Định danh và khảo sát sự sinh trưởng hệ sợ của nấm linh chi đen

MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Tình hình nghiên cứu: 1.3 Mục đích nghiên cứu: .4 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu: 1.5 Phương pháp nghiên cứu: .4 1.6 Các kết đạt đề tài: .5 1.7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp: CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 2.1 Nấm Linh chi 2.1.1 Khái quát chung [1, 2, 8, 10] 2.1.2 Vị trí phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Linh chi đen 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) .7 2.1.3.2 Các giai đoạn phát triển sợi nấm [3, 13] 2.1.4 Điều kiện sống nấm linh chi .10 2.1.4.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sinh trưởng hệ sợi nấm 10 2.1.4.2 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến sinh trưởng hệ sợi nấm 11 i 2.1.5 Các nghiên cứu nấm linh chi đen: .13 2.2 Nguyên liệu trồng nấm 14 2.3 Định danh phương pháp sinh học phân tử .16 2.3.1 Tổng quan phương pháp ly trích DNA 16 2.3.1.1 Nguyên tắc 16 2.3.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật mơi trường tự nhiên 16 2.3.2 Kỹ thuật PCR ứng dụng q trình phát lồi 18 2.3.2.1 Kỹ thuật PCR .18 2.3.2.2 Gen rDNA 18 2.3.2.3 Ứng dụng PCR trình phát loài vi sinh vật 20 2.3.3 Điện di 21 2.3.3.1 Nguyên tắc 21 2.3.3.2 Các loại gel công dụng loại .22 2.3.4 Xây dựng phát sinh loài 22 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu .24 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 24 3.1.2 Thiết bị dụng cụ tiến hành 24 3.1.3 Hóa chất: 24 3.2 Nội dung phương pháp bố trí thí nghiệm .26 3.2.1 Sử dụng phương pháp phòng ẩm để định danh hình thái: 26 3.2.2 Sử dụng sinh học phân tử để định danh: .27 ii 3.2.2.1 Tách chiết DNA: 27 3.2.2.2 Chạy phản ứng PCR: 27 3.2.3 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen môi trường thạch nhiệt độ khác nhau: 29 3.2.4 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen pH khác nhau: 29 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ carbon khác lên sinh trưởng nấm Linh chi đen: .29 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitrogen khác lên sinh trưởng nấm Linh chi đen: .30 3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh trưởng nấm Linh chi đen: 30 3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh trưởng nấm Linh chi đen: 31 3.2.9 Khảo sát sinh trưởng sợ nấm Linh chi đen môi trường nuôi cấy tổng hợp khác nhau: 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết quan sát hình thái học nấm sợi: .32 4.1.1 Kết quan sát khuẩn lạc: 32 4.1.2 Kết quan sát sợi nấm 33 4.2 Kết li trích, thu nhận nhân đoạn gen ITS rDNA nấm Linh chi đen 34 4.2.1 Kết ly trích thu nhận gen nấm Linh chi đen: 34 4.2.2 Kết nhân đoạn gen bảo tồn ITS rDNA .34 4.3 Kết so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA nấm Linh chi đen ngân hàng gen NCBI thiết lập phân loài: 35 4.3.1 Kết Giải trình tự vùng gen ITS rDNA mẫu nấm LC1: .35 4.4 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen điều kiện nhiệt độ khác nhau: 36 4.5 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen điều kiện pH khác nhau: 37 4.6 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ carbon khác lên phát triển sợi nấm Linh chi đen: .39 4.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitrogen khác lên phát triển sợi nấm Linh chi đen: .40 4.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen: .41 4.9 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh trưởng sợi nấm Linh chi đen: .42 4.10 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen nuôi loại môi trường khác nhau: 44 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận: 46 5.2 Đề nghị: 47 CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT o C ��m micromet bp base pairs : ANOVA : : : Degree Celsius : Analysis Of Variation ATP Adenosin Triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Tool CTAB : Cetyl – Trimetyl – Amoniumbromide DNA : Deoxyribonucleotide Acid EDTA : Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid ITS : Internal Transcribed Spacer PCR : Polymerase chain reation P:C:I : Phenol : Chloroform : Isoamyl alchol PDA : Potato Dextrose Agar SDS : Sodium dodecyl sulfate RNA : Ribonucleic acid rDNA : Ribosomal Deoxyribonucleotide Acid TAE : Tris – Acetic – EDTA UV : Ultra violet vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho phát triển nấm Linh chi 11 Bảng 2.2 Nồng độ số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng 13 Bảng 2.3 Hàm lượng chất có mùn cưa 14 Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng cám .15 Bảng 2.5 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) .19 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Thể tự nhiên Amauroderma subresinosum .8 Hình 2.2 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum Hình 2.3 Chu trình phát triển nấm Linh chi Hình 2.4 Bảng đồ primer ITS 20 Hình 4.1 Khuẩn lạc mẫu nấm LC1 32 Hình 4.2 Hình thái sợi nấm quan sát tiêu cự X40/0.65 .33 Hình 4.3 Hình thái sợi nấm quan sát tiêu cự X100/1.25 33 Hình 4.4 Kết ly trích gen mẫu nấm Linh chi đen 34 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR vùng ITS .35 Hình 4.6 Kết dựng phát sinh loài .36 Hình 4.7 Biểu đồ thể sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi đen nhiệt độ khác 37 Hình 4.8 Biểu đồ thể ảnh hưởng pH đến sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi đen 38 Hình 4.9 Kết sau ngày ni cấy hệ sợi nấm linh chi đen pH khác 38 Hình 4.10 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ carbon đến sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi đen 39 Hình 4.11 Kết sau ngày nuôi cấy hệ sợi nấm linh chi đen nồng độ carbon khác 40 Hình 4.12 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ nitrogen lên sinh trưởng nấm linh chi đen .40 Hình 4.13 Kết sau ngày nuôi cấy hệ sợi nấm linh chi đen nồng độ nitrogen khác 41 Hình 4.14 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi đen 42 Hình 4.15 Kết sau ni cấy nấm linh chi đen môi trường với nguồn carbon khác 42 Hình 4.16 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn nitrogen đến sinh trưởng nấm linh chi đen .43 Hình 4.17 Kết sau ni cấy hệ sợi nấm linh chi đen môi trường với nguồn nitrogen khác 44 Hình 4.18 Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi chủng nấm linh chi đen nuôi loại môi trường khác .44 Hình 4.19 So sánh sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi đen nuôi loại môi trường khác 45 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Từ xưa đến nay, nhu cầu chữa trị bệnh để khắc phục bệnh tật, bảo toàn mạng sống trước ngưỡng cửa chết kéo dài tuổi thọ điều thiết yếu lồi người, họ khơng ngừng cố gắng tìm cách để đạt điều Từ kinh nghiệm lưu truyền dân gian, loài người sử dụng nhiều loại thuốc, từ dạng sơ chế đến tinh chế, đặc, trích xuất từ loại thảo dược có sẵn tự nhiên để điều trị bệnh Ngày xu hướng sử dụng thảo dược thiên nhiên để trị bệnh trở nên phổ biến, việc tìm kiếm khả chữa trị từ loại thảo dược tiến hành nhiều nơi giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong đó, nấm Linh chi đối tượng nghiên cứu nhiều quốc gia, đặc biệt nước vùng Châu Á, có nhiều tiềm nguồn dược liệu Ở Trung Quốc, nấm Linh chi nghiên cứu nhiều sử dụng thảo dược quý để trị bệnh có tác dụng bổ dưỡng, điều hồ huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ,…Tác dụng Linh chi khẳng định xếp vào hàng “thượng dược” trị bách bệnh Những nghiên cứu gần cho thấy Linh chi có khả giải độc chì, điều hòa huyết áp, làm giảm hàm lượng cholesterol máu….[11, 14] Nấm Linh chi đen loại nấm quý, biết đến với tên gọi Hắc chi, sáu loại nấm linh chi quý (lục bảo linh chi) Nấm linh chi đen có nhiều cơng dụng việc chữa bệnh, nâng cao sức khỏe cho người, ứng dụng rộng rãi y học Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đề tài “Định danh khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen” thực hiện, nhằm giúp nâng cao, tối ưu hóa mơi CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh, 2000 Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà nội Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico, 2002 Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Trần Hùng, 2004 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược TP.HCM Nguyễn Đức Lượng, 2003 Vi sinh học công nghiệp, tập Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nuyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM Trần Văn Mão, 2004 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Phước Nhuận, 2001 Giáo trình sinh hố học, phần Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 10 Lê Xuân Thám, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điển hấp thu khoáng 48 nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam 11 Lê Xuân Thám, 1996 Nấm Linh chi - dược liệu quí việt nam Nhà xuất Mũi Cà Mau 12 Lê Xuân Thám, 2005 Nấm Linh chi vàng - nấm Hoàng chi Báo khoa học phổ thông, số 31/05 (1154) 13 Lê Duy Thắng, 2001 Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập Nhà xuất Nông nghiệp 14 Arichi D.S and Hagashi D.T., 2003 Linh chi nguyên chất bệnh thời (Đoàn Sáng dịch) Nhà xuát Y học, Hà nội, Việt nam 15 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008) Sinh học phân tử Nxb Giáo dục, Tp HCM Tiếng Anh 16 Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand 17 Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001 Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland 18 Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00 49 19 Steyaert R.L, 1972 Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria National de Beigique, Burxelle 20 Zhaoji – Ding, 1980 The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart 21 Zhou, J, Bruns, M.A and Tiedje, JM 1996 DNA recovery from soils of driverse composition 22 Ausubel, F.M.; Brent, R.; KingSton, R.E.; Moore, D.D.; Seidman, J.G.; Smith, J.A.; Struhl, K Current protocols in molecular biology New York: Greene Publishing Association; Wiley-Interscience, 1992 v.1 23 Shufeng Zhou, Yihuai Gao, Gouliang Chen, Xihu Dai and Jingxian Ye A phase I/II study of a Ganoderma lucidum extract in patients with coronary heart disease 24 Chandana Jayasinghe 2008 Favorable Culture Conditions for Mycelial Growth of Korean Wild Strains in Ganoderma lucidum Tài Liệu từ Internet 25 http://www.About Lingzhi.htm 26 http://www activeCompoundsReishi.html 27 http://www Mushroom Information Gano HIV.mht 28 http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf 29 http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5 30.http://sonongnghiep.dongnai.gov.vn/Documents/Ganodermataceae%20%28Repaire d%29c.pdf 50 PHỤ LỤC Phụ lục A: DNA mẫu nấm LC1 sau giải trình tự: Phụ lục B: Một số hình ảnh so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA nấm Linh chi đen ngân hàng gen NCBI thiết lập phân loài: Phụ lục C: Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen điều kiện nhiệt độ khác nhau: Nhiệt 5 6, 6, 5, 85, T85, r9 8, 8, 8, 68, 58, 8, 8, 8, 98, 98, 3, 2, 65 2, 85 2, 62, 82 Kết xử lý ANOVA: ANOVA Table So Su Df M F- Pur 95 m 31 ea 10 Ra 0.0 Va Be tw 0.3 05 12 0.0 68 82 00 Wi thi 95 51 15 29 To tal 40 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD C M Ho X t_ ou ea 2.8 mo 35 25 t_ 5.9 X 20 t_ 87 8.5 X 25 8.9 62 X t_ 30 C Si Di +/ on g.* -ffe 0.2 t_ 20 * -2.5 0.2 63 t_ 20 * 3.1 2.9 0.2 63 t_ 20 62 t_ * - 63 0.2 25 0.3 t_ * 5.7 63 0.2 25 37 t_ * 6.0 63 0.2 30 75 63 Phụ lục D: Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen điều kiện pH khác H Đ 6, 5, 6, 6, Tr 6, u 9, 9, 9, 9, 9, 8, 8, 8, 8, 8, 7, 6, 6, 6, 6, 2, 1, 95 1, 85 1, 1, Kết xử lý ANOVA: ANOVA Table So Su Df M F- Pur 13 m 32 ea 34 Ra 0.0 Va Be tw 1.4 0.4 15 0.0 60 4.6 00 Wi thi 13 18 19 94 To tal 1.8 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Co M Ho ea X mo pH 4un 1.9 _8 6.0 X pH _4 6.5 75 X pH _7 8.6 75 X pH _6 9.0 37 X pH _5 87 C Si Di +/ on pH g.* ffe - -0.4 _4 pH * 3.0 - 63 0.4 _4 2.5 pH * - 63 0.4 _4 0.5 pH * 4.1 63 0.4 _4 75 63 pH _5 pH _5 pH _5 pH _6 pH _6 pH _7 * * * * * 0.4 0.4 0.4 63 2.5 12 0.4 63 7.1 87 0.4 63 2.0 62 0.4 63 6.7 37 4.6 63 0.4 75 63 Phụ lục E: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ carbon khác lên phát triển sợi nấm Linh chi đen N n 0 0 g6, 8, 8, 8, 8, 7, 8, 8, 48, 78, 65 8, 48, 38, 98, 38, 88, Tr78, 68, 28, 68, u02 11 65 Kết xử lý ANOVA ANOVA Table So Su Df M F- Pur Be m 1.5 ea 0.5 Ra 2.1 Va 0.1 tw 23 07 51 Wi 2.8 12 0.2 thi To 81 4.4 15 40 tal 05 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Co M Ho C1 un ea 8.0 mo X 0C3 25 8.1 X 0C4 12 8.6 X 0C2 58.7 X 12 C Si on g C1 0C1 0C1 0C2 0C2 0C3 0- Di +/ -ffe 0.7 54 -0.6 0.7 54 -0.0 0.7 54 0.6 0.7 54 0.0 0.7 54 -62 0.7 0.5 54 Phụ lục F: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitrogen khác lên phát triển sợi nấm Linh chi đen N 10 n g g/l g g/ 8, 4, 2, 1, 4, 1, 1, 25 8, 4, 2, 1, 8, 4, 2, 1, 8, T 8, 4, 2, 21, r 23 Kết xử lý ANOVA ANOVA Table So Su Df M F- Pur 13 m 44 ea 14 Ra 0.0 Va Be tw 0.3 3.6 12 0.0 53 39 00 Wi thi 13 71 15 30 To tal 3.9 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD C M Ho ea X mo N2 4ou 1.2 2.0 37 X N1 4.4 25 X N1 8.6 X N5 62 C Si on g.* N5 -N5 * - * N5 -N1 * 0N1- * 0N1- * 5- Di +/ ffe 0.2 4.2 62 6.6 70 0.2 37 0.2 70 7.4 25 2.3 70 0.2 75 3.1 70 0.2 62 0.7 70 0.2 87 70 Phụ lục G: Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen N g G S L M u l u a a ồ8, 7, 7, 6, 7, 7, 6, 8, 6, 7, 6, 65 8, 6, 8, 6, 85 8, 6, 7, 6, T8, ru7 75 Kết xử lý ANOVA ANOVA Table So Su Df M F- Pur 11 m 3.7 ea 10 Ra 0.0 Va Be tw 0.4 22 12 0.0 40 9.6 00 Wi thi 11 09 15 34 To tal 62 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD C M Ho ea X mo M 4ou 6.7 al 6.8 X Su c 7.9 37 X La c 8.7 X Gl u 75 C on Gl uGluGluLa cLacMal Si g.* * * * * Di +/ ffe 0.8 -0.2 25 2.0 84 0.2 25 1.9 84 0.2 37 0.2 84 1.2 1.1 84 0.2 12 - 84 0.2 0.0 84 Phụ lục H: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh trưởng sợi nấm Linh chi đen N g Y P A U u e e m r 8, 7, 7,o 85 8, 67, 75 7, 75 45 8, 8, 45 7, 55 7, 7, 8, 7, 7, T8, r6 ± Kết xử lý ANOVA ANOVA Table So Su Df M F- Pur Be m 19 ea 65 Ra 17 Va 0.0 tw 6.1 39 58 00 Wi 0.4 12 0.0 thi To 46 19 15 37 tal 6.6 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD C M Ho X U ou ea 0.0 mo R A 7.6 X N PE 75 7.7 X P Y 37 8.6 X E 87 10 C Si on A g N A * N A * N PE * P- * PE P U- * R Di +/ ffe - -0.2 0.0 7.6 97 0.2 75 - 97 0.2 1.0 7.7 97 0.2 97 -37 0.2 0.9 - 97 0.2 8.6 97 Phụ lục I: Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen nuôi loại môi trường khác M ô C H i z D en t 7, 8, 6, 6, 8, 6, 6, 45 8, 18, 98, 36, 15 6, 07, 88, 05, 55 6, 9 T8, 8, 6, 95 6, r 52 Kết xử lý ANOVA ANOVA Table So Su Df M F- Pur 20 m 6.7 ea 16 Ra 0.0 Va Be tw 23 43 9.7 00 Wi 0.4 12 0.0 thi To 76 20 15 39 tal 70 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD C M Ho ea X mo He 4ou 6.1 nHo 6.5 X pCz 25 8.0 X ap P 25 8.8 X D 87 11 C Si on g.* Cz ap * Cz ap * Cz ap * He nHe- * nHo- * p- Di +/ ffe 0.3 1.9 25 0.3 07 1.5 07 - 0.3 07 -0.8 0.3 0.4 - 07 0.3 2.7 - 07 0.3 2.3 07 12 ... Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi)  Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi)  Bạch chi (Linh chi trắng gọi Ngọc chi)  Hồng chi (Linh chi vàng gọi Kim chi)  Tử chi (Linh chi tím) Nấm Linh chi. .. sinh trưởng nấm Linh chi đen: 30 3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh trưởng nấm Linh chi đen: 31 3.2.9 Khảo sát sinh trưởng sợ nấm Linh chi đen môi trường... 4.5 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen điều kiện pH khác nhau: 37 4.6 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ carbon khác lên phát triển sợi nấm Linh chi đen: .39 4.7 Khảo