nguồn nguyên liệu và phương pháp xử lý nguyên liệu để thu nhận enzyme

2/20/2019 Chương 2: Nguồn nguyên liệu quy trình chung sản xuất chế phẩm enzyme Nguồn động vật • TỤY TẠNG: - Lipase, trypsin, chymotrypsin - Làm mềm da, khử vết nứt, sản xuất chế phẩm dịch tụy y học, thực phẩm… • DẠ DÀY: - Pepsin A, B, C, D; gastrisin; celulase; renin - Công nghệ sản xuất mát • CÁC LOẠI NỘI TẠNG KHÁC: - Gan, tim lợn để tách aspartat – glutamat aminotransferase - Huyết tương để tách trombia (protein chống đông máu) Tổng quan enzyme 2/20/2019 Nguồn thực vật Tổng quan enzyme Tổng quan enzyme 2/20/2019 • • • Nhược điểm nguồn động, thực vật Chu kỳ sinh trưởng dài - Nguồn nguyên liệu không cải tạo - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn nhu cầu kinh tế quốc dân Tổng quan enzyme Nguồn vi sinh vật  Tốc độ sinh sản VSV mạnh  Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính cao  Hệ enzyme VSV phong phú  VSV thích hợp cho sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp  Giá thành tương đối thấp môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất Tổng quan enzyme 2/20/2019 Vi khuẩn Baccilus E coli Tổng quan enzyme Nấm sợi α -amylase Glucoamylase Aminoaclylase Pectinase Catalase Lipase Aspergillus Lactase Protease Tổng quan enzyme 2/20/2019 Nấm men Candida Saccaromyces Tổng quan enzyme Kluyveromyces Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme • Sinh tổng hợp enzyme • Thu nhận enzyme: phá vỡ tế bào, tách enzyme, đặc enzyme • Tinh enzyme • Hình thành cơng thức chế phẩm enzyme Tổng quan enzyme 10 2/20/2019 Tổng quan enzyme 11 Các dạng chế phẩm enzyme • Chế phẩm thơ o Chế phẩm thô từ canh trường lỏng o Chế phẩm thơ từ canh trường bề mặt • Chế phẩm kỹ thuật: Là chế phẩm tinh chế sơ bộ, số protein enzyme tạp chất tách Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa hỗn hợp vài enzyme chủ yếu • Chế phẩm enzyme tinh khiết: chế phẩm loại bỏ hồn tồn protein enzyme tạp, lai enzyme mong muốn Các chế phẩm dùng y học, nghiên cứu khoa học phân tích Tổng quan enzyme 12 2/20/2019 Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme • pH: pH trung tính gần trung tính (pH = ± 2) • Nhiệt độ: cần tiến hành nhiệt độ thấp (00C đến 50C) Tổng quan enzyme 13 Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme • Tránh tạo bọt • Khơng dùng dụng cụ dao kéo dụng cụ xay han rỉ • Khi dùng dung môi hữu aceton, ethanol để kết tủa enzyme cần tiến hành nhiệt độ thấp • Cần phải làm thí nghiệm nhanh (mẫu hoạt tính cao) Tổng quan enzyme 14 2/20/2019 Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme • Giữ nhiệt độ pH thành phần tham gia phản ứng ổn định thực phản ứng • Sử dụng pipette cách để lấy lượng enzyme thật xác • Tránh đánh rơi nguồn enzyme tạp vào mẫu • Cần bảo quản chế phẩm enzyme nhiệt độ thấp sấy chân không đông khô để bảo quản thời gian lâu Tổng quan enzyme 15 Thu nhận enzyme ngoại bào • Ly tâm lạnh: Ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa • Lọc: Lọc ép (thể tích nhỏ), lọc chân khơng, lọc theo dòng chảy cắt ngang Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 16 2/20/2019 Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào VK gram (+) Vk gram (-) Nấm Thực vật Động vật Thành TB lớp gồm peptidoglycan, teichoic acid polysaccharide lớp gồm peptidoglycan lớp lipopolysaccharide (hai khoang chu chất) glucan, mannan, chitin cellulose polysaccharide Khơng có Màng TB phospholipid protein phospholipid protein phospholipid lipoprotein phospholipid protein phospholipid cholesterol, protein Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 17 Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào • Phá vỡ tế bào phương pháp vật lý • Phá vỡ tế bào phương pháp hóa học Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 18 2/20/2019 Các phương pháp vật lý • Phương pháp nghiền khuấy với bột thủy tinh thép • Phá vỡ rotor-stator mill • French press • Sóng siêu âm Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 19 Phương pháp nghiền với bột thủy tinh thép • Khi huyền phù tế bào lắc với hạt thủy tinh thép nhỏ (đường kính khoảng 0,2 – 1,0 mm) tế bào bị phá vỡ lực cắt chất lỏng cao va chạm với hạt • Tỷ lệ hiệu suất giải phóng enzyme tùy thuộc vào vận tốc lắc, kích cỡ hạt đường kính thiết bị • Nhược điểm phương pháp làm tăng nhiệt mức tiêu thụ lượng, vật cần phải thiết kế thiết bị làm lạnh thích hợp Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 20 10 2/20/2019 Phương pháp cô đặc - Làm tăng hoạt tính enzyme khối dung dịch enzyme Làm giảm chi phí cơng sức chi phí cho việc xử lý sau Tăng khả bảo quản enzyme Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản Tăng hiệu suất tác động enzyme chất Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 35 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 36 Phương pháp cô đặc • Kết tủa • Biến tính chọn lọc • Siêu lọc 18 2/20/2019 Kết tủa Có loại kết tủa: kết tủa âm kết tủa dương - Kết tủa âm kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm dung dịch không nằm phần tủa - Kết tủa dương hồn tồn ngược lại, protein cần thiết lại nằm phần tủa, protein tạp nằm phần dung dịch Kết tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 37 Kết tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 • Nguyên tắc: protein có khoảng nồng độ muối mà protein enzyme bị kết tủa hồn tồn (khoảng nồng độ muối tích) • Cách tiến hành: Thêm vào dịch có chứa enzyme lượng thể tích muối trung tính bão hòa lượng muối trung tính dạng rắn để có độ phần trăm bão hòa muối • Có thể dùng: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 (NH4)2SO4 tốt an toàn, rẻ phổ biến Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 38 19 2/20/2019 Kết tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 • Ưu điểm: đơn giản, dễ thu nhận chế phẩm enzyme • Nhược điểm: cần loại bỏ muối (thẩm tích, sắc ký lọc gel) Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 39 Kết tủa dùng dung mơi hữu • Ngun tắc: giảm số điện môi dung dịch làm tăng lực hút tĩnh điện phân tử protein làm cho phân tử protein liên hợp tạo thành kết tủa • Mỗi enzyme kết tủa nồng độ dung môi hữu khác • Ưu điểm: khơng cần loại muối, số dung mơi chưng cất thu hồi lại • Nhược điểm: dễ làm vơ hoạt enzyme,  tiến hành nhanh nhiệt độ thấp; chế phẩm có màu • Phương pháp thường sử dụng cho enzyme bị biến tính dung mơi hữu cơ, dùng quy mơ lớn, chi phí cao, dễ gây cháy nổ Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 40 20 2/20/2019 Kết tủa đẳng điện • Một protein enzyme thường kết tủa điểm đẳng điện (pI) pI phân tử enzyme có tổng điện tích (khơng có lực đẩy tĩnh điện), nên phân tử enzyme kết hợp với tạo kết tủa • Có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm enzyme protein tạp khác Tiến hành lọc li tâm để thu loại bỏ kết tủa Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 41 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 42 21 2/20/2019 Tinh enzyme • Mục tiêu trình tinh • Đặc điểm enzyme nguồn tạp • Xây dựng phương pháp Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 43 Xác định mục tiêu Lựa chọn phương pháp phù hợp đảm bảo thu nhận lượng enzyme tinh lớn với hoạt tính cao, đảm bảo tính kinh tế (chi phí thấp, thời gian ngắn)  Xác định mức độ tinh khiết cần đạt sản phẩm  Xác định nguồn tạp nhiễm quan trọng  Xác định chất nguồn tạp nhiễm lại  Nguồn tạp nhiễm ảnh hưởng đến protein đích cần loại bỏ (protease)  Mức độ tinh cao tốt Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 44 22 2/20/2019 Xác định đặc điểm enzyme đích nguồn tạp nhiễm Mục đích: để lựa chọn phương pháp tinh phù hợp tránh làm bất hoạt enzyme suốt q trình tinh  Kích thước  pI  Tính kỵ nước  Độ hòa tan  Độ bền pH  Độ bền nhiệt  Ion Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 45 46 23 2/20/2019 Sắc ký lọc gel • Nguyên tắc: phân đoạn số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử chúng • Pha tĩnh hạt gel chứa đầy cột (trơ, bền với yếu tố học sinh học khơng có tính đàn hồi ưa nước)  sephadex, polyacrylamide Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 47 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 48 Sắc ký lọc gel 24 2/20/2019 Sắc ký trao đổi ion • Nguyên tắc: dựa vào khác điện tích tổng số protein enzyme - Nhựa trao đổi ion cationit - Nhựa trao đổi ion anionit Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 49 Sắc ký trao đổi ion Quá trình phân tách cột gồm giai đoạn: a) Hấp phụ thuận nghịch protein – enzyme cần tinh vào nhựa trao đổi ion b) Khử hấp phụ protein hấp phụ cách: - Thay đổi pH dịch rửa dẫn đến thay đổi ion hóa, thay đổi điện tích tổng protein - Tăng lực ion tăng nồng độ ion đối cạnh tranh Các protein enzyme có lực với nhựa trao đổi ion yếu bị đẩy trước tiên ngược lại Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 50 25 2/20/2019 Sắc ký lực Nguyên tắc: dựa vào khả liên kết đặc hiệu thuận nghịch enzyme với phân tử khác (phối tử), gắn liên kết cộng hóa trị vào chất mang khơng hòa tan chứa cột Khi cho hỗn hợp protein chứa enzyme cần phân tách qua có enzyme quan tâm bị giữ lại Tiếp đó, enzyme rửa giải phương pháp khác Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 51 Sắc ký lực • Kháng thể gắn kháng nguyên • Niken- His tag • GST tag (Glutathione-S-tranferase) lực cao với Glutathione Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 52 26 2/20/2019 Sắc ký lực- chất mang • hồn tồn khơng hòa tan pha động • có độ bền hóa học sinh học • có độ cứng học, có tính háo nước, tính thấm • khơng có tương tác đặc hiệu • có chứa nhóm chức có khả biến đổi hoạt hóa điều kiện nhẹ nhàng  polyacrylamide, polystyrên, cross-linked dextran, agarose Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 53 Sắc ký lực • Phối tử: • chất tương tự chất enzyme muốn làm • đặc hiệu với enzyme, phải có lực trung bình với enzyme • có nồng độ phù hợp khơng gây ngữ khơng gian đáng kể • Cánh tay đòn: • để phối tử tiếp cận dễ dàng với tâm hoạt động enzyme • cấu tạo từ hydrocacbon nhị chức có chiều dài từ – cacbon Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 54 27 2/20/2019 Rửa giải enzyme Dung dịch đệm rửa giải thường phải: • Có chứa phối tử (tự do) enzyme có khả cạnh tranh với phối tử trạng thái liên kết với enzyme Phối tử cạnh tranh sau loại bỏ phương pháp thẩm tích • Dùng pH để gây biến tính thuận nghịch enzyme làm biến dạng tâm hoạt động enzyme Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 55 SK lực • Ưu: đơn giản, hiệu cao, tinh thời gian ngắn • Nhược: giá thành đắt Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 56 28 2/20/2019 Chiến dịch tinh pha Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 57 Phát triển phương pháp phân tích Mục tiêu: theo dõi tiến độ tinh sạch, đánh giá hiệu bước (hoạt tính sinh học, hiệu suất thu hồi), từ tối ưu hóa q trình tinh • Loại lượng dung mơi • Lượng mẫu nạp vào (capacity) • Độ phân giải (resolution) • Phân đoạn chứa enzyme Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 58 29 2/20/2019 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 59 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 60 30 2/20/2019 Purification of GST-Blo t19 protein by using a GlutathioneSepharose 4B FF column and analyzed on an SDSpolyacrylamide gel Lanes M: standards (kDa) 1: flow-through sample 2: cell lysate supernatant 3: eluted protein fractions Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 61 Thrombin cleavage of soluble GST-Blo t19 fusion protein (A) and Blo t19 purification by FPLC (B) Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 62 31 2/20/2019 Tạo sản phẩm enzyme Chế phẩm enzyme tạo thành loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù, enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ • Enzyme dạng dung dịch hay huyền phù có nhược điểm khó bảo quản Do đó, người ta phải đưa chúng vào dung dịch bảo quản giữ nhiệt độ thấp ổn định • Enzyme dạng bột khô dạng viên nhỏ: thường dễ bảo quản khả bảo quản lâu Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 63 32 ... nạp vào (capacity) • Độ phân giải (resolution) • Phân đoạn chứa enzyme Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 58 29 2/20/2019 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 59 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu. .. protein Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 17 Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào • Phá vỡ tế bào phương pháp vật lý • Phá vỡ tế bào phương pháp hóa học Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu. .. xử lý sau Tăng khả bảo quản enzyme Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản Tăng hiệu suất tác động enzyme chất Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 35 Nguồn nguyên liệu xử lý nguyên liệu 36 Phương pháp