XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY của một số LOÀI THUỐC KHÁNG SINH đối với EDWARDSIELLA SP và AEROMONAS SP gây BỆNH TRÊN cá TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI BÁO CÁO XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CỦA MỘT SỐ LỒI THUỐC KHÁNG SINH ĐỐI VỚI EDWARDSIELLA SP VÀ AEROMONAS SP GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lê Thành Đạt MSSV: DSH143453 Giảng viên: Đoàn Thị Minh Nguyệt An Giang, tháng 10 năm 2017 CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) lồi cá trơn nước ni phổ biến Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ… Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất Đồng Bằng Sông Cửu Long tăng nhanh, đem cho đất nước nguồn ngoại tệ lớn Diện tích thả nuôi cá tra tỉnh ĐBSCL tập trung nhiều tỉnh là: Đồng Tháp, Cần Thơ An Giang Khi lợi ích nghề ni thủy sản mang lại ngày cao, nghề ni ngày thâm canh hóa Tuy nhiên, nghề ni thâm canh hóa với mật độ cao vấn đề dịch bệnh xảy thường xuyên thiệt hại nhiều (Đặng Thị Hoàng Oanh cs, 2004) Trong số bệnh thường gặp cá tra như: đốm đỏ, trắng da, phù đầu phù mắt, xuất huyết, bệnh ký sinh trùng ngoại ký sinh bệnh xuất huyết bệnh đốm trắng gan gây thiệt hại nghiêm trọng nuôi cá tra thâm canh Theo Ferguson cs (2001) bệnh gan thận mủ phát lần Việt Nam 1998, cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung cs, 2004) Tương tự bệnh xuất huyết cá tra gây tỉ lệ chết cao từ 60 - 70% điều trị khơng kịp thời (Nguyễn Chính, 2005) Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh vi khuẩn động vật thủy sản số nước lớn như: Trung Quốc 1.500 tấn, Nhật Bản 1.100 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn… Việt Nam 50 tấn/năm Hiện thị trường có nhiều loại kháng sinh để trị bệnh vi khuẩn cá tra, nên người dân sử dụng tràn lan loại kháng sinh không tuân thủ nghiêm quy định, dẫn đến tình trạng lạm dụng thuốc, giảm sức đề kháng vật ni tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc Hậu gây thiệt hại kinh tế, tốn nhiều chi phí cho người ni việc điều trị bệnh hiệu Vì thế, cần xác định lại loại kháng sinh nhạy với vi khuẩn đề giúp người dân lựa chọn loại kháng sinh, góp phần hạn chế thiệt hại vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp cá tra gây ra, giảm bớt rủi ro cho người nuôi cần thiết Chính vậy, đề tài: “xác định tính nhạy số lồi thuốc kháng sinh Edwardsiella sp Aeromonas sp gây bệnh cá tra” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Dùng phương pháp kháng sinh đồ nhằm xác định loại kháng sinh nhạy với vi khuẩn để việc điều trị đạt hiệu cao Đề tài góp phần giảm chi phí hóa chất, giảm nhiễm mơi trường dùng thuốc kháng sinh, cá điều trị sớm làm giảm tỉ lệ hao hụt cá, ổn định suất chất lượng 1.3 Nội dung đề tài Phân lập vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp từ gan, thận tỳ tạng cá tra bệnh Lập kháng sinh đồ hai loại vi khuẩn 13 loại thuốc kháng sinh CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.1 Hệ thống phân loại Theo hệ thống phân loại Rainboth, W.J, 1996 + Ngành: Chordata + Lớp: Actinopterygii + Bộ: Siluriformes + Họ: Pangasiidae + Giống: Pangasius + Lồi: Pangasius hypophthalmus Hình 1: Hình dạng bên ngồi cá tra 2.1.2 Đặc điểm hình thái Cá tra cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng bạc, miệng rộng có hai đôi râu dài, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to Vây lưng cao, có gai cứng có cưa Vây ngực có ngạnh, bụng có tia phân nhánh, lồi khác có tia (Phạm Văn Khánh, 1996) 2.1.3 Phân bố Cá tra có tên khoa học Pangasianodon hypophthalmus trước có tên P micromenmus hay P sutchi, phân bố lưu vực sơng Mekong, có mặt nước Lào, Việt Nam, Campuchia Thái Lan Có khả sống tốt điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp ni với mật độ cao (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) 2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng Cá tra loài ăn tạp Trong tự nhiên, cá ăn mùn bã hữu cơ, rễ thủy sinh, rau quả, tôm, tép, cua, côn trùng, ốc cá… Cá nuôi ao sử dụng nhiều loại thức ăn khác như: Thức ăn tự chế, thức ăn cơng nghiệp, cám, tấm, rau muống… Thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá lớn nhanh (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) 2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, nhỏ cá tăng chiều dài, sau năm cá đạt trọng lượng - 1,5 kg/con, sau cá tăng trọng nhanh hơn, đạt tới 25 kg cá 10 năm tuổi (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) 2.1.6 Đặc điểm sinh sản Cá tra không đẻ ao nuôi, cá có tính di cư đẻ tự nhiên khúc sơng có điều kiện sinh thái phù hợp thuộc địa phận Campuchia Thái Lan, cá tra khơng có bãi đẻ tự nhiên Việt Nam Cá tra đẻ Campuchia, cá bột theo dòng nước Việt Nam (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) Tuổi thành thục cá tra sông Mekong - năm tuổi Cá tra có tập tính di cư ngược dòng đẻ, mùa vụ sinh sản cá tự nhiên tháng - âm lịch hàng năm Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 - kg (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) 2.2 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp 2.2.1 Vi khuẩn Edwardsiella sp + Ngành: Proteobacteria + Lớp: Grammaproteobacteria + Bộ: Enterbacteriaceae + Giống: Edwardsiella Theo Crumlish csv (2002), bênh mủ gan (bệnh đốm trắng gan, thận) cá tra, nhóm vi khuẩn E ictaluri gây (Từ Thanh Dung cs, 2005) 2.2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, kích thước x 2-3 µm, khơng sinh bào tử, vi khuẩn yếm khí tùy tiện Cho phản ứng oxidase âm tính, oxy hóa âm lên men môi trường O/F glucose Chuyển động nhờ vành tiêm mao Thường gặp hai loài: E tarda E ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006) E tarda tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn cá nước ấm, đặc biệt cá không vẩy E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn quan nội tạng, tụy, thận cá khơng vẩy Lồi E tarda hầu hết khơng lên men loại đường có vài chủng lên men đường nhanh (Bùi Quang Tề, 2006) E tarda phát triển tốt nhiệt độ 37 oC E ictaluri phát triển tốt 28 o C phát triển yếu 37 oC Các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn E ictaluri cho hầu hết phản ứng âm tính có phản ứng dương tính Lysine Glucose Khi so sánh tiêu sinh hóa vi khuẩn E ictaluri với E tarda cho thấy vi khuẩn E ictaluri cho phản ứng Indole H 2S âm tính, E tarda cho phản ứng dương tính (Từ Thanh Dung cs, 2005) 2.2.1.2 Đường lây truyền E ictaluri nhiễm cho cá hai đường khác nhau, vi khuẩn nước qua đường mũi cá xâm nhập vào quan khứu giác di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau vào não, bệnh lang rộng từ màng não đến sọ da, E ictaluri xâm nhiễm qua đường tiêu hóa qua niệm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu, đường vi khuẩn vào mao mạch biểu bì gây hoại tử sắc tố da, cá da trơn nhiễm E ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột, bệnh phát triển gây viêm ruột, viêm gan viêm cầu thận vòng tuần sau nhiễm bệnh (Thanh Dung cs, 2005) 2.2.2 Vi khuẩn Aeromonas sp + Ngành: Proteobacteria + Bộ: Aeromonadales + Họ: Aeromonadaceae + Giống: Aeromonas Hình 2: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có tiêm mao (ảnh chụp kính hiển vi) Trong giống Aeromonas có hai nhóm: Nhóm 1: Aeromonas không di động (A salmonicida) gây bệnh nước lạnh Nhóm 2: Là lồi Aeromonas di động, bao gồm A hydrophila, A caviae, A sobria Đặc tính chung ba loài vi khuẩn di động nhờ có tiêm mao Vi khuẩn Gram âm dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5x1,0 - 1,5 µm Vi khuẩn yếm khí tùy tiện, cytochrom oxidase dương tính, khử nitrate, khơng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129… Các vi khuẩn Aeromonas di động phân lập từ cá nước nhiễm bệnh, thường gặp loài A hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006) 2.3 Tổng quan loại kháng sinh 2.3.1 Định nghĩa Kháng sinh chất có tác động chống lại sống vi khuẩn, ngăn ngừa vi khuẩn nhân lên cách tác động mức phân tử, tác động vào hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết đời sống vi khuẩn tác động vào cân lý hóa (Từ Thanh Dung cs, 2005) Trong y học, thú y nuôi trồng thủy sản, người ta dùng kháng sinh để trị bệnh nhiễm khuẩn đem lại hiệu điều trị cao, dùng thuốc, liều, thời điểm Tuy vậy, dùng kháng sinh có mặt trái, ảnh hưởng xấu đến động vật sử dụng có tác động khơng nhỏ tới mơi trường sinh thái Nếu dùng kháng sinh tùy tiện thiếu hiểu biết làm giảm sức đề kháng vật nuôi với loại bệnh 2.3.2 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh Chỉ sử dụng khánh sinh có nhiễm vi khuẩn Phải chọn kháng sinh dạng thuốc thích hợp Phải sử dụng kháng sinh liều, thời gian quy định Biết phối hợp kháng sinh điều trị kháng sinh dự phòng Chỉ sử dụng kháng sinh phép sử dụng nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung cs, 2005) CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu cá tra bệnh xuất huyết mủ gan thu tỉnh: An Giang Cần Thơ (10 chủng dòng vi khuẩn) Dùng phương pháp làm kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp với 13 loại kháng sinh 3.1.2 Phương pháp thu mẫu Mỗi ao cá tra: thu cá tra có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: cá lờ đờ, bơi dạt vào bờ, mắt lồ, phù đầu, xuất huyết… cá khỏe Tuổi cá: từ giai đoạn cá giống trở lên Khi thu mẫu cá có thu kèm thơng tin tuổi cá, kích cỡ cá, dấu hiệu bệnh lý cá… ghi vào phiếu thu mẫu cá Sau thu mẫu xong, cá vận chuyền túi nylon bơm oxy Mẫu cá chuyển vào phòng thí nghiệm, tiến hành mổ cá ngày để lấy vi khuẩn phân tích 3.1.3 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Giết cá cách hủy tủy, sau mổ cá Cấy mẫu vi sinh từ gan, thận, tỳ tạng cá tra môi trường TSA, điều kiện vơ trùng Ủ đĩa cấy có vi khuẩn tủ ấm 30 oC Đọc kết sau 24 Aeromonas sp 48 Edwardsiella sp Ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc hình dạng màu sắc Chọn khuẩn lạc rời, có hình dạng đặc trưng chiếm ưu để tách ròng, định danh lưu giữ để làm kháng sinh đồ Khi vi khuẩn tiến hành thực bước sau: + Nhuộm Gram + Tính di động + Phản ứng oxidase + Phản ứng catalase + Khả lên men oxy hóa đường glucose (O/F test) + Phản ứng 0/129 3.1.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ Phương pháp làm kháng sinh đồ nhóm vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp, sử dụng môi trường MHA, chọn 13 loại thuốc kháng sinh: ampicillin (AM/10 μg), amoxicillin (AMX/25 µg), cefalexin (CN/30 µg), colistin (CS/50 µg), doxycycline (DO/30 µg), enrofloxacin (ENR/5 µg), kanamycin (K/30 µg), ciprofloxacin(CIP/5 µg), rifamycin (RA/40 µg), tetracyclin (TE/30µg), norfloxacin (NOR/5 µg), ofloxacin (OF/10 µg), florfenicol (FFC/30µg) Đo đường kính vơ trùng (mm): nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình kháng 3.1.5 Mơi trường thạch Hòa tan mơi trường TSA, MHA theo hướng dẫn nhãn chai, trùng 121 o C 15 phút Để nguội môi trường khoảng 50 oC, đổ môi trường đĩa petri thủy tinh dày khoảng mm Sau môi trường khơ lật đĩa cho vào túi nylon ủ 30 oC 24 để kiểm tra nhiễm khuẩn 3.1.6 Nước muối sinh lý Hòa tan 0,85g NaCl 100mL nước cất, cho mL nước muối sinh lý vào ống nghiệm, trùng 121 oC 15 phút 3.1.7 Mật số vi khuẩn xác định dựa vào phương pháp so màu máy quang phổ Vi khuẩn sau tách ròng tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5mL nước muối sinh lý tiệt trùng, trộn máy voxtec xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, bước sóng 625 nm với giá trị OD = 0,08-0,13±0,02 mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL Sau xác định mật độ vi khuẩn tiến hành cho vi khuẩn lên môi trường Dùng tăm tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét lên mơi trường thạch MHA Sau để n phút dùng gắp tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri cho khoảng cách tâm đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm khoảng cách tâm đĩa kháng sinh với mép rìa đĩa petri 10 – 15 mm Mỗi đĩa petri môi trường đặt tối đa đĩa kháng sinh Sau hoàn tất việc dán đĩa kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm điều kiện nhiệt độ 30 oC Sau 24 tiến hành đọc kết Aeromonas sp 48 Edwardsiella sp Đọc kết quả: Sau 24 (vi khuẩn gây bệnh xuất huyết Aeromonas sp), 48 (vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella sp) Xuất vòng vơ trùng (vòng tròn khơng có vi khuẩn phát triển) đĩa kháng sinh Đường kính vơ trùng xác định tính nhạy cảm vi khuẩn với thuốc kháng sinh Đo đường kính vòng vơ trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vơ trùng theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory (CLSI) (2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy kháng CHƯƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN 4.1 Kết phân lập định danh vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp Theo mô tả Từ Thanh Dung (2004) khuẩn lạc Edwardsiella sp phát triển môi trường TSA sau 48 điều kiện nhiệt độ 30 oC, kích thước li ti có màu trắng đục Khuẩn lạc Aeromonas sp phát triển môi trường TSA sau 24 điều kiện nhiệt độ 30 oC, kích thước nhỏ, đường kính – mm, màu trắng đục hay màu kem Bảng 1: Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp STT Chỉ tiêu Edwardsiella sp Aeromonas sp Nhuộm Gram - - Di động + + Oxydase - + Catalase + + O/F +/+ +/+ 0/129 Kháng Nếu qua kết kiểm tra ban đầu hình dạng tiêu sinh hóa chủng vi khuẩn Aeromonas sp giống mô tả Bùi Quang Tề (2006), vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, di động nhờ tiêm mao, oxydase dương tính, catalase dương tính, cho phản ứng lên men, không mẫn cảm với thuốc thử 0/129 Đối với chủng Edwarsiella sp giống mô tả Bùi Quang Tề (2006), vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, oxydase âm tính, catalase dương tính, cho phản ứng lên men môi trường O/F glucose  Tiến hành định danh 10 chủng chọn 4.2 Kiểm tra kết kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella sp Aeromonas sp 4.2.1 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella sp Kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn Edwarsiella sp, sau 48 đĩa kháng sinh xuất vòng vơ trùng, đường kính vòng vơ trùng xác định tính nhạy vi khuẩn Đường kính vòng vơ trùng dựa vào chuẩn đường kính vòng vơ trùng theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory (CLSI) (2006): Nhạy (≥20 mm), nhạy trung bình (1519 mm), kháng (