cạnh

tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với enzyme Phối tử

cạnh tranh sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích

• Dùng pH để gây biến tính thuận nghịch enzyme do đó làm biến

dạng tâm hoạt động của enzyme

Trang 29

Chiến dịch tinh sạch 3 pha

Phát triển phương pháp phân tích

Mục tiêu: theo dõi tiến độ tinh sạch, đánh giá hiệu quả trong từng

bước (hoạt tính sinh học, hiệu suất thu hồi), từ đó tối ưu hóa quá

trình tinh sạch

• Loại và lượng dung môi

• Lượng mẫu nạp vào (capacity)

• Độ phân giải (resolution)

• Phân đoạn nào chứa enzyme

Trang 30

Trang 31

Purification of GST-Blo t19 protein by using a

Glutathione-Sepharose 4B FF column and analyzed on an

SDS-polyacrylamide gel

Lanes M: standards (kDa) 1: flow-through sample 2: cell lysate supernatant 3: eluted protein fractions

Thrombin cleavage of soluble GST-Blo t19 fusion protein (A)

and Blo t19 purification by FPLC (B)

Định dạng
Số trang	32
Dung lượng	1,09 MB