Khảo sát sự phát sinh hình thái từmẫu cấy lớp mỏng đế tép củ tỏi lý sơn (allium sativum l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI TỪ MẪU CẤY LỚP MỎNG ĐẾ TÉP CỦ TỎI LÝ SƠN (Allium sativum L.) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Trọng Tuấn ThS Nguyễn Thị Huyền Trang Sinh viên thực MSSV: 1151110183 : Đoàn Phạm Khánh Linh Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài tơi thực hiện, số liệu thu thập kết phân tích đề tài trung thực, không chép từ nghiên cứu tác giả khác, đề tài không trùng với đề tài nghiên cứu khoa học Nội dung đề tài có tham khảo sử dụng số thông tin, tài liệu Những thông tin tham khảo khóa luận trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng liệt kê danh mục tài liệu tham khảo Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2015 Đồn Phạm Khánh Linh LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy ThS Trần Trọng Tuấn ThS Nguyễn Thị Huyền Trang tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài với tân tình hướng dẫn, bảo em suốt trình nghiên cứu Xin gửi đến chị Thuý, anh Thăng, chị Tâm, em Tuyền, em Dương anh chị cán phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Sinh học Nhiệt đới lòng biết ơn em tận tâm giúp đỡ em hoàn thành báo cáo Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường giảng dạy cung cấp cho em kiến thức quý báu suốt thời gian em theo học trường Cảm ơn người bạn thực đồ án tốt nghiệp phòng giúp đỡ mình, đặc biệt bạn Thái bạn Tiên chia sẻ khó khăn thời gian thực đồ án buồn vui sống Cảm ơn tập thể lớp 11DSH04 tạo kỷ niệm đẹp bên suốt quãng đời sinh viên ngắn ngủi Trên tất cả, xin gửi lời cảm ơn từ tận đáy lòng với kính trọng u thương sâu sắc đến ba mẹ ln ủng hộ tạo điều kiện tốt cho theo đuổi ước mơ chỗ dựa vững Cuối cùng, em xin kính chúc q thầy cơ, q quan gia đình, bạn bè ln khoẻ mạnh, hạnh phúc thành cơng Đồn Phạm Khánh Linh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Đối tƣợng mục đích nghiên cứu .2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu .3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Kết đạt đƣợc Kết cấu đề tài CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Giới thiệu chung tỏi .5 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái .7 1.2 Thành phần hóa học cơng dụng tỏi 1.2.1 Thành phần hóa học 1.3 Tình hình sản xuất tỏi giới Việt Nam .12 1.3.1 Trên giới .12 1.3.2 Tại Việt Nam 13 1.4 Giới thiệu nuôi cấy lớp mỏng tế bào .14 1.4.1 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) 14 1.4.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào 15 1.5 Giới thiệu tƣợng xuân hóa 17 1.5.1 Định nghĩa xuân hóa 17 1.5.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến tƣợng xuân hóa 17 1.5.3 Một số nghiên cứu tƣợng xuân hóa .18 i Đồ án tốt nghiệp 1.6 Giới thiệu chất điều hòa sinh trƣởng 19 1.6.2 Cytokinin 21 1.7 Tình hình nghiên cứu tỏi giới Việt Nam 22 1.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Thời gian địa điểm thực 26 2.2 Nội dung nghiên cứu .26 2.3 Vật liệu 26 2.3.1 Nguồn mẫu .26 2.3.2 Môi trƣờng .26 2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 26 2.3.4 Trang thiết bị dụng cụ 27 2.3.5 Xử lý thống kê 27 2.4 Phƣơng pháp 27 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng chế độ khử trùng tạo mẫu 27 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi .28 2.4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi .31 2.4.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi nhiệt lạnh 5C .33 2.5 Cách thu tiêu khảo sát 34 2.5.1 Tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ mẫu sống vô trùng 34 2.5.2 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo chồi tỷ lệ mẫu tạo rễ 34 2.5.3 Số lƣợng chồi trung bình, số lƣợng rễ trung bình 35 2.5.4 Giải phẫu, quan sát phát sinh hình thái 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Ảnh hƣởng chế độ khử trùng tạo mẫu 37 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 40 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 46 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý nhiệt độ lạnh 5C 51 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4 - D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2ip : 6-(3-methyl-2-butenylamino)purine B5 : Môi trƣờng Gamborg BA : Benzyladenine ĐC : Đối chứng CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật KIN : Kinetin lTCL : Long Thin Cell Layer MS : Môi trƣờng Murashige Skoog (1962) NAA : Naphthalene acetic acid SD-dome : Stem-disc dome TCL : Thin Cell Layer tTCL : Transverse Thin Cell Layer Tp.HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng tỏi Bảng 1.2 Top 10 nƣớc sản xuất tỏi lớn giới năm 2010 13 Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu……… 28 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 30 Bảng 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 32 Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý nhiệt độ lạnh 5C 34 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu 39 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 41 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 47 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA NAA két hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tỏi với nguồn mẫu nhiệt độ lạnh 5ᵒC 53 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu 39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu nhiệt độ phòng 42 Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ BA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu nhiệt độ lạnh 5C 42 Biểu đồ 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý mẫu lên phát sinh tạo mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý lên phát sinh tạo chồi từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 48 Biểu đồ 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử lý lên phát sinh tạo rễ từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 49 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái tỏi (Allium sativum) Hình 3.1 Mẫu cấy lớp mỏng đế môi trƣờng bổ sung BA 44 Hình 3.2 Mẫu cấy lớp mỏng đế môi trƣờng bổ sung NAA 50 Hình 3.3 Hình thái mẫu cấy mơi trƣờng bổ sung BA NAA kết hợp 55 Hình 3.4 Hình thái mơ sẹo mơi trƣờng bổ sung BA NAA kết hợp dƣới kính soi 56 Hình 3.5 Hình thái giải phẫu mẫu cấy tỏi sau tuần nuôi cấy 57 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Mẫu cấy lớp mỏng đế môi trƣờng bổ sung NAA a) So sánh kết phát sinh hình thái nghiệm thức thí nghiệm; b) Hình thái mơ sẹo nghiệm thức N-TL1,0; c) Mô sẹo nghiệm thức N-TL1,0; d) Chồi nghiệm thức N-TL2,0 Tƣơng tự nhƣ hình thành mơ sẹo, tƣợng xn hóa cho thấy rõ khác biệt nguồn mẫu xử lý nhiệt độ lạnh nguồn mẫu xử lý nhiệt độ phòng hình thành chồi Hiện tƣợng xn hóa góp phần làm tăng tốc độ cảm ứng mẫu cấy hình thành chồi tăng đáng kể Khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 – 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng dần thể bảng 3.3 biểu đồ 3.5 Bên cạnh có gia tăng số lƣợng chồi trực tiếp gián tiếp từ mô sẹo nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA 0,10 chồi lên đến 0,30 chồi nghiệm thức 2,0 mg/l NAA Ở nồng độ 2,0 mg/l NAA cho kết tỷ lệ mẫu chồi cao nguồn mẫu đƣợc xử lý lạnh (33,33%) gấp 1,3 lần nguồn mẫu không qua giai đoạn xử lý (26,67%) Khi nồng độ NAA tăng lên cao (2,5 mg/l – 4,0 mg/l) chất lƣợng chồi thấp, chồi còi cọc, có màu vàng đến vàng Mơi trƣờng đƣợc bổ sung NAA bên cạnh hình thành mơ sẹo, chồi rễ đƣợc hình thành Qua bảng 3.3 biểu đồ 3.6 cho thấy tỷ lệ mẫu tạo rễ cao với 26,67% mẫu tạo rễ nguồn mẫu xử lý lạnh (1,0 mg/l NAA) cao gấp 50 Đồ án tốt nghiệp 1,3 lần so với kết nghiệm thức nhiệt độ phòng Kết có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức khảo sát lại điều kiện nuôi cấy Khi tăng nồng độ NAA từ 1,5 mg/l lên 4,0 mg/l có ức chế kéo dài rễ số lƣợng rễ tạo thành dần Điều auxin – NAA nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ nhƣng cản trở tăng trƣởng rễ sơ khởi (Bùi Trang Việt, 2000) [13] Qua kết thí nghiệm cho thấy auxin nhiệt độ xử lý mẫu có ảnh hƣởng rõ rệt đến trình phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế Tùy nồng độ NAA cho kết phát sinh hình thái khác Ở nghiệm thức với mẫu cấy đƣợc xử lý nhiệt độ lạnh bổ sung 1,0 mg/l NAA cho thấy mẫu cấy cho hình thành mơ sẹo tốt với tỷ lệ mẫu tạo sẹo 53,33%, mô sẹo trắng xốp, bở có khả làm nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tạo huyền phù tế bào phơi Bên cạnh đó, mơi trƣờng đƣợc bổ sung 2,0 mg/l NAA lại cho kết tạo chồi tốt với 33,33% mẫu cấy tạo chồi 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý nhiệt độ lạnh 5C Kết hai thí nghiệm cho thấy tƣợng xuân hoá tỏi đƣợc xử lý lạnh 5C ảnh hƣởng rõ rệt lên phát sinh hình thái mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi Thí nghiệm ghi nhận BA NAA có tác động kích thích hình thành phát triển chồi, mô sẹo rễ từ mẫu cấy Từ nhận định tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế với nguồn mẫu đƣợc xử lý nhiệt độ lạnh 5C Kết thu nhận đƣợc ghi nhận bảng 3.4 51 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA NAA kết hợp lên phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu nhiệt độ lạnh 5C Nghiệm thức ĐC BN05-1 BN05-2 BN05-3 BN05-4 BN05-5 BN05-6 BN05-7 BN05-8 BN10-1 BN10-2 BN10-3 BN10-4 BN10-5 BN10-6 BN10-7 BN10-8 BN15-1 BN15-2 BN15-3 BN15-4 BN15-5 BN15-6 BN15-7 BN15-8 BN20-1 BN20-2 BN20-3 BN20-4 BN20-5 BN20-6 BN20-7 BN20-8 BN25-1 BN25-2 BN25-3 Nồng độ (mg/l) BA NAA 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 1,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 1,5 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 2,5 1,0 1,5 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 0g 6,67fg 26,67cd 53,33a 33,33bc 20,00de 6,67fg 6,67fg 3,33fg 13,33ef 20,00de 26,67cd 20,00de 20,00de 13,33ef 13,33ef 6,67fg 6,67fg 6,67fg 13,33ef 20,00de 13,33ef 6,67fg 6,67fg 3,33fg 6,67fg 13,33ef 40,00b 33,33bc 33,33bc 26,67cd 20,00de 6,67fg 10,00efg 6,67fg 6,67fg Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) 0m 46,67ef 60,00cd 73,33ab 53,33de 40,00fg 23,33hij 23,33hij 6,67lnm 66,67bc 80,00a 73,33ab 53,33de 33,33gh 26,67hi 23,33hij 20,00ijk 6,67lnm 26,67hi 40,00fg 46,67ef 40,00fg 26,67hi 26,67hi 23,33hij 26,67hi 26,67hi 33,33gh 33,33gh 40,00fg 33,33gh 23,33hij 13,33j-n 10,00k-m 13,33j-n 13,33j-n 52 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) 0f 13,33de 13,33de 33,33ab 13,33de 13,33de 6,67ef 0f 0f 0f 40,00a 26,67bc 26,67bc 20,00cd 6,67ef 0f 0f 0f 6,67ef 20,00cd 23,33c 13,33de 6,67ef 0f 0f 0f 6,67ef 13,33de 26,67bc 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f Số chồi trung bình 0q 0,57ef 0,70cd 0,83b 0,60de 0,30h-k 0,23j-m 0,20k-n 0,07opq 0,73bc 0,97a 0,77bc 0,60de 0,40ghi 0,30h-k 0,20k-n 0,20k-n 0,07opq 0,30h-k 0,47fg 0,57ef 0,37g-j 0,30h-k 0,27i-l 0,20k-n 0,27i-l 0,30h-k 0,40ghi 0,33g-j 0,40ghi 0,33g-j 0,20k-n 0,13m-p 0,13m-p 0,13m-p 0,13m-p Số rễ trung bình 0j 0,13hi 0,13hi 0,43a 0,17gh 0,13hi 0,07ij 0j 0j 0j 0,40ab 0,37abc 0,30cde 0,20fgh 0,07ij 0j 0j 0j 0,07ij 0,23efg 0,33bcd 0,13hi 0,07ij 0j 0j 0j 0,07ij 0,17gh 0,27def 0j 0j 0j 0j 0,03j 0j 0j Đồ án tốt nghiệp BN25-4 BN25-5 BN25-6 BN25-7 BN25-8 BN30-1 BN30-2 BN30-3 BN30-4 BN30-5 BN30-6 BN30-7 BN30-8 BN35-1 BN35-2 BN35-3 BN35-4 BN35-5 BN35-6 BN35-7 BN35-8 BN40-1 BN40-2 BN40-3 BN40-4 BN40-5 BN40-6 BN40-7 BN40-8 3,0 3,5 4,0 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 6,67fg 6,67fg 3,33fg 3,33fg 3,33fg 10,00efg 6,67fg 3,33fg 3,33fg 0g 0g 0g 0g 3,33fg 3,33fg 3,33fg 3,33fg 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 3,33fg 3,33fg 0g 0g 0g 13,33j-n 10,00k-m 6,67lnm 6,67lnm 6,67lnm 33,33gh 23,33hij 16,67i-l 13,33j-n 13,33j-n 13,33j-n 6,67lnm 3,33nm 23,33hij 23,33hij 16,67i-l 13,33j-n 6,67lnm 6,67lnm 3,33nm 3,33nm 10,00k-m 16,67i-l 13,33j-n 10,00k-m 6,67lnm 6,67lnm 6,67lnm 0m 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0,13m-p 0,10n-q 0,07opq 0,07opq 0,07opq 0,43gh 0,27i-l 0,17l-o 0,13m-p 0,13m-p 0,13m-p 0,07opq 0,03pq 0,27i-l 0,20k-n 0,17l-o 0,13m-p 0,07opq 0,07opq 0,03pq 0,03pq 0,10n-q 0,17l-o 0,13m-p 0,10n-q 0,07opq 0,07opq 0,07opq 0q 0j 0j 0j 0j 0j 0,03j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j 0j Các chữ a, b, c,… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 phép thử CRD Qua bảng 3.4 cho thấy kết hợp BA (0,5 – 4,0) NAA (0,5 – 4,0) cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao so với nghiệm thức thí nghiệm bổ sung BA, NAA riêng lẻ Tuy nhiên nghiệm thức có nồng độ BA NAA kết hợp cao (3,0 – 4,0 mg/l) khơng có hình thành mơ sẹo Các nghiệm thức có tỷ lệ auxin/cytokinin khoảng – lần có tỷ lệ tạo sẹo cao Khi so sánh hệ nghiệm thức có nồng độ BA khác thấy BA nồng độ 0,5 mg/l kết hợp NAA cho kết tốt nghiệm thức có NAA tƣơng ứng nồng độ BA cao 53 Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt giá trị cao nồng độ 0,5 mg/l BA kết hợp NAA khoảng 1,0 – 2,5 mg/l đạt cao nghiệm thức BN05-3 có thành phần CĐHSTTV 0,5 mg/l BA 1,5 mg/l NAA với 53,33% mẫu tạo sẹo Hình thái mơ sẹo có màu trắng xốp, đơi có màu xanh Trong thí nghiệm này, thời gian đầu sau ngày nuôi cấy, cho thấy có tƣợng hóa trắng sữa vàng; nhƣng sau tuần, bắt đầu có hình thành mơ sẹo vị trí vết thƣơng Do tác động CĐHSTTV mơ sẹo bắt đầu hình thành từ vị trí vết thƣơng, sau tế bào mô sẹo phát triển mạnh tạo thành khối Theo Nguyễn Thị Quý Cơ cộng (2014) mô thực vật bị tổn thƣơng ln có khuynh hƣớng làm lành vết thƣơng cách phản phân hóa tế bào để phân chia tạo tế bào khác che lấp vùng bị tổn thƣơng [2] Sau tuần nuôi cấy, khối mơ sẹo phát triển mạnh, xốp có màu trắng ngà vàng, xốp, tế bào có dạng cụm tròn, rời rạc nên có khả tái sinh cao (Hình 3.4) Tuy nhiên nồng độ BA NAA tăng tỷ lệ tạo mơ sẹo giảm Đồng thời, khối mô sẹo mềm, mọng nƣớc, màu trắng đục, tế bào trơn láng, khơng hình thành cụm Khoảng nồng độ BA (2,5 – 4,0 mg/l) kết hợp NAA nồng độ khác cho tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo giảm, mơ sẹo có kích thích nhỏ dần, có màu xanh vàng cứng Có thể nồng độ BA NAA tăng dẫn đến mẫu cấy bị ức chế Nhận định phù hợp với (Bùi Trang Việt, 2000) cho thấy việc cảm ứng tạo mơ sẹo thƣờng đòi hỏi kết hợp auxin cytokinin [13] Sự kết hợp auxin cytokinin môi trƣờng nuôi cấy với tỷ lệ định ảnh hƣởng đến trình tạo sẹo (Letham, 1974; Akiyashi cộng sự.,1983) [29], [15] Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy môi trƣờng bổ sung BA, NAA nồng độ khác đƣợc giải phẫu quan sát mẫu giải phẫu cắt ngang kính hiển vi Quan sát giải phẫu nhận thấy có phân chia mạnh tế bào nhu mô vị trí vết thƣơng Các tế bào tiếp tục phân chia lộn xộn tạo thành khối mơ sẹo (Hình 3.5) 54 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Hình thái mẫu cấy môi trƣờng bổ sung BA NAA kết hợp a) Chồi nghiệm thức BN10-2; b) Chồi nghiệm thức BN10-3; c) Rễ nghiệm thức BN10-2 Nhƣ vậy, mẫu cấy mơi trƣờng có diện đồng thời auxin cytokinin giúp cho tế bào nhu mô vùng vết thƣơng phân chia để hình thành khối mơ sẹo Bên cạnh phát sinh hình thái tạo mơ sẹo kết hợp BA với NAA cho thấy có hình thành chồi tất nghiệm thức Tỷ lệ mẫu tạo chồi kết hợp cho kết cao so với bổ sung BA, NAA riêng lẻ Hệ nghiệm thức BA 1,0 mg/l kết hợp NAA cho kết tốt so với hệ nghiệm thức lại Môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l BA 1,0 mg/l NAA sau tuần nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi trung bình cao so với nghiệm thức khác khảo sát báo cáo 55 Đồ án tốt nghiệp (80,00% mẫu tạo chồi 0,97 chồi/mẫu) Từ mẫu cấy ban đầu có kích thƣớc nhỏ mỏng sau tuần ni cấy mẫu cấy có kích thƣớc gia tăng đáng kể, chồi dài, xanh, khỏe (Hình 3.3.a) Một số mẫu có hình thành mơ sẹo với tỷ lệ thấp (20,00%) rễ phát triển tốt Khi nồng độ BA bổ sung cao 2,0 mg/l kết hợp NAA (0,5 – 4,0 mg/l) lại làm giảm tỷ lệ mẫu tạo chồi giảm số lƣợng chồi trung bình Những chồi hình thành nghiệm thức có BA nồng độ cao 3,0 mg/l sau tuần thứ trở nên vàng, dần sắc tố xanh, chồi phát triển (Hình 3.3.b) Hình 3.4 Hình thái mơ sẹo môi trƣờng bổ sung BA NAA kết hợp dƣới kính soi a,b) Mơ sẹo nghiệm thức BN05-3; c) Mô sẹo nghiệm thức BN15-2 56 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Hình thái giải phẫu mẫu cấy tỏi sau tuần ni cấy Auxin nhóm chất có ý nghĩa quan trọng hình thành rễ thực vật Trong nhóm chất NAA loại auxin nhân tạo phổ biến đƣợc ứng dụng nhiều đối tƣợng nghiên cứu nhằm mục đích tạo rễ tạo sẹo Ở nồng độ cao NAA kích thích tạo rễ nhƣng lại ức chế kéo dài sơ khỏi rễ Sự kéo dài rễ cần không cần diện auxin nồng độ thấp Ở thí nghiệm này, nghiệm thức có nồng độ BA dƣới 2,0 mg/l NAA dƣới 3,0 mg/l có hình thành rễ với tỷ lệ khác theo nghiệm thức Trong nghiệm thức có nồng độ auxin cytokinin tƣơng đƣơng có tỷ lệ tạo rễ cao nghiệm thức lại Đặc biệt mơi trƣờng bổ sung mg/l BA NAA có tỷ lệ mẫu tạo rễ cao 40,00% (Hình 3.3.c) Với nồng độ BA 2,0 mg/l khơng có hình 57 Đồ án tốt nghiệp thành rễ tất nghiệm thức Mơi trƣờng có nồng độ NAA từ 3,5 mg/l khơng có hình thành rễ kết hợp với BA khoảng nồng độ khảo sát Theo Nguyễn Thị Quỳnh cộng (2013) auxin cảm ứng mẫu cấy tạo mơ sẹo hình thành sơ khởi rễ phối hợp với cytokinin theo tỷ lệ thích hợp Vì mà với mơi trƣờng có kết hợp BA NAA không giúp gia tăng tỷ lệ tạo chồi mà giúp tăng tỷ lệ tạo sẹo tạo rễ nồng độ thích hợp [7] Gaspar cộng (1996) cho việc bổ sung cytokinin gây ức chế số hoạt tích auxin Đây lý giải thích nghiệm thức có thành phần BA từ 2,0 đến 4,0 mg/l hầu nhƣ khơng có hình thành rễ tất nghiệm thức bổ sung NAA nồng độ khác [23] Ngồi ra, q trình theo dõi sinh trƣởng mẫu cấy nhận thấy, nghiệm thức BA 1,5 mg/l kết hợp với NAA 1,0 mg/l có xuất phơi Các phơi hình thành trực tiếp từ mơ sẹo (Hình 3.4.c) Tuy nhiên tƣợng không xảy đồng với tất mẫu cấy nghiệm thức Song tham khảo cho việc khảo sát mơi trƣờng thích hợp cảm ứng tạo phơi đối tƣợng củ tỏi Nhƣ sử dụng kết hợp BA NAA để cảm ứng phát sinh hình thái mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi đƣợc xử lý lạnh 5C tuần trƣớc thí nghiệm cho thấy hiệu cảm ứng tốt so với nghiệm thức bổ sung riêng lẻ chất Nghiệm thức có 0,5 mg/l BA 1,5 mg/l NAA cho tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo đạt cao (53,33%) Các tiêu theo dõi lại đầu đạt giá trị cao nghiệm thức bổ sung 1,0 mg/l BA 1,0 mg/l NAA 58 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình thực đề tài, chúng tơi rút số kết luận: ‒ Thời gian khử trùng thích hợp mẫu cấy tép tỏi Lý Sơn 10 phút dung dịch khử trùng HgCl2 0,1% ‒ Nguồn mẫu đƣợc xử lý lạnh 5C tuần trƣớc sử dụng làm mẫu cấy có đáp ứng tốt với chất cảm ứng so với mẫu cấy không đƣợc xử lý nhiệt ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l BA cảm ứng hiệu tạo sẹo, tạo chồi tạo rễ ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l NAA cảm ứng tạo sẹo hiệu với tỷ lệ 53,33% 26,67% mẫu tạo rễ, NAA nồng độ 2,0 mg/l cảm ứng tạo chồi tốt sử dụng riêng lẻ (33,33%) mẫu cấy đƣợc xử lý nhiệt ‒ BA NAA kết hợp giúp gia tăng khả cảm ứng phát sinh hình thái mẫu cấy đƣợc xử lý lạnh ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp 1,5 mg/l NAA có tỷ lệ tạo sẹo cao 53,33% ‒ BA kết hợp NAA 1,0 mg/l cảm ứng mẫu cấy phát sinh hình thái đạt kết cao tiêu tỷ lệ tạo chồi (80,00%), tỷ lệ tạo rễ (40,00%), số chồi trung bình (0,97 chồi) số rễ trung bình (0,4 rễ) 4.2 Kiến nghị Sau trình thực đề tài, chúng tơi đƣa số kiến nghị: ‒ Khảo sát ảnh hƣởng loại CĐHSTTV khác bổ sung riêng lẻ kết hợp đến phát sinh hình thái mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ‒ Khảo sát phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác tỏi ‒ Khảo sát ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến phát sinh hình thái mẫu cấy 59 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc [1] Phạm Thị Cậy (1994) Nghiên cứu ảnh hưởng xử lý nhiệt độ thấp GA3 đến sinh trưởng phát triển số họ hành tỏi Liliaceae, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Nghiệp I, Hà Nội [2] Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hải Sơn (2014) Q trình phát sinh hình thái mơ sẹo chồi long não (cinnamomum camphora ( L.) sieb.) ni cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, 12 (7), 1034 - 1041 [3] Dƣơng Tấn Nhựt (2011) Hệ thống nuôi cấy tế bào nghiên cứu tái sinh vi nhân giống thực vật Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu ứng dụng Tập 1, Nông nghiệp, Tp HCM, 105 – 106 [4] Nguyễn Đức Lƣợng Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) Công nghệ tế bào, Đại Học Quốc Gia , TP Hồ Chí Minh [5] Đỗ Ngọc Thanh Mai, Phạm Thị Ngọc Tú, Phạm Thị Phƣơng Thảo, Tô thị Nhã Trầm, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Văn Cƣơng, Hoàng Xuân Chiến, Dƣơng Tân Nhựt (2015) Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phơi vơ tính hình thành từ ni cấy chóp rễ invitro tỏi ta (Allium sativum L.), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13 (2A), 493 – 499 [6] Nguyễn Thị Thanh Phƣơng, Nguyễn Thị Lý Anh (2012) Nghiên cứu làm virus cho tỏi ta (Allium sativum L.) ni cấy Meristem, Tạp chí Khoa học Phát triển, 10 (2), 244 – 255 [7] Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thƣ (2013) Sự hình thành tăng trưởng rễ bất định từ nuôi cấy in vitro đương quy nhật (Angelica Acutiloba Kitagawa), Tạp chí sinh học , 35 (3E), 165 – 173 60 Đồ án tốt nghiệp [8] Vũ Quang Sáng (1988) Nghiên cứu ảnh hưởng xử lý lạnh đến suất tỏi, Tạp chí KHKT quản lý kinh tế [9] Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, Nơng nghiệp, Hà Nội [10].Hồng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Kim Thanh (1991) Nghiên cứu hiệu nhiệt độ thấp trình bảo quản đến sinh trưởng, phát triển hình thành suất Khoai Tây, Kết nghiên cứu khoa học trƣờng Đại học Nông nghiệp I 1986 – 1991, Nông Nghiệp, 43 – 46 [11].Nguyễn Quang Thạch, Mai Thị Tân, Hoàng Minh Tấn (1986) Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thấp lên mạ xn IR8, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu KHKT nông nghiệp, Nông nghiệp, Hà Nội [12] Bùi Thị Thơ, Võ Châu Tuấn, Đoàn Thị Hạnh (2014) Nghiên cứu khả tạo callus tái sinh in vitro tỏi cô đơn (Allium sativum L.) đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, Hội thảo khoa học cán trẻ trƣờng Đại học Sƣ phạm toàn quốc, 4, 604 – 612 [13] Bùi Trang Việt (2000) Đại cƣơng, Phần I: Dinh dƣỡng, Sinh lý thực vật đại cương, Đại học Quốc gia Tp HCM, Hồ Chí Minh [14] Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005) Tính chống chịu sinh lý thực vật với điều kiện ngoại cảnh bất thuận, Giáo trình sinh lý thực vật, Hà Nội, Hà Nội, 245 – 248 Tài liệu nƣớc [15] Akiyashi D.E, Morris R.O, Hinz R., Mischke B.S., Kosuge T., Garfinket D.J., Gordon M.P., Nester W (1983) Cytokinin/auxin balance in crown gall tumors is regulated by specific loci in the T-DNA, Proc Natl Acad Sci USA, 80, 407 – 411 61 Đồ án tốt nghiệp [16] Alejandrina Robledo-Paz, Víctor M Villalobos-Arámbula, Alba E JofreGarfias (2000) Efficient plant regeneration of garlic (Allium sativum L.) by root-tip culture, Cell Dev Biol – Plant, 36, 416 – 419 [17] Ayabe M., Sumi S (1998) Establishment of a novel tissue culture method, stem-disc culture, and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Reports, 17 (10), 773 – 779 [18] Ayabe M., Sumi S (2001) A novel and efficient tissue culture method – “stem-disc dome culture” – for producing virus-free garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep (2001) (20), 503–507 [19].Cavallito Chester J., John Hays Bailey (1944) Allicin, the Antibacterial Principle of Allium sativum., Isolation, Physical Properties and Antibacterial Action, J Am Chem Soc., 66 (11), 1950–1951 [20] Chand, S and A K Singh (1999) In vitro propagation of Bombax ceiba L (Silkcotton), Silvae genetica ISSN 0037-5349 Conden Sigeaq, 48 (6), 313-317 [21] Fereol L., V Chovelon, S Causse, N Michaux-Ferriere, R Kahane (2002) Evidence of a somatic embryogenesis process for plant regeneration in garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep, 21, 197 – 203 [22] Gabriela F Luciani, Ana K Mary, Ceilia Pellegrini, N R Curvetto (2006) Effects of explants and growth regulators in garlic callus formation and plant regeneration, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 87(2), 139-143 [23] Gaspar T., Kevers C., Penel C., Greppin H., Reid D.M., Thrope T.A (1996) Plant hormone and plant growth regulators in plant tissue culture, In vitro Cell Dev Biol Plant, 32, 272 – 289 [24] Haque MS, Wada T, Hattori K (1997) High frequency shoot regeneration and plantlet formation from root tip of + garlic, Plant Cell Tissue Organ Cult, 50, 83–89 62 Đồ án tốt nghiệp [25] Haque MS, Wada T, Hattori K (1998) Efficient plant regeneration in Garlic through somatic embryogenesis from root tip explants, Plant Prod Sci, 1, 216222 [26] Javed, A.M., H Said and N Saima (1996) In vitro propagation of Bougainvillea spectubilis through shoot apex culture, Pak J Bot., 28, 207211 [27] Khan N., M.S Alam and U.K Nath (2004) In vitro Regeneration of Garlic Through Callus Culture, Journal of Biological Sciences, (2), 189-191 [28] Lithy S S., Lisa S F., Azam F M S., Rahman S., Noor F A., Sintaha M., Paul A K., Rahmatullah M (2011) In vitro Propagation from cotyledonary nodes of germinated seedlings of Abelmoschus moschatus, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture, 5(3), 364-370 [29] Letham D.S (1974) Regulators of cell division in plant tissue XX The cytokinins of coconut mikl, Physiol Plant, 32, 66 – 70 [30] Louis K.Mann and P.A.Minges (1958) Growth and bulbing of garlic (Allium sativum L.) in respone to storage temperature of planting stocks, day length, and planting date, Hilgardia, 27(15), 385-419 [31] Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15(3), 473-497 [32] Narayanaswamy S (1994) Plant Cell and Tissue Culture, Mc Graw-Hill Publishing Company limited, New Delhi [33] Salam M.A., M.R Ali, M.E Ali, K.A Alam and M.S.H Reza, (2008) Callus induction and regeneration of indigenous garlic (Allium sativum L.), Am J Plant Physiol., 3, 33-39 63 Đồ án tốt nghiệp [34] Sata S J., S B Bagatharia & V S Thaker (2001) Induction of direct somatic embryogenesis in garlic (Allium sativum), Methods in Cell Science, 22, 299– 304 [35] Seyyedneiad, Motamedi S.M., H (2010) A review on Native medicinal Plant in Khuzestan, Iran with Antibacterial properties, International journal of Pharmacology, 6, 551-560 [36] Koutepas (1984) Proceedings of 3rd Conference on Protected Vegetables and Flower, Heraklion Greece [37] Reinert J Bajaj YPS, Zbell B (1977) Aspects of Organization Organogenesis, Embryogenesis, Cytodifferentiation, Plant Tissue and Cell Culture, Ed Street H.E., Blachkwell, Oxford, London [38] Yamada Y., Azuma K (1977) Evaluation of the in vitro antifungalactivity of allicin, Antimicrob Agents Chemother, 11(4), 743–749 Tài liệu Internet [39] Chất kích thích sinh trƣởng thực vật Auxin http://www.zsinhhoc.com/2013/01/auxin.html [40] Gourmet garlic gardens, 5/2015 http://www.gourmetgarlicgardens.com/garlic-information.html [41] Hồ Đình Hải Rau rừng Việt Nam, 5/2015 http://hodinhhai.blogspot.com/2013/01/toi-cay-toi-ten-goi-khac-toi-ta-hovi.html [42] USDA National Nutrient Database for Standard Reference (2015) http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods [43] Wikipedia https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Hành 64 ... nhiệt độ xử l mẫu l n phát sinh hình thái từ l p cắt mỏng đế tép tỏi - Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA nhiệt độ xử l mẫu l n phát sinh hình thái từ l p cắt mỏng đế tép tỏi - Khảo sát ảnh hƣởng... nhiều loại bệnh Vì giống tỏi L Sơn ln cần đƣợc đáp ứng bảo vệ nguồn giống Với thực tiễn đó, chọn đề tài Khảo sát phát sinh hình thái từ mẫu cấy l p mỏng đế tép củ tỏi L Sơn (Allium sativum L. ) ,... HÌNH Hình 1.1 Hình thái tỏi (Allium sativum) Hình 3.1 Mẫu cấy l p mỏng đế môi trƣờng bổ sung BA 44 Hình 3.2 Mẫu cấy l p mỏng đế mơi trƣờng bổ sung NAA 50 Hình 3.3 Hình thái mẫu cấy