tổng quan về enzyme

1/21/2019 CƠNG NGHỆ ENZYME (2 tín chỉ) TS Nguyễn Hồng Minh Bộ mơn CNSH-K.Hóa-ĐHBK nhminh@dut.udn.vn 0961544787 Tổng quan enzyme 1/21/2019 Ứng dụng enzyme • Y học: • Nattokinase tan huyết khối • Protease: sx mt ni vsv sinh kháng sinh, thuốc hỗ trợ tiêu hóa • Urease định lượng ure • Glucose oxidase xác định glucose nước tiểu Tổng quan enzyme Ứng dụng-hóa học • Dùng enzyme cố định để tổng hợp hợp chất mong muốn (glutathion, acid béo, alcaloid, hormone…) • Xử lý nước thải, sản xuất cồn, amino acid • Làm thuốc thử hóa phân tích Tổng quan enzyme 1/21/2019 Ứng dụng cơng nghiệp • Protease: làm mềm thịt • Rennin- phomat • Pectinase: nước trái cây, rượu vang, mứt… • Cellulase: tăng giá trị nguyên liệu (agar, đại mạch), phế liệu nơng nghiệp • Amylase: bánh mì, glucose, rượu, bia Tổng quan enzyme 1/21/2019 ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT Chương 1: TỔNG QUAN ENZYME • • • • • • • • • • • • • Định nghĩa enzyme Lịch sử Cách gọi tên cách phân loại Bản chất hóa học enzyme Cấu trúc Sinh tổng hợp đặc điểm enzyme Đặc hiệu enzyme Cơ chế xúc tác enzyme: Động học phản ứng enzyme Phương thức thực nghiệm xác định tham số động học Nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme: Phương pháp khảo sát phát nhóm chức TTHĐ enzyme Các dạng phân tử enzyme ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME • • • • Động vật Thực vật Vi sinh vật Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme 1/21/2019 ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT Chương 3: SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM ENZYME TỪ VSV • • • • • Ngun lý điều hòa q trình sinh tổng hợp enzyme Phân lập, tuyển chọn cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt lực cao Phương pháp bảo quản giống VSV Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme Tách tinh chế enzyme từ VSV ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT Chương 4: ENZYME CỐ ĐỊNH • • • • • • • • Giới thiệu chung Chất mang Enzyme Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme cố định Một số liên kết việc cố định enzyme Ảnh hưởng cố định đến hoạt tính enzyme Các reactor chứa enzyme cố định Sử dụng enzyme cố định y học công nghiệp 1/21/2019 ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT Chương 5: NHỮNG XU HƢỚNG MỚI TRONG CƠNG NGHỆ ENZYME • Sàng lọc enzyme • Cơng nghệ protein Tài liệu tham khảo • Trevor Palmer Understanding enzymes Ellis Horwood.1991 • Bryan Cooper Enzymes in Industry: Production and Applications Wiley 2007 • Đặng Thị Thu Cơng nghệ enzym NXB KH&KT.2004 • Nguyễn Đức Lượng Cơng nghệ enzym NXB ĐHQG TP HCM.2004 Tổng quan enzyme 12 1/21/2019 Đánh giá học phần • Chuyên cần: 10% • Bài tập nhà: 10% • Seminar: 10% • Giữa kỳ: 20% • Cuối kỳ: 50% Tổng quan enzyme 13 Yêu cầu seminar Mỗi nhóm (5-6 sv) chọn Bài Báo Khoa Học liên quan đến enzyme (lớp trưởng nộp danh sách tên báo trước làm để tránh trùng lặp) • Tiểu luận (50%) : Tổng quan enzyme (5-10 trang) Trình bày tất thơng tin liên quan đến enzyme quan tâm • Slide (20%) : phần (đặt vấn đề, mục tiêu nghiên cứu, quy trình nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận) bày logic Yêu cầu phần đặt vấn đề, làm bật phần ứng dụng bật enzyme Hình ảnh rõ ràng, chữ trình • Thuyết trình (10% - 10 phút), trả lời câu hỏi (10% - 10 phút) Mỗi nhóm cử bạn nhóm trưởng Mỗi nhóm bốc thăm thứ tự để làm MC cho nhóm khác Nơp mềm cứng tiểu luận slide tuần trước báo cáo Thời gian báo cáo: sau học xong chương Tổng quan enzyme 14 1/21/2019 Yêu cầu seminar Ý tưởng liên quan đến enzyme Nhóm tự lên ý tưởng thiết kế quy trình cơng nghệ u cầu tính mới, sáng tạo, kinh tế • Tiểu luận (50%) : Tổng quan enzyme (5-10 trang) Trình bày tất thơng tin liên quan đến enzyme quan tâm • Poster (20%): trình bày ý tưởng nhóm 10 phút • Thuyết trình (15% - 10 phút), trả lời câu hỏi (15% - 10 phút) Tổng quan enzyme 15 Chƣơng TỔNG QUAN ENZYME • Được tạo nào? • Cấu trúc? • Chức enzyme tự nhiên? • Điểm bật enzyme? • Động học enzyme? 1/21/2019 Định nghĩa • Enzyme chất xúc tác sinh học Chúng tạo tế bào sống • Chúng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học xảy tế bào sống, khơng bị phá hủy hay biến sau phản ứng • Các chất tham gia phản ứng xúc tác enzyme gọi chất Tổng quan enzyme 17 Ưu điểm enzyme • Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn, có tính đặc hiệu cao, tác dụng điều kiện êm dịu, có ý nghĩa cao y học thực phẩm tính an tồn sinh học • Tạo sản phẩm chất lượng cao, lẫn sản phẩm phụ, dễ tinh • Enzyme khơng độc có khả bị phân giải (thân thiện với mơi trường) • Có thể tạo dựa vào tổng hợp vsv Tổng quan enzyme 18 1/21/2019 Tổng quan enzyme 19 Tổng quan enzyme 20 10 1/21/2019 𝒌𝒄𝒂𝒕 Hằng số 𝒌𝒄𝒂𝒕 (turnover number), đại diện cho số phân tử chất cực đại chuyển đổi thành sản phẩm phân tử enzyme đơn vị thời gian E bão hòa với S tính theo cơng thức 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸0 ] Tương ứng với tốc độ phá vỡ phức ES để hình thành sản phẩm, giá trị kcat cao nghĩa tốc độ phá vỡ phức nhỏ 𝑘𝑐𝑎𝑡 cho hầu hết enzyme nằm khoảng 1-104 Tổng quan enzyme 87 Tổng quan enzyme 88 44 1/21/2019 Hằng số đặc hiệu KA= 𝒌𝒄𝒂𝒕 𝑲𝒎 gọi số đặc hiệu  đo lường tính đặc hiệu enzyme Tổng quan enzyme 89 Tổng quan enzyme 90 Pyranose Oxydase • Nguồn: nấm phân hủy lignocellulose • Ứng dụng: sx đường fructose, tagatose, sx biofuel 45 1/21/2019 Cách xác định số động học • Xác định vận tốc đầu dãy nồng độ chất • Dựng đồ thị v [S], thu phương trình MichaelisMenten • Có thể xác định hai giá trị Km Vmax Từ suy kcat Tổng quan enzyme 91 Phương thức thực nghiệm xác định tham số động học 𝐾𝑚 1 = × + 𝜗0 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆0 ] 𝑉𝑚𝑎𝑥 • Sự ngoại suy xuyên qua trục 𝜗0 để xác định giá trị − chạm phải lề giấy trước thu giá trị 1 𝐾𝑚 [𝑆0 ] • Đường tuyến tính chưa rõ ràng • Kết đơi khơng xác Tổng quan enzyme 92 46 1/21/2019 Phương pháp đồ thị Hanes • Ưu: kiện phân phối • Nhược: Khơng có tách biệt biến số ([S] xuất hai trục đồ thị) Tổng quan enzyme 93 Phương pháp đồ thị Eisenthal Cornih-Bowden • Ưu: sai số khơng biến đổi nhiều đồ thị Lineweaver-Burk • Nhược: Khơng có tách biệt biến số (v xuất hai trục đồ thị) Tổng quan enzyme 94 47 1/21/2019 Nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme • Nồng độ enzyme • Nồng độ chất • Nhiệt độ • Thời gian • pH • Chất ức chế hoạt hóa Tổng quan enzyme 95 Ảnh hưởng [E] [S] • Nồng độ enzyme: tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ enzyme điều kiện phản ứng khơng đổi chất bão hòa • Nồng độ chất: tốc độ phản ứng tăng nồng độ chất tăng phản ứng đạt đến vận tốc cực đại Tổng quan enzyme 96 48 1/21/2019 Ảnh hưởng nhiệt độ • thấpbất hoạt • Toopt : mức nhiệt độ mà enzyme đạt hoạt tính cao (~37-40oC) • T > toopt  biến tính Tổng quan enzyme 97 Ảnh hưởng pH • pH: enzyme có giá trị pHopt enzyme đạt hoạt tính tối đa • Ví dụ, pHopt pepsin, pancreatic lipase, salivary amylase 1,5-2 (acidic); 7.5-8 (alkaline); 6.8 (slight acidic) • Khi pH thay đổi  làm giảm tốc độ hoạt động enzyme Tổng quan enzyme 98 49 1/21/2019 Ảnh hưởng pH • Chymotrypsin • Histidine 57-proton hóa • Mất chức xúc tác Tổng quan enzyme 99 Ảnh hưởng thời gian • Ban đầu, tốc độ phản ứng tăng • Sau tốc độ phản ứng giảm do: (1) giảm nồng độ chất; (2) tích lũy sản phẩm cuối; (3) thay đổi pH phản ứng, tạo giá trị pH khác biệt với giá trị pH tối thích enzyme thời điểm ban đầu Tổng quan enzyme 100 50 1/21/2019 Ảnh hưởng chất khác • Nồng độ coenzyme: Đối với enzyme có coenzyme, tăng nồng độ coenzyme làm tăng tốc độ phản ứng hoạt động enzyme • Nồng độ chất hoạt hóa ion kim loại: Sự tăng nồng độ chất hoạt hóa ion kim loại làm tăng tốc độ hoạt động enzyem Nhiều enzyme kích hoạt ion kim loại ion cloride kích hoạt salivary amylase, ion Ca2+ kích hoạt thrombokinase • Sự diện chất kìm hãm làm giảm hoạt tính enzyme Tổng quan enzyme 101 Sự kìm hãm • Các chất kìm hãm chất làm giảm tốc độ phản ứng xúc tác enzyme • Chất kìm hãm thuận nghịch (reversible inhibitor) gắn vào enzyme theo phương thức thuận nghịch loại bỏ thẩm tích để tái tạo hoạt tính enzyme hồn tồn Kìm hãm cạnh tranh, phi cạnh tranh, khơng cạnh tranh, hỗn hợp • Chất kìm hãm khơng thuận nghịch (irreversible inhibitor) không bị loại bỏ khỏi phân tử enzyme thẩm tích (do sản phẩm phản ứng chất thừa) Tổng quan enzyme 102 51 1/21/2019 Chất kìm hãm cạnh tranh • I có cấu trúc tương tự với S, cạnh tranh vị trí gắn phân tử E • Ví dụ, malonate (𝐶𝑂2− 𝐶𝐻2 𝐶𝑂2− ) succinate fumarate Tổng quan enzyme 103 Chất kìm hãm cạnh tranh • 𝐾𝑚 tăng • 𝑉𝑚𝑎𝑥 khơng thay đổi Tổng quan enzyme 104 52 1/21/2019 Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitor) • I gắn lên phức ES mà không gắn lên E tự Tổng quan enzyme 105 Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitor) • 𝐾𝑚 giảm • 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm Tổng quan enzyme 106 53 1/21/2019 Chất kìm hãm khơng cạnh tranh (non-competitive inhibitor) • I kết hợp với S (tự tạo phức với chất) tạo phức điểm chết (dead-end complex) Tổng quan enzyme 107 Chất kìm hãm khơng cạnh tranh (non-competitive inhibitor) • 𝐾𝑚 khơng thay đổi • 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm Tổng quan enzyme 108 54 1/21/2019 Chất kìm hãm hỗn hợp • I khơng liên kết với E tự mà liên kết với phức ES tạo thành phức ESI không tạo thành P Tổng quan enzyme 109 Tổng quan enzyme 110 Chất kìm hãm hỗn hợp • Km tăng • 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm 55 1/21/2019 Ảnh hưởng kiểu kìm hãm đến Km Vmax Tổng quan enzyme 111 Kìm hãm bất thuận nghịch Tổng quan enzyme 112 56 1/21/2019 Đơn vị đo hoạt độ Đơn vị IU (đơn vị quốc tế) : lượng enzyme có khả xúc tác chuyển hóa micromol chất sau thời gian phút điều kiện tiêu chuẩn • 1IU = μM chất (10-6 M / phút) Đơn vị katal (kat): lượng enzyme có khả xúc tác mol chất sau thời gian giây điều kiện tiêu chuẩn • kat = Mol chất / giây 1IU = 1/60 x 10-6 kat = 16,67 nkat Đơn vị đo hoạt độ Hoạt độ riêng : biểu diễn số đơn vị hoạt độ enzyme đơn vị khối lượng protein • IU kat / mg (ml) protein Hoạt độ phân tử (hoạt độ riêng phân tử) : biểu diễn số phân tử chất chuyển hóa phân tử enzyme sau đơn vị thời gian (thường phút) • • Hoạt độ tâm xúc tác: số phân tử chất bị chuyển hóa trung tâm hoạt động sau phút 57 1/21/2019 Tổng kết • Enzyme – chất xúc tác sinh học- tăng vận tốc phản ứng cách giảm lượng hoạt hóa • Có tính đặc hiệu cao, hiệu xúc tác lớn • Trung tâm hoạt động chứa vị trí gắn vị trí xúc tác • Cơ chế xúc tác: làm giảm lượng hoạt hóa  tăng vận tốc phản ứng • Mơ hình Michaelis-Menten mơ hình đơn giản mơ tả phụ thuộc tốc độ phản ứng nồng độ chất Tổng quan enzyme 115 58 ... aldolase Tổng quan enzyme 42 21 1/21/2019 Tổng quan enzyme 43 Tổng quan enzyme 44 Cấu trúc dị lập thể 22 1/21/2019 Đặc điểm enzyme • Đặc điểm hóa học • Đặc điểm acid-base • Độ hòa tan Tổng quan enzyme. .. vitamin Tổng quan enzyme 33 Ví dụ cofactor enzyme catalase • Có cofactor gắn chặt (heme) • Xúc tác chuyển đổi H2O2 thành H2O O2 Tổng quan enzyme 34 17 1/21/2019 Tổng quan enzyme 35 Cấu trúc enzyme Enzyme... phẩm phụ, dễ tinh • Enzyme khơng độc có khả bị phân giải (thân thiện với mơi trường) • Có thể tạo dựa vào tổng hợp vsv Tổng quan enzyme 18 1/21/2019 Tổng quan enzyme 19 Tổng quan enzyme 20 10 1/21/2019