Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG Trichoderma VỚI NẤM GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ TRÊN CÂY RAU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Hữu Nhượng Sinh viên thực : Lê Thị Mỹ Dung MSSV: 1051110198 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Luận văn tốt nghiệp em thực hướng dẫn khoa học TS.Phạm Hữu Nhượng KS Ngơ Thùy Trâm phòng Cơng Nghệ Vi Sinh, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM Em xin cam đoan nội dung tài liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Em xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Lê Thị Mỹ Dung LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa đồ án tốt nghiệp ngồi nổ lực thân, em hỗ trợ từ nhiều người, em chân thành gửi lời “CẢM ƠN” tới: Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tồn thể thầy trường Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, q thầy khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu làm móng để em thực khóa thực tập tốt nghiệp làm tốt công việc sau Em xin cảm ơn thầy TS Phạm Hữu Nhượng tận tình quan tâm, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Hai người dẫn, dạy bảo, quan tâm giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn KS Ngô Thùy Trâm hướng dẫn, bảo, giúp đem tìm hiểu tài liệu cần thiết thao tác kỹ thuật thực thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa đồ án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc tới anh chị, cán Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM cung cấp hóa chất, thiết bị cần thiết, dẫn giúp đỡ,tạo điều kiện cho em hồn thành khóa đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể bạn bè, người thân, gia đình người bên cạnh em, cổ vũ tinh thần ủng hộ em suốt thời gian qua Vì thời gian có hạn hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm thực tiễn, đồ án nhiều thiếu sót Rất mong đóng góp phê bình q thầy cho đồ án em hoàn thiện tốt Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Lê Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh lở cổ rễ gây hại rau 1.2 Tình hình bệnh lở cổ rễ nước 1.2.1 Tình hình bệnh lở cổ rễ rau ngồi nước 1.2.2 Tình hình bệnh lở cổ rễ rau nước 1.3 Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại trồng 1.3.1 Nấm Rhizoctonia sp 1.3.1.1 Đặc điểm sinh học nấm Rhizoctonia sp 1.3.1.2 Sự phân bố gây hại 1.3.1.3 Ký chủ 1.3.2 Nấm Phomopsis sp 1.3.2.1 Đặc điểm sinh học nấm Phomopsis sp 1.3.2.2 Sự phân bố gây hại 10 1.3.2.3 Ký chủ 10 1.3.3 Nấm Fusarium sp .11 1.3.3.1 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium sp 11 1.3.3.2 Sự phân bố gây hại 11 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.4 Ký chủ nấm Fusarium sp .12 1.4 Biện pháp phòng trừ 12 1.4.1 Biện pháp canh tác 13 1.4.1.1 Làm đất .13 1.4.1.2 Luân canh 13 1.4.1.3 Xen canh 13 1.4.1.4 Sử dụng giống kháng 14 1.4.2 Biện pháp hoá học 14 1.4.3 Biện pháp sinh học 14 1.4.4 Sử dụng nấm đối kháng .15 1.5 Tổng quan nấm Trichoderma 15 1.5.1 Đặc điểm nấm Trichoderma 15 1.5.2 Đặc điểm hình thái (Gary J Samuels, 2004) 16 1.5.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học 17 1.5.4 Nguồn gốc 18 1.5.5 Một số loài Trichoderma thường gặp vùng nhiệt đới 18 1.5.5.1 Trichoderma pseudokoningii Rifai 18 1.5.5.2 Trichoderma atroviride Bissett 18 1.5.5.3 Trichoderma hamatum Bain .18 1.5.5.4 Trichoderma inhamatum Veerkamp & W Gams .19 1.5.5.5 Trichoderma harzianum Rifai 19 1.5.5.6 Trichoderma koningii Ouden 19 1.5.6 Các chế kiểm soát sinh học Trichoderma spp 19 1.6 Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 24 1.6.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cải thiện suất trồng 24 1.6.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 27 1.6.3 Trong lĩnh vực khác 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Điều kiện nghiên cứu 29 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2 Dụng cụ, thiết bị 29 2.2.1 Các dụng cụ cần thiết phòng thí nghiệm .29 2.3 Mơi trường hóa chất dùng để nuôi cấy phân lập nấm 29 2.3.1 Môi trường WA (Water Agar) 29 2.3.2 Môi trường PDA ( Potato D-Glucose agar) 30 2.4 Vật liệu nghiên cứu .30 2.4.1 Nấm đối kháng 30 2.4.2 Nấm gây bệnh 30 2.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Phân lập nấm gây bệnh 30 2.5.2 Quan sát hình thái phương pháp phòng ẩm 32 2.5.3 Bảo quản 33 2.6 Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch 33 2.7 Định danh chủng nấm tuyển chọn sinh học phân tử dựa vào vùng trình tự bảo tồn ITS 34 2.8 Đánh giá tính đối kháng nấm Trichoderma spp loài nấm bệnh gây lở cổ rễ đĩa petri 37 2.9 Phương pháp xử lí số liệu 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ rau 39 3.1.1 Chủng nấm 39 3.1.2 Chủng nấm 40 3.1.3 Chủng nấm 41 3.2 Lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch .42 3.3 Định danh sinh học phân tử mẫu nấm gây bệnh 45 3.4 Các dòng nấm Trichoderma dùng ni cấy đối kháng .48 3.5 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma sp với chủng nấm bệnh đĩa petri 51 Đồ án tốt nghiệp 3.5.1 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma sp với chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani đĩa petri .51 3.5.2 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh Phomopsis vexan đĩa petri 63 3.5.3 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh Fusarium solani đĩa petri 74 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 88 4.1 Kết luận 88 4.2 Kiến nghị .88 TÀI LIỆU THAM KHẢO .89 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ctv : Cộng tác viên ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleotide Acid - mã di truyền Fu : Fusarium ITS : Internal Trancribed Spacer - vùng dịch mã nhân PCR : Polymerase chain reaction - phản ứng khuyếch đại PDA : Potato D-Glucose Agar Phomo :Phomopsis Rhiz : Rhizoctonia solani STT : Số thứ tự T : Trichoderma TAE : Tris Acetic EDTA Tp HCM : Thành phố Hồ Chí Minh VSV : Vi sinh vật WA : Water agar WTO :World Trade Organization Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích, suất, sản lượng rau vụ hè thu 2013 Tp.HCM (Chi cục bảo vệ thực vật TP.HCM) Bảng 3.1: Phần trăm ức chế phát triển hệ sợi nấm Rhizoctonia sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi cấy đối kháng 55 Bảng 3.2 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 55 Bảng 3.3 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc .57 Bảng 3.4 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 59 Bảng 3.5 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 61 Bảng 3.6: Phần trăm ức chế phát triển hệ sợi nấm Phomopsis vexan sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi cấy đối kháng .67 Bảng 3.7: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 67 Bảng 3.8: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 69 Bảng 3.9 : Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc .71 Bảng 3.10: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 72 Bảng 3.11: Phần trăm ức chế phát triển hệ sợi nấm bệnh Fusarium sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi cấy đối kháng 78 Bảng 3.12: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 78 Bảng 3.13: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 80 Bảng 3.14: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 82 Bảng 3.15: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau ngày cấy đối kháng lúc 84 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Tỷ lệ hạt nảy mầm / tổng số hạt gieo 43 Đồ thị 3.2: Tỷ lệ bị nhiễm bệnh 44 vii NSC Analysis of Variance for C.PIGM - Type III Sums of Squares So Su Df ur m ce of M AI A: 30 C 65 R 56 16 ES 56 T 31 23 O 22 T M F P ea - n R V 43 12 0.0 00 53 Table of Least Squares Means for C.PIGM with 95.0 Percent Confidence Intervals St nd C M Er ou ea ro 24 73 98 Le ve G R C C B1 62 .42 08 B1 61 03 08 B4 87 .91 08 B5 89 .26 08 C 87 D0 24 08 C 70 D0 48 08 T3 67 .11 08 T 66 N1 37 08 Lo U we pp Li Li mi mi 60 64 .12 72 58 63 .73 33 85 90 .61 21 86 91 .95 56 84 89 .94 54 68 72 .18 78 64 69 .81 41 64 68 .07 67 Multiple Range Tests for C.PIGM by C.CHUNG Method: 95.0 percent LSD C Co LS C un M H t ea B1 61 B1 62 T 66 N1 T3 67 C 70 D0 C 87 D0 B4 87 B5 89 LS Si g 08 08 08 08 08 08 08 08 H o m X X X X X X X X 9NSC Analysis of Variance for D.PIGM - Type III Sums of Squares So Su Df ur m ce of M AI A: 23 D 80 R 43 16 ES 37 T 24 23 O 23 T 58 M F P ea - n R V 34 12 0.0 00 71 Table of Least Squares Means for D.PIGM with 95.0 Percent Confidence Intervals St nd Le C M Er ve ou ea ro Lo U we pp Li Li mi mi G 24 77 R 03 D C B1 66 .87 95 B1 65 63 95 B4 89 .32 95 B5 90 .5 95 C 88 D0 72 95 C 73 D0 98 95 T3 70 .98 95 T 70 N1 30 95 64 68 .85 88 63 67 .61 64 87 91 .30 33 88 92 .48 51 86 90 .70 73 71 75 .96 99 68 72 .96 99 68 72 .28 31 Multiple Range Tests for D.PIGM by D.CHUNG Method: 95.0 percent LSD D Co LS LS C un M Si H t ea g B1 65 63 95 B1 66 .87 95 T 70 N1 30 95 T3 70 .98 95 C 73 D0 98 95 C 88 D0 72 95 B4 89 .32 95 B5 90 .5 95 H o m X X X X X X X X Đánh giá khả đối kháng chủng Trichoderma sp với nấm bệnhFusarium solani Phụ lục 6: Phần trăm ức chế (PIGM) phát triển nấm bệnh Fusarium solanisau ngày, ngày, ngày, ngày cấy đối kháng 3NSC Analysis of Variance for E.PIGM - Type III Sums of Squares So Su ur m ce of M AI A: 41 E R 18 ES T 59 O T 41 Df M F P ea - n R V 59 0.0 11 21 03 16 11 35 23 Table of Least Squares Means for E.PIGM with 95.0 Percent Confidence Intervals St Lo U Le Co M nd Er we Li pp Li ve G un 24 ea 11 ro mi mi R 50 E C B1 13 17 B1 23 94 10 35 11 2B4 55 14 94 42 10 67 18 B5 85 20 94 C 08 10 94 .72 15 97 24 .95 20 15 D0 C D0 T3 75 48 .88 94 61 94 00 10 73 12 T 51 10 94 38 63 14 N1 36 94 23 48 Multiple Range Tests for E.PIGM by E.CHUNG Method: 95.0 percent LSD E C C ou H nt C D0 B1 T3 T N1 C D0 B1 B4 B5 LS LS M Si ea g 61 94 55 94 51 94 10 .36 94 10 .88 94 13 .23 94 14 .85 94 20 .08 94 H o m X X X X X X X X X X X X X 5NSC ANOVA Table for D.PIGM by D.CHUNG So Su Df ur m ce of B 22 e t 31 W 70 16 i 54 t To 29 23 tal M F- Pea Ra Va n tio lu 32 0.0 75 43 00 97 40 92 Table of Means for D.PIGM by D.CHUNG with 95.0 percent LSD intervals S t n D Co M (p Lo U C un ea oo we pp B1 38 .06 21 B1 34 31 21 B4 35 .82 21 B5 43 .26 21 C 35 D0 21 C 32 D0 82 21 T3 34 .31 21 T 34 N1 32 21 To 24 36 tal 00 li mi 36 39 .24 88 32 36 .49 12 34 37 .00 64 41 45 .44 08 33 36 .28 91 31 34 .00 64 32 36 .49 13 32 36 .50 14 Multiple Range Tests for D.PIGM by D.CHUNG Method: 95.0 percent LSD D C C ou H nt C D0 B1 T3 T N1 C D0 B4 B1 B5 M H ea o n m 32 X 82 34 X 31 34 X 31 34 X 32 35 X X 35 X 82 X 38 X 06 43 X 26 7NSC Analysis of Variance for C.PIGM - Type III Sums of Squares SD u uf m M A A 17 : R 16 E T 23 O T M F P e- aR V 00 Table of Least Squares Means for C.PIGM with 95.0 Percent Confidence Intervals St nd Co M Er un ea ro 24 52 09 Le ve G R C C B1 53 .63 89 B1 50 82 89 B4 51 .95 89 B5 57 .53 89 C 51 D0 41 89 C 49 D0 71 89 T3 50 .83 89 T 50 N1 84 89 Lo U we pp Li Li mi mi 51 55 .73 52 48 52 .93 71 50 53 .06 84 55 59 .63 42 49 53 .51 30 47 51 .82 60 48 52 .93 72 48 52 .94 73 Multiple Range Tests for C.PIGM by C.CHUNG Method: 95.0 percent LSD C Co L LS C un S Si H t g C 49 D0 71 89 B1 50 82 89 T3 50 .83 89 T 50 N1 84 89 C 51 D0 41 89 B4 51 95 89 B1 53 .63 89 B5 57 .53 89 H o m X X X X X X X X X X 9NSC Analysis of Variance for A.PIGM - Type III Sums of Squares SD u uf m M A A 57 : R 16 E T 23 O T M F P e- aR V 4 00 Table of Least Squares Means for A.PIGM with 95.0 Percent Confidence Intervals S t Lev Co M E un e r L U o p L L i i G 61 R A B 59 74 C3 C3 D 59 76 76 76 76 76 76 76 76 60 57 58 73 58 56 57 57 6 6 6 Multiple Range Tests for A.PIGM by A.CHUNG Method: 95.0 percent LSD A Co L L H C un S S o H t m C 58 0.7 X D0 52 66 B1 59 0.7 X 43 66 T3 59 0.7 X 44 66 T 59 0.7 X N1 44 66 C 59 0.7 X D0 91 66 X B4 60 0.7 X 36 66 X B1 61 0.7 X 75 66 B5 74 0.7 X 65 66 ... lượng sống người Trên sở đề tài: Đánh giá khả đối kháng số chủng Trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ rau tiến hành, với mong muốn tìm chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng tốt với nấm gây. .. quan bệnh lở cổ rễ gây hại rau 1.2 Tình hình bệnh lở cổ rễ nước 1.2.1 Tình hình bệnh lở cổ rễ rau nước 1.2.2 Tình hình bệnh lở cổ rễ rau nước 1.3 Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại... cổ rễ - Đánh giá khả đối kháng nấm Trichoderma spp nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ môi trường PDA - Đánh giá khả đối kháng nấm Trichoderma spp nấm Phomopsis vexan gây bệnh lở cổ rễ môi