nghien cuu benh hoc tren cay ca phe

VĂN PHỊNG HỢP TÁC KHOA SINH MƠI TRƯỜNG VÀ HỘI ĐỘNG VẬT FRANKFURT -o0o - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHÒNG TRỪ NẤM FUSARIUM SP GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN KON RẪY, TỈNH KON TUM ĐÀ NẴNG, 12/2017 VĂN PHÒNG HỢP TÁC KHOA SINH MÔI TRƯỜNG VÀ HỘI ĐỘNG VẬT FRANKFURT -o0o - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHÒNG TRỪ NẤM FUSARIUM SP GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN KON RẪY, TỈNH KON TUM SV thực hiện:1 Võ Lê Nguyễn Phạm Thị Tú Nguyên Lớp, khoa: 13CNSH- Khoa sinh – môi trườngNăm thứ: Ngành học: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS Đoàn Thị Vân ĐÀ NẴNG, 12/2017 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CF CPVS GTSX PBS PDA PTN VK VSV Cà phê Chế phẩm vi sinh Giá trị sản xuất Phosphate Buffered Saline Potato Dextro Agar Phòng thí nghiệm Vi khuẩn Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BIỂU TT Bảng 1.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Tên Bảng Diện tích sản lượng trồng cà phê qua năm huyện Kon Rẫy Sự phân bố vi khuẩn phân lập vườn cà phê khác huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum Sự phân bố vi khuẩn phân lập theo mùa Sự phân bố nấm mốc phân lập vườn cà phê khác huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum Sự phân bố nấm mốc phân lập theo mùa Kết hoạt tính kháng nấm bệnh vi khuẩn Kết kháng nấm Fusarium sp nấm mốc Kết quan sát vi khuẩn đối kháng nấm bệnh Mô tả phân loại hình dạng chủng vi khuẩn có khả đối kháng nấm bệnh Đặc điểm chủng nấm mốc N1.3, N1.2, N1.4 So sánh số lượng bào tử thu công thức lên men tạo chế phẩm Kết tỉ lệ nảy mầm Trang 28 28 29 30 30 31 34 35 37 40 42 DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ Ký hiệu Hình Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Tên hình Sơ đồ thí nghiệm Ví trí lấy mẫu đồ Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất chế phẩm Mẫu bệnh lấy vườn Tản nấm Fusarium sp Bào tử nấm Fusarium sp phân lập Trang 17 23 26 26 27 Hình 3.4 Kết kháng nấm bệnh Fusarium chủng Bacillus CF1.10, CF1.11, CF4.9 32 Hình 3.5 Tản nấm Fusarium sp đối chứng sau ngày nuôi cấy 33 Hình 3.6 Hiệu ức chế nấm bệnh Fusarium sp nấm N1.1 33 Hinh 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hiệu ức chế nấm bệnh Fusarium sp chủng nấm N1.2, N1.3 N3.8 sau ngày nuôi cấy Tản nấm N1.3, N1.2, N1.1 phát triển môi trường PDA Kết quan sát chủng nấm mốc N1.3, N1.2, N1.1 kính hiển vi( 100x.) Sự phát triển chủng CF1.11 N1.1 sau ngày cấy đĩa thạch Chế phẩm VSV sau sấy khơ đóng gói: Hạt cà phê giống khơng nảy mầm Cây cà phê nảy mầm 34 37 38 39 41 43 44 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cà phê công nghiệp lâu năm trồng nước ta 100 năm nay, mười mặt hàng xuất chủ yếu Việt Nam Được xác định công nghiệp xuất chủ lực, sau lúa, loại đóng vai trò quan trọng ngành nơng nghiệp Việt Nam [2] Năm 2012 Việt Nam xuất 1,76 triệu cà phê, đạt kim ngạch 3,73 tỉ USD, tăng số lượng giá trị so với năm 2011 [29] Ngành cà phê tham gia có hiệu vào chương trình kinh tế xã hội định canh định cư, xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho hàng triệu lao động có phần đơng bào dân tộc người miền núi, đặc biệt vùng đệm vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên Nhờ sống ổn định cho người dân, hoạt động khai thác rừng, săn bắt thú giảm đáng kể Kon Tum năm tỉnh Tây Nguyên có tiềm đất đai điều kiện sinh thái thuận lợi để phát triển cà phê Diện tích cà phê tỉnh Kon Tum năm 2012 12,158 ha, diện tích thu hoạch 10,805 với sản lượng đạt mức 27 nghìn [2] Cũng nhiều địa bàn khác tỉnh, huyện Kon Rẫy có điều kiện thuận lợi để phát triển cà phê Người dân sống địa bàn huyện Kon Rẫy phần lớn sống chủ yếu dựa vào nơng nghiệp, mà cà phê trồng mang lại nguồn thu nhập cao cho người dân Tuy nhiên, điều kiện nước ta khơng thích hợp với cà phê mà phù hợp với nhiều loại vi sinh vật (VSV ) gây bệnh cho cây, vườn cà phê xuất nhiều bệnh gây thiệt hại không nhỏ cho nơng dân tỉnh Kon Tum nói riêng nước nói chung Trong đó, bệnh thối rễ nấm Fusarium sp cho bệnh gây hại cho cà phê Nấm Fusarium sp gây thối cổ rễ, đốm [3] Chúng xâm nhiễm vào rễ non rễ bị thương tuyến trùng gây Bệnh ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển suất cà phê Để trị bệnh thối rễ cho cà phê, người dân thường phun loại thuốc bảo vệ thực vật, thuốc hóa học, biện pháp có hiệu nhanh lại gây độc hại, xảy thượng kháng thuốc, làm cân sinh thái Vậy nên cần tìm biện pháp trị bệnh hiệu quả, khắc phục nhược điểm thuốc hóa học gây ra, đảm bảo phát triển nông nghiệp bền vững Chính lí chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh phòng, trừ nấm Fusarium sp gây bệnh thối cổ rễ cà phê huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính đối kháng nấm Fusarium sp gây bệnh thối cổ rễ cà phê huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum, từ thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh (CPVS) phòng, trừ nấm Fusarium sp Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Kết đề tài tuyển chọn chủng vi sinh có khả đối kháng cao với nấm bệnh Fusarium sp cà phê huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum, ứng dụng chúng sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm Fusarium sp TĨM TẮT PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: o Phương pháp thu thập mẫu o Phương pháp phân lập vi sinh vật o Phương pháp bảo quản giống o Phương pháp xác đinh, đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh vi sinh vật o Phương pháp nhuộm Gram o Phương pháp nhuộm bào tử o Phương pháp tạo chế phẩm o Phương pháp lây bệnh nhân tạo o Phương pháp định lượng vi sinh vật chế phẩm o Phương pháp xử lí số liệu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 CÂY CÀ PHÊ Cây cà phê có nguồn gốc từ cao nguyên Kaffa (Ethiopia) Boma (Su Đăng), nơi có độ cao từ 1.370 - 1.830 m Cây cà phê trồng Yemen vào kỷ XIV, sau người phát tán đến địa phương khác [20] Cà phê (Coffea) chi thực vật thuộc họ Thiến Thảo (Rubiaceac) Thân cà phê cao từ 5-10m chưa tỉa bớt Cây cà phê có cành thon dài, cuống ngắn, xanh đậm, hình oval Mặt có màu xanh thẫm, mặt xanh nhạt Chiều dài khoảng 8-15 cm, rộng 4–6 cm Hoa cà phê màu trắng, có năm cánh, thường nở thành chùm đơi chùm ba Một cà phê trưởng thành có từ 30.000 đến 40.000 bơng hoa Cà phê lồi tự thụ phấn, gió trùng có ảnh hưởng lớn tới trình sinh sản Sau thụ phấn phát triển đến tháng có hình bầu dục Trong thời gian chín, màu sắc thay đổi từ xanh sang vàng cuối đỏ Quả có màu đen chín nẫu Thơng thường cà phê chứa hai hạt Chúng bao bọc lớp thịt bên Hai hạt cà phê nằm ép sát vào Mặt tiếp xúc chúng mặt phẳng, mặt hướng bên ngồi có hình vòng cung Mỗi hạt bảo vệ hai lớp màng mỏng: lớp màu trắng, bám chặt lấy vỏ hạt; lớp màu vàng rời rạc bọc bên ngồi Hạt có hình tròn dài, lúc tươi có màu xám vàng, xám xanh xanh Thỉnh thoảng gặp có hạt (do có nhân hai hạt bị dính lại thành một) [35] Hiện có 100 loại cà phê phát hiện, thuộc nhóm giống sau: Cà phê chè (Coffea Arabica Liné) có hàm lượng cafein hạt từ 1,8 2,0%; Cà phê vối (Coffea Canephora var Robusta có hàm lượng cafein hạt từ 2,5 - 3,0% Cà phê mít (Coffea Liberica bull var Excelsa) với hàm lượng cafein hạt thấp từ 1,02 - 1,15% [35] [28] Cà phê trồng tập trung Trung Mĩ, quần đảo Ăng ti, Đông Nam Brazil, Tây Trung Phi, Tây Nam Ấn Độ số nước Đông Nam Á có Việt Nam Trong nước, cà phê trồng nhiều Tây Ngun, ngồi trồng vùng Đông Nam Bộ, Bắc Trung Bộ, Trung du miền núi Bắc Bộ Cà phê loại có giá trị kinh tế cao, hạt cà phê mặt hàng nông sản xuất chủ lực Việt Nam, đứng thứ sau xuất gạo Việc trồng xuất cà phê giúp người nông dân trồng cà phê làm giàu mảnh đất Nhờ trồng cà phê, nhiều nông hộ địa bàn tỉnh Kon Tum nước có nguồn thu nhập ổn định, đời sống nâng cao Ngoài giá trị kinh tế, trồng cà phê giúp thực phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, có tác dụng lớn việc bảo vệ môi trường sinh thái 1.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 1.2.1 Đặc điểm tự nhiên - Vị trí địa lý Kon Rẫy huyện miền núi nằm phía đơng nam tỉnh Kon Tum có tọa độ địa lý nằm khoảng từ 14019’55’’ đến 14046’10’’ vĩ độ bắc, 108003’45’’ đến 108022’40’’ kinh độ đơng [12] Kon Rẫy có diện tích tự nhiên 91.134,55 ha, phía Đơng giáp huyện Kon Plong tỉnh Gia Lai, phía Tây giáp thành phố Kon Tum huyện Đăk Hà, phía Nam giáp tỉnh Gia Lai, phía Bắc giáp huyện Kon PLong Đăk Hà [12] Địa hình: Kon Rẫy có địa hình đa dạng bao gồm đồi núi, cao nguyên thung lũng xen kẽ với phức tạp, độ cao trung bình 900 -1.200 m [12] Khí hậu: Kon Rẫy nằm tiểu vùng khí hậu Tây Trường Sơn, thuộc vùng khí hậu nhiệt đới Nhiệt độ trung bình năm dao động 20-22 0C Lượng mưa trung bình 2.000-2.200 mm Kon Rẫy có mùa rõ rệt: mùa mưa mùa khô, mùa mưa thường tháng đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng năm sau [12] 1.2.2 Đặc điểm kinh tế - xã hội Toàn huyện có đơn vị hành (6 xã 01 thị trấn) Dân số 25.000 người, mật độ dân cư 25 người/km , phân bổ 56 thơn với 62 làng, đồng bào dân tộc thiểu số chiếm khoảng 66%, chủ yếu Bah Nar, Xơ Đăng [12] Lao động: Tồn huyện có 11.866 lao động chiếm khoảng 52% dân số, lao động nông nghiệp chiếm đa số với 89,48%, lao động phi nông nghiệp chiếm 10,52% [12] Kinh tế: Tốc độ tăng trưởng kinh tế bình quân giai đoạn 2006-2010 đạt 14,77%/năm Tổng giá trị sản xuất (GTSX) năm 2010 huyện đạt 364.554 triệu đồng, bình quân năm GTSX tăng 26,644%.Ngành nông lâm nghiệp chiếm 10 Đối với chủng nấm mốc khác hiệu lực đối kháng nấm bệnh khác Trong chủng nấm mốc phân lập có chủng có hiệu lực đối kháng cao, chủng có hiệu lực đối kháng trung bình, chủng có hiệu lực đối kháng yếu chủng không đối kháng Chủng đối kháng mạnh chủng N1.1 với hiệu lực đối kháng 100% chủng N3.8 có hiệu lực đối kháng thấp nhất, 3,39% Sau ngày cấy loại nấm N1.1 Fusarium sp mọc môi trường PDA Sau ngày, nấm N1.1 mọc kín hộp, ngược lại nấm Fusarium sp không mọc tiếp ( hình 3.6 a) Từ ngày thứ sau cấy trở đi, nấm N1.1 đối kháng làm sợi nấm Fusarium sp teo dần chết (hình 3.6 b) Kết cho thấy chủng N1.1 có hiệu lực đối kháng mạnh với nấm bệnh Fusarium Tiến hành lựa chọn chủng N1.1 tiếp tục nghiên cứu để sản xuất chế phẩm sinh học 3.3 KẾT QUẢ QUAN SÁT, ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT Từ kết nghiên cứu phần 3.2 cho thấy có 6/31 chủng VK 3/9 chủng nấm có hoạt tính đối kháng với nấm bệnh mức độ từ trung bình đến mạnh, Tiến hành định danh 6/31 chủng VK 3/9 chủng nấm đối kháng 3.3.1 Kết quan sát, kiểm nghiệm định danh 6/31 chủng vi khuẩn Tiến hành quan sát khuẩn lạc thực thí nghiệm kiểm nghiệm 6/31 chủng VK có hoạt tính đối kháng bao gồm: nhuộm Gram nhuộm bào tử Kết trình bày cụ thể bảng 3.7 bảng 3.8 Bảng 3.7: Kết quan sát vi khuẩn đối kháng nấm bệnh Kí hiệu Chủng CF1.1 Khuẩn lạc Hình dạng quan sát kính hiển vi sau nhuộm Gram 38 Bào tử quan sát kính hiển vi CF1.10 CF1.11 CF1.12 CF3.6 39 CF 4.9 Bảng 3.8: Mơ tả phân loại hình dạng chủng vi khuẩn có khả đối kháng nấm bệnh Kí hiệu chủng CF1.1 CF1.10 CF1.11 Đặc điểm hình thái Gram Hình dạng Bào tử + Hình que Có + Hình que Có + Hình que Có CF1.12 + Hình que Có CF3.6 + Hình que Có CF4.9 + Hình que Có STT Đặc điểm khuẩn lạc lồi nhẵn, trắng đục Tròn, nhẵn, trắng Khuẩn lạc màu trắng, bám chặt vào môi trường nhắn nhúm Trơn, nhầy, màu phớt cam, lan dần xung quanh Tròn, màu trắng đục, mép có cưa Trơn, lan dần xung quanh, màu phớt hồng Kết thu cho thấy: - Nhuộm Gram : Ở vật kính 100, chúng tơi thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn, xếp thành chuỗi dài, bắt màu tím, điều chứng tỏ chủng vi khuẩn phân lập thuộc nhóm Gram (+) - Nhuộm bào tử phương pháp nhuộm Carbolic Fuchsin: Khi tiến hành nhuộm bào tử quan sát kính hiển vi vật kính 100 xác định VK sinh nội bào tử Theo hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật đánh giá sơ thuộc chi Bacillus dựa theo khóa phân loại Bergey 3.3.2 Kết quan sát, định danh 3/9 chủng nấm mốc Tiến hành nhuộm, quan sát định danh 3/9 chủng nấm mốc có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium sp Kết thể hình 3.8, hình 3.9 bảng 3.9 40 a) b) c) N1.1 Hình 3.8: Tản nấm N1.3, N1.2, N1.1 phát triển môi trường PDA a) Nấm Aspergillus sp N1.3 b) Nấm Aspergillus sp N1.2 c) Nấm Trichoderma sp N1.1 a) b) c) Hình 3.9: Kết quan sát chủng nấm mốc N1.3, N1.2, N1.1 kính hiển vi( x100) 41 a) Nấm Aspergillus sp N1.3 b) Nấm Aspergillus sp N1.2 c) Nấm Trichoderma sp N1.1 Bảng 3.9: Đặc điểm chủng nấm mốc N1.1, N1.2, N1.3 Kí hiệu chủng N1.1 N1.2 N1.3 Bào tử Sợi nấm cuống sinh bào tử Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc ban đầu trắng, sau ngày chuyển qua màu lục, hệ sợi nấm sinh trưởng mạnh, không tiết sắc tố Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng, sau ngày chuyển qua màu xanh đen, hệ sợi nấm sinh trưởng mạnh, không tiết sắc tố Sợi nấm không màu, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, cuống bào tử hình chai Sợi nấm khơng màu, phân nhánh, có vách ngăn Giá thể bào tử nhẵn, bọng đính hình cầu, thể bình tầng Sợi nấm khơng màu, phân Khuẩn lạc rắn màu đen, sợi nhánh, có vách ngăn Giá nấm xốp màu xám trắng, bào tử thể nhẵn, bọng sinh trưởng nhanh, khơng tiết đính hình chùy, thể bình sắc tố tầng Bào tử hình cầu, màu xanh lục nhạt Bào tử hình cầu, màu xanh đậm Bào tử hình cầu, màu đen Dựa vào sai khác quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc môi trường nuôi cấy; quan sát kính hiển vi hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử sợi nấm Áp dụng khóa phân loại Robert A Sam Son, Phoma1984 [7] Kubbick Harman (1998) [36], [37] định danh 3/9 chủng nấm có khả đối kháng trung bình mạnh Trong chủng N1.1 thuộc chi Trichoderma sp chủng N1.2, N1.3 thuộc chi Aspergillus sp 3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO CPVS PHÒNG TRỪ NẤM FUSARIUM SP 3.4.1 Kết kiểm tra khả đối kháng chủng vi sinh vật tuyển chọn làm chế phẩm Từ kết cho thấy chủng CF1.11 N1.1 có hoạt tính đối kháng nấm bệnh mạnh Tiến hàn chọn chủng để tạo CPVS 42 CPVS tạo từ chủng VSV, cần tiến hành kiểm tra tính đối kháng chủng VSV tuyển chọn Chủng VK Bacillus CF1.11 nấm mốc Trichoderma N1.1 cấy đối xứng đĩa thạch theo dõi phát triển ngày Kết thể hình 3.10 Hình 3.10: Sự phát triển chủng CF1.11 N1.1 sau ngày cấy đĩa thạch Kết hình cho thấy sau ngày cấy chuyền chủng VSV CF1.11 N1.1 phát triển tốt mơi trường PDA, khơng có tượng ức chế lẫn chủng Như tạo CPVS đa chủng từ chủng VSV 3.4.2 Kết nghiên cứu tạo chế phẩm chủng VSV (vi khuẩn Bacillus CF1.11 nấm mốc Trichoderma N1.1) có khả đối kháng mạnh với nấm bệnh Fusarium sp sử dụng để tiến hành lên men xốp tạo chế phẩm Để xác định hiệu chủng vi sinh vật riêng lẻ lựa chọn tỉ lệ chất mang tốt nhất, tiến hành tạo công thức ( CT) chế phẩm với tỉ lệ chất mang khác Chất mang lựa chọn có giá thành hợp lý, không bị hạn chế nguồn nguyên liệu, đảm bảo nguồn cung cấp sản xuất với số lượng lớn chế phẩm có CT sau: • Chế phẩm chứa vi khuẩn bacillus: + CT1: 10% rỉ đường 30% bột đậu tương, 60% cám gạo • Chế phẩm đa chủng Bacillus sp Trichoderma sp.: + CT2: 10% rỉ đường, 15% bột đậu tương, 30% cám gạo, 45% thóc 43 + CT3: 10% rỉ đường, 15% bột đậu tương, 45% cám gạo, 30% thóc + CT4: 10% rỉ đường, 15% bột đậu tương, 40% cám gạo, 40% thóc • Chế phẩm chứa nấm Trichoderma sp.: + CT 5: 100% thóc Chủng Bacillus tuyển chọn nuôi cấy riêng rẽ môi trường lỏng, chủng Trichoderma tuyển chọn nuôi cấy hộp petri mơi trường thạch PDA Khi q trình sinh trưởng chủng tuyển chọn đạt tốt tiến hành tiếp giống vào chất mang theo tỷ lệ 10%, trình lên men xốp trì điều kiện thơng khí, vơ trùng nhiệt độ 30 oC, đảo trộn định kỳ nhằm đạt hiệu lên men tối ưu Sau kết thúc trình lên men, chế phẩm sấy khô ẩm độ khoảng 10 %( đạt tiêu định lượng bắt buộc phân bón- Cơng văn số 2114/ BCT-HC) đóng gói a) d) c) b) e) Hình 3.11: Chế phẩm VSV sau sấy khơ đóng gói a) CT1, b) CT2, c) CT3, d) CT4, e) CT5 Sử dụng công thức chế phẩm khác nhau, sau tiến hành lên men xốp chủng VSV tuyển chọn, thu nhận chế phẩm có số lượng bào tử VSV 44 khác nhiều Kết phân tích mật độ vi sinh có chế phẩm cơng thức tóm tắt bảng 3.10 sau: Bảng 3.10 Số lượng bào tử thu công thức lên men tạo chế phẩm Công thức Số lượng bào tử (x 108 CFU/g) Bacillus sp Trichoderma sp a CT1 7,12 b CT2 4,60 7,95a CT3 6,32c 6,71b CT4 4,49b 7,30b CT5 11,23d Ghi chú: Các số cột có chữ theo sau( a, b, ) khác sai khác có ý nghĩa mặt thống kê mức α= 0,05 Kết cho thấy: Đối với chủng Bacillus sp ta thấy CT chứa Bacillus sp thu mật độ Bacillus lớn (7,12 x 10 CFU/g) Tiếp theo CT3 với mật độ 6,32 x 108 CFU/g Ở CT 2, CT4 mật độ VK hẳn so với CT1 CT3 Ta thấy CT có tỉ lệ cám gạo cao mật độ Bacillus thu lớn Điều chứng tỏ tỷ lệ cám gạo có thành phần chất mang ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển Bacillus Đối với chủng Trichoderma sp., ta thu mật độ bào tử Trichoderma lớn CT (11,23 x 108 CFU/g), công thức chứa nấm Trichoderma với chất mang 100% thóc Tiếp đến CT với mật độ 7,95 x 10 CFU/g cuối CT 3, CT4 Ta kết luận với CT có tỉ lệ thóc cao lượng bào tử Trichoderma thu lớn, tỉ lệ thóc có thành phần chất mang ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh bào tử nấm Trichoderma Như vậy, dễ dàng nhận thấy lên men xốp riêng lẻ chủng Bacillus sp Trichoderma sp ta thu chế phẩm có mật độ VSV cao nhất, lên men chúng với tạo chế phẩm đa chủng mật độ chúng chế phẩm giảm đáng kể Điều chủng phù hợp với CT chất mang khác Với chất mang thóc tạo điều kện thơng thống, tơi xốp dễ dàng cho sợi nấm 45 Trichoderma phát triển, nhiên kích thước hạt thóc lớn khiến Bacillus khó sinh trưởng Mặt khác với chất mang cám gạo bột đậu tương với kích thước nhỏ dễ dàng cho Bacillus sinh trưởng có độ tơi xốp khơng cao nên nấm Trichoderma phát triển ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM TRONG ƯƠM HẠT CÀ PHÊ 3.5 Không phải tất chủng VSV kháng nấm có hoạt tính mơi trường đất, phun mơi trường đất nhiều yếu tố tác động đến VSV ni cấy phòng thí nghiệm với điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, ẩm độ tối ưu hóa cho chúng sinh trưởng tốt Ngồi mơi trường đất, điều kiện nhiệt độ độ ẩm thường xuyên thay đổi tùy vào điều kiện thời tiết, mùa vụ, nhiệt độ ngày đêm, đất ruộng có nhiều VSV khác, chúng cạnh tranh với VSV mơi trường sống, dinh dưỡng, làm hoạt tính VSV kháng nấm Để đánh giá khả kháng nấm bệnh Fusarium sp cà phê chế phẩm ngồi mơi trường đất, tơi tiến hành thí nghiệm sau: - Chuẩn bị thùng xốp lớn chứa: 20% cát + 30% phân bò + 50% đất qua xử lí Lây bệnh nhân tạo vào đất cho mẫu cách trộn bào tử nấm bệnh vào đất Gieo hạt cà phê xử lý vào đất, mẫu gieo 10 hạt Sau ngày trộn chế phẩm vào mẫu để lại mội mẫu đối chứng khơng trộn chế phẩm Kết thí nghiệm thể bảng 3.11, hình 3.12 hình 3.13 Bảng 3.11 Kết tỉ lệ nảy mầm Mẫu Mẫu dối chứng Mẫu CT ( chế phẩm Bacillus) Mẫu CT Mẫu CT3 Mẫu CT4 Mẫu CT5 ( chế phẩm Trichoderma) 46 Tỉ lệ nảy mầm 30% 60% 70% 50% 60% 80% Hình 3.12: Hạt cà phê giống khơng nảy mầm b a Hình 3.13: Cây cà phê nảy mầm a) Mẫu đối chứng không dùng chế phẩm; b) Mẫu sử dụng chế phẩm CT5 Từ hình 3.14 dễ dàng nhìn thấy hạt cà phê giống khơng nảy mầm có màu đen bị bao phủ sợi nấm màu trắng hồng, chứng tỏ hạt cà phê bị nhiễm nấm Fusarium sp khiến hạt khơng thể nảy mầm Kết thí nghiệm mẫu có sử dụng chế phẩm tỉ lệ nảy mầm cao hẳn mẫu đối chứng khơng sử dụng chế phẩm Trong mẫu sử dụng chế phẩm CT5 có tỉ lệ nảy mầm cao Như vậy, chế phẩm CT5 có hiệu cao việc phòng trừ nấm Fusarium sp Thí nghiệm tiếp tục theo dõi để quan sát phát triển cà phê sau nảy mầm 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Phân lập nấm bệnh Fusarium, 31 chủng VK chủng nấm mốc từ mẫu thu thập vườn cà phê khác địa bàn huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum Xác định chủng VK thuộc chi Bacillus, chủng nấm mốc thuộc chi Trichoderma chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus Xác định 13 chủng có khả đối kháng với nấm bệnh Fusarium sp., gồm chủng VK Bacillus chủng nấm mốc Trong đó, có chủng nấm N1.1, N1.3 chủng vi khuẩn CF 1.10, CF 1.11, CF 4.9 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium sp Tuyển chọn chủng VK Bacillus CF1.11 nấm Trichoderma N1.1 có khảng đối kháng nấm Fusarium mạnh làm đối tượng nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học Chế tạo loại chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Fusarium sp cà phê Xác định chế phẩm CT5 tạo từ chủng nấm Trichoderma sp với chất mang 100% thóc cho hiệu phòng, trừ nấm bệnh tốt trình ươm hạt cà phê KIẾN NGHỊ Do thời gian giới hạn đề tài, với điều kiện thực nghiệm hạn chế nên việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm chưa tiến hành đầy đủ Từ đề tài kiến nghị số phương hướng nghiên cứu cần thực sau: Nghiên cứu tìm thêm chất mang phù hợp để tạo chế phẩm đa chủng Nghiên cứu điều kiện sản xuất bảo quản chế phẩm, từ hồn thiện thêm quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh Fusarium sp Tiếp tục nghiên cứu, đánh giá tác động chế phẩm CT5 nấm bệnh vườn ươm cà phê huyện Kon Rẫy, Tỉnh Kon Tum 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Anh (2009), “Nấm học”, NXB Đại học Huế, Huế Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2012), Báo cáo trạng sản xuất, giải pháp phát triển trồng tái canh cà phê thời gian tới Cục Trồng Trọt, 19tr Nguyễn Văn Chiến cộng (2007), “Giáo trình quản lý sâu bệnh hại cà phê”, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Cục Thống kê Kon Tum (2015), “Niên giám thống kê”, Kon Tum Nhữ Viết Cường cộng (2013), Một số kết phân lập bệnh nấm gây hại vườn ươm cà phê Chiềng Mung Sơn La Cao Ngọc Diệp, Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Văn Bá (2005),Giáo trình mơn nấm học Viện nghiên cứu phát tiển công nghệ sinh học Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vi sinh vật học, tr 161-366 Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1983), Thực hành vi sinh vật học, NXB Đại Học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội 10 Nguyễn Lân Dũng Dương Văn Hợp (2007), "Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật" Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 11 Vũ Minh Đức, Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Chu Văn Mẫn, Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lí nước thải, Khoa Sinh, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 12 Phan Duy Huynh (2011), Giải pháp xóa đói giảm nghèo huyện Kon Rẫy, tỉnh Kon Tum, luận văn thạc sỹ kinh tế, Đại học Đà Nẵng 13 Phạm Thị Lịch ( 2013), nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase từ chủng Trichoderma sp phòng từ vi nấm gây hại cà phê, luận văn thạc sỹ sinh học, trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết( 2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 15 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998), Bệnh nông nghiệp, NXB Hà Nội, Hà Nội 16 Trần Tú Ngà, Đồn Văn Lư, Phạm Thị Hương, Ngơ Bích Hảo (1993), Kết bước đầu nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 82-83.15 49 17 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Văn Thành Phạm Quang Thu ( 2012), "Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh dòng keo tai tượng khảo nghiệm Thừa Thiên Huế", tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn 18 TS Lưu Hồng Ngọc cộng (2009), Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất dịch chiết rễ chút chít Rumex crispus định hướng làm thuốc trừ nấm thảo mộc thân thiện với mơi trường, viện Hóa học Cơng nghiệp Việt Nam, tổng cơng ty Hóa chất Việt Nam 19 PGS.TSKH Nguyễn Xuân Nguyên (2004), Công nghệ xử lý rác thải chất thải rắn, Trung tâm tư vấn, chuyển giao cơng nghệ nước mơi trường 20 Đồn Triệu Nhạn, Hoàng Thanh Tiệm Phan Quốc Sùng (1999), "Cây cà phê việt nam" 21 Phòng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học (2011), Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn đối kháng để kiểm soát nấm hại trồng 22 Phan Thị Bích Phượng(2013), Nghiên cứu sử dụng số chủng vi khuẩn Bacillus sp để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý nước thải TP Đà Nẵng, khoá luận tốt nghiệp, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng 23 Lê Xuân Phương (2001), Nấm mốc, Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội 24 Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Trần Văn Huy cộng (2016), Nghiên cứu sản xuất, ứng dụng chế phẩm sinh học SH-BV1 phòng trừ tuyến trùng nấm bệnh hại rễ hồ tiêu, cà phê Gia Lai Đăk Nông, Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam 25 Nguyễn Thảo(2011) , Sử dụng chế phẩm vi sinh nc26 xử lý rác thải hữu phế thải nông nghiệp, Mạng thông tin khoa học công nghệ Bác Giang 26 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh 27 Trần Thị Thúy (2013), Nghiên cứu tuyển chọn sản xuất chế phẩm đơn dòng nầm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen ca cao, luận văn thạc sỹ khoa học, Khoa môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 50 28 Trần Công Tiến (2009), Nghiên cứu sử dụng phụ phế phẩm bón cho cà phê vối thời kì kinh doanh huyện CưMGar tỉnh Đắk Lăk, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại học Tây Nguyên 29 Tổng cục Thống kê (2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012), Niên giám thống kê, NXB Thống kê Hà nội 30 PGS.TS Nguyễn Kim Vân cộng (2010), Kết nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại có nguồn gốc đất miền Bắc Việt Nam 31 Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Thị Tú, Bùi Văn Công (2011), nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma viride phòng trừ số nấm bệnh phòng trừ vùng rễ khoai tây, đậu tương, Tạp chí Khoa học Phát triển, Tập 10, số 1: 95 – 102 32 Burgess L.W cộng (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) 51 Tiếng Anh 33 Bertrand, K.G and Jack, J.P (1998), “Molecular biotechnology priniciples and application of recombinant DNA” 2nd edition , ASM Press Washington, D.C potential for biocontrol Ann Rev Phytopath, 23:23-54 34 Booth C (1971), Fusarium nomenclature, The genus Fusarium, chủ biên, Commonweath Mycological Institute, Kew, Surrey 35 Aaron P Davis cộng (2006), "An annotated taxonomic conspectus of the genus Coffea (Rubiaceae)", Botanical Journal of the Linnean Society 36 Harman, G E and Kubicek, C P (ed) (1998), Trichoderma and Gliocladium, vol I, Basic biology, taxonnomy and genetics., p.6-10, 64-69 37 Harman, G E and Kubicek, C P (ed) (1998), Trichoderma and Gliocladium, vol II, Enzimes, Biological control and commercial applications 38 C-T Lo, EB Nelson, GE Harman (1996), Biological control of turfgass diseases with a rhizosphere competent strain of Trichoderma harzianum, Plant Dis 80, pp 736-714 39 Julien J Guadet J, Lajay J.F, Brygoo Y (1989), "Phylogeny of some Fusarium, as dertermined by large_subumit rARN sequence comparison" 40 Papavizas (1985), Trichoderma and Gliocladium: Biology, ecology, and potential for biocontrol, Ann Rev Phytopath, 23: 23-54 41 Gagkaeva T (2008), Introduction to Fusarium taxonomy, Russia St Petersburg 42 Hamel C Vujanovic V, Yergeau E, Arnaud M.S (2006), "Biodiversity and Biogeopraphy of Fusarium Species from Northeastern North American Asparagus Fields Based on Microbiogical and Molercular Approaches", Springer Science anh Business Media 43 Nirenberg HI Gerlach W (1982), "The genus Fusarium - a pictorial atlas" 44 Knight T.E Burgess L.W, Len Tesoriero, Hien Thuy Phan (2008), Diagnotic manual for plant disease in Vietnam, Australian Centre for International Agricultural Research 45 Heitman J Lin X (2005), "Chlamydospre Formation during Hyphal Growth in Cryptococcus neoformans", American Society for Microbioly 52 ... Arabica Liné) có hàm lượng cafein hạt từ 1,8 2,0%; Cà phê vối (Coffea Canephora var Robusta có hàm lượng cafein hạt từ 2,5 - 3,0% Cà phê mít (Coffea Liberica bull var Excelsa) với hàm lượng cafein... [12] Nhờ có nhiều cao nguyên, thung lũng, nhiều cánh đồng tương đối phẳng rộng lớn, đất trồng đa dạng, nhiều đồng cỏ tự nhiên với khí hậu nhiệt đới gió mùa cao ngun phân hố theo độ cao mà huyện có... pH = 7, số phù hợp với pH = – 10 Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = - Bacillus acidocaldrius Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hay ưa lạnh (50C – 250C),